Análisis de anomalías inducida por β-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina por espectroscopía y microscopía electrónica de barrido

Resumen

Presentados aquí son dos métodos que pueden utilizarse individualmente o en combinación para analizar el efecto de beta-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina. Incluido es un protocolo para crear un coágulo de fibrina en vitro , y después coágulo turbidez y microscopía electrónica métodos.

Resumen

Este artículo presenta métodos para la generación de coágulos de fibrina vitro y analizar el efecto de la proteína de amiloide beta (Aβ) en estructura y formación de coágulos por espectrometría y microscopía electrónica de barrido (SEM). Aβ, que forma agregados de amiloide neurotóxicos en enfermedad de Alzheimer (EA), se ha demostrado para interactuar con el fibrinógeno. Esta interacción de Aβ-fibrinógeno hace el coágulo de fibrina estructuralmente anormales y resistentes a la fibrinólisis. Inducida por Aß anormalidades en la coagulación de fibrina también pueden contribuir a aspectos cerebrovasculares de la patología de AD como microinfartos, inflamación, así como, angiopathy amiloideo cerebral (CAA). Dado el papel potencialmente crítico de déficit neurovascular en patología AD, desarrollo de compuestos que pueden inhibir o reducir la interacción de fibrinógeno Aβ tiene valor terapéutico prometedor. In vitro métodos por que fibrina formación de coágulos puede ser fácil y sistemáticamente evaluada son herramientas potencialmente útiles para el desarrollo de compuestos terapéuticos. Presentamos es un protocolo optimizado para generación en vitro del coágulo de fibrina, así como análisis del efecto de inhibidores de la interacción de Aß y el Aβ-fibrinógeno. El análisis de turbidez de coágulo es rápido, altamente reproducible y puede utilizarse para probar condiciones múltiples simultáneamente, permitiendo la proyección de un gran número de inhibidores de la Aβ-fibrinógeno. Éxitos compuestos a partir de esta proyección pueden ser evaluados además por su capacidad para mejorar inducida por Aß anormalidades estructurales de la arquitectura del coágulo de fibrina mediante SEM. La eficacia de estos protocolos optimizados se demuestra aquí con TDI-2760, un inhibidor de interacción recientemente identificado de Aβ-fibrinógeno.

Introducción

La enfermedad de Alzheimer (AD), una enfermedad neurodegenerativa que lleva a deterioro cognitivo en pacientes ancianos, predominantemente surge de la expresión anormal beta-amiloide (Aβ), agregación y separación deteriorada, dando lugar a neurotoxicidad^{1, 2}. a pesar de la Asociación bien caracterizada entre agregados de Aß y AD³, los mecanismos precisos subyacentes a la patología de la enfermedad no son bien entendidos⁴. Creciente evidencia sugiere que déficit neurovascular desempeñan un papel en la progresión y severidad de AD⁵, Aβ interactúa directamente con los componentes del sistema circulatorio⁶. Aβ tiene una interacción de alta afinidad con el fibrinógeno^7,8, que también se localiza a los depósitos Aβ en pacientes con EA y ratón modelos^9,10,11. Además, la interacción de fibrinógeno Aβ induce la formación anormal de coágulos de fibrina y estructura, así como resistencia a la fibrinolisis^9,12. Una posibilidad terapéutica en el tratamiento de AD, es aliviar el déficit circulatorio mediante la inhibición de la interacción de Aß y fibrinógeno^13,14. Por lo tanto, identificamos varios pequeños compuestos inhiben la interacción de fibrinógeno Aβ con proyección de alto rendimiento y química medicinal enfoques^13,14. Para probar la eficacia de los inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aβ, hemos optimizado dos métodos para el análisis de en vitro la formación de coágulos de fibrina: coágulo turbidez análisis y exploración de la microscopia electrónica (SEM)¹⁴.

