Analisi delle anomalie indotta da β-amiloide sulla struttura di coagulo di fibrina di spettroscopia e microscopia elettronica a scansione

Riepilogo

Presentato qui sono due metodi che possono essere utilizzati singolarmente o in combinazione per analizzare l'effetto di beta-amiloide sulla struttura del coagulo di fibrina. È incluso un protocollo per creazione di coagulo di fibrina in vitro , seguita da coagulo torbidità e microscopia elettronica di esame metodi.

Abstract

Questo articolo presenta metodi per la generazione in vitro coaguli di fibrina e analizzando l'effetto di proteina beta-amiloide (Aβ) sulla struttura e la formazione del coagulo mediante spettrometria e microscopia elettronica (SEM). Aβ, che forma aggregati amiloidi neurotossici nel morbo di Alzheimer (annuncio), ha dimostrato di interagire con il fibrinogeno. Questa interazione di Aβ-fibrinogeno rende il coagulo di fibrina strutturalmente anormale e resistente alla fibrinolisi. Indotta da Aβ anomalie nella coagulazione di fibrina possono anche contribuire a cerebrovascolari aspetti della patologia AD come microinfarti, infiammazione, come pure, Angiopatia amiloide cerebrale (CAA). Dato il ruolo potenzialmente critico dei deficit neurovascolari in patologia di annuncio, lo sviluppo di composti che possono inibire o ridurre l'interazione di Aβ-fibrinogeno ha valore terapeutico promettente. Metodi in vitro dai quali fibrina formazione del coagulo può essere facilmente e sistematicamente valutata sono strumenti potenzialmente utili per lo sviluppo di composti terapeutici. Presentato qui è un protocollo ottimizzato per la generazione in vitro di coagulo di fibrina, nonché l'analisi dell'effetto di inibitori di interazione di Aβ e Aβ-fibrinogeno. Il dosaggio di torbidità di coagulo è rapida, altamente riproducibile e può essere utilizzato per verificare più condizioni contemporaneamente, consentendo per lo screening di un gran numero di inibitori di Aβ-fibrinogeno. Hit composti da questo screening possono essere ulteriormente valutati per la loro capacità di migliorare le anomalie strutturali Aβ-indotta dell'architettura del coagulo di fibrina utilizzando SEM L'efficacia di questi protocolli ottimizzati è dimostrata qui utilizzando TDI-2760, un inibitore di interazione di Aβ-fibrinogeno recentemente identificato.

Introduzione

Morbo di Alzheimer (annuncio), una malattia neurodegenerativa che porta al declino cognitivo nei pazienti anziani, prevalentemente nasce dall'espressione anormale di beta-amiloide (Aβ), aggregazione e alterata clearance conseguente neurotossicità^{1, 2}. nonostante l'associazione ben caratterizzato tra Aβ aggregati e AD³, i precisi meccanismi che sono alla base della patologia di malattia non sono ben compreso⁴. La prova aumentante suggerisce che i deficit neurovascolari svolgono un ruolo nella progressione e nella severità di annuncio⁵, come Aβ interagisce direttamente con i componenti del sistema circolatorio⁶. Aβ ha un'interazione ad alta affinità con fibrinogeno^7,8, che si localizza anche depositi Aβ in entrambi i pazienti dell'annuncio e del mouse modelli^9,10,11. Inoltre, l'interazione di Aβ-fibrinogeno induce la formazione del coagulo di fibrina anormale e struttura, nonché resistenza alla fibrinolisi^9,12. Una possibilità terapeutica nel trattamento dell'annuncio, è alleviare i deficit circolatori inibendo l'interazione tra Aβ e fibrinogeno^13,14. Abbiamo, pertanto, identificato parecchi piccoli composti inibendo l'interazione di Aβ-fibrinogeno mediante screening su vasta scala e chimica farmaceutica approcci^13,14. Per testare l'efficacia degli inibitori di interazione di Aβ-fibrinogeno, abbiamo ottimizzato i due metodi per l'analisi di in vitro formazione di coaguli di fibrina: clot dosaggio di torbidità e scansione microscopia elettronica (SEM)¹⁴.

Coagulo torbidità analisi è un metodo semplice e rapido per il monitoraggio di formazione del coagulo di fibrina mediante spettroscopia UV-visibile. Come il coagulo di fibrina forme, luce è sempre più sparsi e la torbidità della soluzione aumenta. Al contrario, quando Aβ è presente, la struttura del coagulo di fibrina è alterata, e la torbidità della miscela è ridotta (Figura 1). L'effetto di composti inibitori può essere valutato per il potenziale ripristinare coagulo torbidità da anomalie di Aβ-indotta. Mentre il dosaggio di torbidità consente per l'analisi rapida di più condizioni, fornisce informazioni limitate sul coagulo forma e struttura. SEM, in cui la topografia di oggetti solidi è rivelata dalla sonda dell'elettrone, permette l'analisi dell'architettura 3D del coagulo^15,16,17,18 e la valutazione di come la presenza di Aβ e / o inibitorio composti altera quello struttura^9,14. Sia spettrometria e SEM sono tecniche di laboratorio classica che sono state utilizzate per vari scopi, ad esempio, spettrofotometria viene utilizzata per il monitoraggio di aggregazione amiloide^19,20. Allo stesso modo, SEM è utilizzato anche per analizzare il coagulo di fibrina formata dal plasma del morbo di Alzheimer, di Parkinson e il colpo thromboembolic pazienti^21,22,23. I protocolli presentati qui sono ottimizzati per la valutazione della formazione del coagulo di fibrina in modo rapido e riproducibile.

Il seguente protocollo fornisce le istruzioni per la preparazione di un in vitro -coagulo di fibrina sia con che senza Aβ. Inoltre in dettaglio i metodi per analizzare l'effetto di Aβ sulla formazione del coagulo di fibrina e struttura. L'efficacia di questi due metodi per misurare l'inibizione dell'interazione Aβ-fibrinogeno è dimostrata utilizzando TDI-2760, un piccolo composto inibitorio¹⁴. Questi metodi, sia individualmente che insieme, consentono analisi rapida e semplice di in vitro formazione di coaguli di fibrina.

Protocollo

1. preparazione di Aβ42 e fibrinogeno per analisi

1. Preparare monomerico Aβ42 da polvere liofilizzata
   1. Caldo Aβ42 polvere a temperatura ambiente e spin giù a 1.500 x g per 30 s.
   2. Aggiungere 100 µ l di hexafluoroisopropanol ghiacciata (HFIP) per 0,5 mg di polvere di Aβ42 ed incubare per 30 min in ghiaccio.
      Attenzione: Prestare attenzione quando si maneggia HFIP ed eseguire tutti i passaggi in una cappa chimica.
   3. Preparare 20 µ l aliquote e lasciare che l'aria di film secco in una cappa chimica per 2-3 h. film possa essere