Análisis de turbidez de coágulo es un método sencillo y rápido para el seguimiento de la formación del coágulo de fibrina mediante espectroscopia UV-visible. Como el coágulo de fibrina se dispersa cada vez más formas, luz y aumenta la turbidez de la solución. Por el contrario, cuando Aß está presente, se altera la estructura del coágulo de fibrina, y se reduce la turbiedad de la mezcla (figura 1). El efecto de compuestos inhibitorios puede evaluarse el potencial restaurar coágulo turbidez de anormalidades inducidas por Aβ. Mientras que el análisis de turbidez permite un análisis rápido de varias condiciones, proporciona información limitada sobre el coágulo forma y estructura. SEM, en el que se revela la topografía de objetos sólidos por sonda de electrones, permite el análisis de la arquitectura 3D del coágulo^15,16,17,18 y la evaluación de cómo la presencia de Aß y compuestos inhibitorios y/o altera esa estructura^9,14. Tanto espectrometría y SEM son técnicas de laboratorio clásicas que se han utilizado para los varios propósitos, por ejemplo, espectrofotometría se utiliza para el control de la agregación amiloide^19,20. Del mismo modo, SEM también se utiliza para analizar el coágulo de fibrina formado por el plasma de la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y accidente cerebrovascular tromboembólico pacientes^21,22,23. Los protocolos aquí presentados están optimizados para evaluar la formación del coágulo de fibrina de forma rápida y reproducible.

El siguiente protocolo proporciona las instrucciones para la preparación de una en vitro -coágulo de fibrina con o sin Aβ. También detalla los métodos para analizar el efecto de Aß en la formación de coágulos de fibrina y estructura. La eficacia de estos dos métodos para medir la inhibición de la interacción de fibrinógeno Aβ se demuestra usando TDI-2760, un compuesto inhibitorio pequeño¹⁴. Estos métodos, tanto individualmente como en conjunto, permiten análisis rápido y sencillo de en vitro la formación de coágulos de fibrina.

Protocolo

1. preparación de Aβ42 y fibrinógeno para análisis

1. Preparar Aβ42 monomérica de polvo liofilizado
   1. Caliente Aβ42 en polvo a temperatura ambiente y de la vuelta abajo a 1.500 x g por 30 s.
   2. Añada 100 μl de helada hexafluoroisopropanol (HFIP) por 0,5 mg de polvo de Aβ42 e incubar durante 30 min en hielo.
      PRECAUCIÓN: Tenga cuidado al manejar HFIP y realizar todos los pasos en una campana química.
   3. Preparar 20 alícuotas μl y deje que el aire de películas secado en una campana química para películas de 2-3 h. puede almacenarse a-20 ° C.
   4. Reconstituir la película monomérica de Aβ42 en 10 μl de fresco de dimetilsulfóxido (DMSO) por agitación en un sonicador de baño durante 10 minutos a temperatura ambiente.
   5. Añadir 190 μl de 50 mM de tris (hidroximetil) aminometano (Tris) tampón (pH 7.4) y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo.
   6. Eliminar los agregados de la proteína por centrifugación a 20.817 x g a 4 ° C por 20 min.
   7. Incubar el sobrenadante a 4 ° C para pasar la noche y al día siguiente Centrifugue la solución a 20.817 x g a 4 ° C por 20 min descartar más agregados de la proteína.
   8. Medir concentración de Aβ42 bicinchoninic ensayo de ácido (BCA). Serie diluido purificada de albúmina de suero bovino (BSA) de 1 mg/mL a 0,0625 mg/mL para producir un nivel de proteínas, añadir 10 μl de cada estándar en los pocillos de una placa multi-bien por triplicado. Diluir muestras Aβ 1:4 y añadir 10 μl a los pocillos por triplicado. Soluciones BCA, A y B de la mezcla y añada 200 μl a cada pocillo. Incubar durante 30 min a 37 ° C y leer en un lector de placas a 562 nm. Guardar la solución restante de Aβ en el hielo y utilizar esta preparación para análisis de turbidez y SEM.
2. Preparar solución de fibrinógeno
   1. Mida 20 mg de polvo liofilizado de fibrinógeno en un tubo de 15 mL y volver a suspender con 2 mL de 20 mM como etano sulfónico ácido (HEPES) de tampón (pH 7.4).
   2. Incubar en un baño de agua de 37 ° C durante 10 minutos.
   3. Filtrar la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm y almacenar a 4 ° C durante 30 minutos. Retomar la solución de 4 ° C y el filtro a través del filtro de la jeringuilla de 0.1 μm para eliminar agregados de fibrinógeno o fibrina de las preexistentes.
   4. Medir la concentración de fibrinógeno ensayo BCA. Siga las instrucciones del paso 1.1.8. Guardar la solución restante de fibrinógeno a 4 ° C y utilizar esta preparación para análisis de turbidez y SEM.

2. coágulo turbidez análisis

1. A cada pocillo experimental de la placa de 96 pocillos, agregar 20 μl de solución de Aβ42 de 30 μm de paso 1.1.8 para que su concentración final es de 3,0 μm en 200 μL del tampón de. Añadir el mismo volumen de DMSO 5% en 50 mM de tampón Tris (pH 7,4) a buffer de control de pozos en la placa de 96 pocillos.
   Nota: El volumen exacto de Aβ42 en este paso no es importante. Para las preparaciones de baja concentración, puede utilizarse un volumen mayor y puede ajustarse el volumen de la solución de formación de coágulo. El volumen final debe seguir siendo 200 μl.
2. Si probando compuestos inhibitorios, diluir el compuesto a la concentración de trabajo como DMSO. Añadir compuesto o DMSO solo para un control de los pozos con Aβ42 y mezcla bien.
   Nota: Solución de Aβ42 debe formar una gotita discreta en la parte inferior del pozo, el compuesto o DMSO se debe pipetearse directamente en el centro de la gota.
3. Diluir la solución de paso 1.2.4 búfer de formación de coágulo de fibrinógeno (20 mM de tampón HEPES (pH 7.4), 5 mM CaCl₂y 137 mM NaCl) y añadir a Aβ42 pozos que contienen y el control de la placa de 96 pocillos. Ajustar el volumen de la solución de fibrinógeno para que su concentración final sea de 1.5 μm en total volumen de reacción de 200 μl. Pipetear la solución lentamente y no se formen burbujas. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 30 min agitando en una plataforma giratoria.
   Nota: El volumen de solución de fibrinógeno puede variar dependiendo de su concentración de stock, pero el volumen total en cada una debe ser 170 μl durante la incubación.
4. Preparar solución de trombina trombina comercialmente purificado polvo en ddH₂O para hacer una solución madre de 50 U/mL de disolución. Diluir a la solución de trabajo de 5 U/mL en 20 mM de tampón HEPES (pH 7.4) directamente antes de su uso.
5. Después de 30 min de incubación, al mismo tiempo Añadir 30 μl de solución de trombina (5 U/mL) en las soluciones de fibrinógeno en la placa de 96 pocillos de paso 2.3 con pipeta multicanal. Adición de la trombina inmediatamente iniciará la formación de coágulos. Por lo tanto, añadir trombina directamente en el centro de la solución de fibrinógeno con cuidado para evitar la formación de burbujas.
   Nota: La actividad de la trombina puede variar entre las condiciones experimentales, así como gran cantidad de trombina. La concentración correcta requerida para producir robusta coágulos deba determinarse empíricamente.
6. Leer la absorbancia del coágulo en vitro en un lector de placas inmediatamente después de la adición de trombina. Medir la absorbancia a 350 nm en el transcurso de 10 minutos, cada 30-60 s. realizar el ensayo completo a temperatura ambiente.
   Nota: Algunos compuestos de inhibidor pueden alterar la absorbancia de la solución a 350 nm, en que caso la turbidez se puede medir a 405 nm.

3. microscopía electrónica de barrido

1. Preparación de coágulo, fijación y lavado
   1. Lugar limpio siliconado círculo tapa portaobjetos (12 mm) en una placa bien de 12 o 24 pocillos usando fórceps.
   2. Preparación de fibrinógeno en el almacenador intermediario de la formación de coágulos. Consulte el protocolo paso 1.2 para más detalles.
   3. Para evaluar el efecto de los inhibidores de la interacción de fibrinógeno de Aß en la estructura del coágulo de fibrina, siga las instrucciones para la incubación como se describe para el ensayo de turbidez (paso 2). Siempre incluir pocillos de control que contienen fibrinógeno en ausencia de Aβ y de inhibidores.
   4. Pipetear 80 μl de la mezcla de fibrinógeno de paso 3.1.3 en las diapositivas de la cubierta. Extender suavemente la solución para que se distribuya uniformemente en la diapositiva de cubierta.
   5. Diluir la acción de la trombina (50 U/mL) en solución salina tamponada con HEPES 20 mM a una concentración final de 2,5 U/mL y agregar 20 μl directamente al centro de la solución de fibrinógeno sin mezclar.
      Nota: Si es necesario, puede utilizarse una mayor concentración de trabajo de la trombina (5 U/mL).
   6. Cubrir la placa de 12 pozos con una tapa de plástico y dejarla a temperatura ambiente durante 30-60 min.
   7. La coagulación de la reacción en marcha, preparar soluciones de deshidratación y fijación. Preparar el buffer de cacodilato de sodio (0,1 M, pH 7.4). Diluir la solución madre de glutaraldehído al 10% en buffer de cacodilato de sodio (0,1 M, pH 7.4) para hacer una solución de glutaraldehído del 2%. Mantener todas estas soluciones en el hielo. Debe utilizarse recién diluido glutaraldehído (2%) dentro de 1 semana, cuando se almacena correctamente en un refrigerador a 4 ° C.
   8. Diluir etanol absoluto (100%) en agua bidestilada (etanol 80%, 50% y 20%). Mantenga las soluciones de etanol y etanol absoluto (100%) sobre el hielo.
      PRECAUCIÓN: tenga cuidado al manejar el cacodilato de sodio y glutaraldehído, realice estos pasos en una campana química.
   9. Después de 30 minutos, lave suavemente los coágulos con buffer de cacodilato de sodio helada (0,1 M) dos veces. Añadir 2 mL de la solución a cada pocillo que el coágulo está totalmente sumergido. Cubra la placa bien con una tapa y dejar reposar 2 min a temperatura ambiente. Después de 2 minutos, retire con cuidado el búfer utilizando una pipeta de 1 mL o pipeta de tallo estrecho. Repetir una vez.
   10. Fijar los coágulos con helada glutaraldehido (2%). Mantener la placa bien en el hielo, añadir unos 2-3 mL de glutaraldehído al 2% a cada pocillo. Asegúrese de que los coágulos son completamente sumergidos. Tapar y dejar la placa en el hielo durante 30 minutos.
   11. Después de 30 min, suavemente Quite el glutaraldehído de cada bien y lavar los coágulos con buffer de cacodilato de sodio (0,1 M) como se describe anteriormente (2 minutos, dos veces). Mantenga la placa bien en el hielo.
2. Deshidratación serie de coágulo y el secado de punto crítico
   1. Deshidratar los coágulos en una serie gradual de etanol helada lavados preparados en el paso 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% y again100%) durante 5 minutos. Para cada serie de etanol, agregue 2-3 mL, asegurándose de que los coágulos son sumergidos. Cubrir e incubar en hielo.
   2. Después de cada paso del etanol, retirar la solución de etanol con una pipeta de 1 mL o gotero pipeta desechable. No retire completamente el etanol. Asegúrese de que la superficie del coágulo no se expone al aire.
      Nota: Deshidratación en etanol absoluto (100%) debe realizarse dos veces.
   3. Manteniendo la muestra sumergida en etanol 100% final, transferir a un secador de punto crítico (CPD). Utilice un portamuestras CPD o un titular de tapa deslizante con una arandela para la transferencia de las diapositivas en la cámara CPD. Coloque al menos una arandela entre cada diapositiva.
   4. Sacar la corredera de cubierta de la sala CPD y montarlo en un trozo de SEM con cinta de carbón.
3. Farfulle la capa y la proyección de imagen
   1. Transferir todas las muestras con trozo de SEM a la cámara de recubrimiento sputter.
   2. Farfulle la capa menos de 20 nm de oro/paladio o de otros materiales conductores, tales como carbón, usando un recubridor sputter vacío.
      Nota: Hemos utilizado 18 nm de la capa de oro/paladio. El recubrimiento sputter se realizó 45 s y la velocidad de la capa fue de 4 Å / s. Farfullar revestido muestras son estables cuando se mantiene correctamente en un ambiente seco a temperatura ambiente durante semanas. Análisis de SEM se pueden realizar en cualquier momento.
   3. Adquisición de imágenes en un microscopio equipado con el detector de SE2 a 4 kV.
      Nota: El tamaño de píxel de la imagen en esta imagen la Coloque de 13 nm-31 nm.

Resultados

En el en vitro la coagulación prueba (turbidez), la trombina enzima hiende fibrinógeno, dando por resultado la formación de la fibrina red²⁴. Esta formación de coágulo de fibrina causa dispersión de la luz que pasa a través de la solución, dando por resultado mayor turbidez (figura 1), estancamiento antes de finalizar el período de lectura (figura 2, verde). Cuando el fibrinógeno se incu...

Discusión

Los métodos descritos aquí proporcionan un medio rápido y reproducible de evaluación fibrina coágulo formación en vitro. Además, la simplicidad del sistema hace que la interpretación de cómo Aß afecta la formación de coágulos de fibrina y la estructura relativamente sencilla. En publicación anterior de este laboratorio, se comprobó que estos ensayos pueden utilizarse para probar compuestos por su capacidad para inhibir la interacción de fibrinógeno Aβ^13,

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma	EMD Millipore	341578	keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture
Beta-Amyloid (1-42), Human	Anaspec	AS-20276
Thrombin from human plasma	Sigma-Aldrich	T7009
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%	Sigma-Aldrich	105228
DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED	Sigma-Aldrich	D2438
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Tris Base	Fischer Scientific	BP152
HEPES	Fischer Scientific	BP310
NaCl	Fischer Scientific	S271
CaCl2	Fischer Scientific	C70
Filter Syringe, 0.2µM, 25mm	Pall	4612
Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.	Millipore	SLVV033RS
Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom	Fischer Scientific	21377203
Spectramax Plus384	Molecular Devices	89212-396
Centrifuge, 5417R	Eppendorf	5417R
Branson 200 Ultrasonic Cleaner	Fischer Scientific	15-337-22
Lab Rotator	Thermo Scientific	2314-1CEQ
Spare washers for cover slip holder	Tousimis	8766-01
Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet	Electron Microscopy Sciences (EMS)	70967-13
Sample holder for CPD (Cover slip holder)	Tousimis	8766
Mount Holder Box, Pin Type	Electron Microscopy Sciences (EMS)	76610
Round glass cover slides (12 mm)	Hampton Research	HR3-277
10% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences (EMS)	16120
Ethanol	Decon Labs	11652
24 well plate	Falcon	3047
Na Cacodylate	Electron Microscopy Sciences (EMS)	11652
SEM Stubs, Tapered end pin.	Electron Microscopy Sciences (EMS)	75192
PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD	Ted Pella	16084-1
Autosamdri-815 Critical Point Dryer	Tousimis
Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target	Denton Vacuum
Leo 1550 FE-SEM	Carl Zeiss
Smart SEM Software	Carl Zeiss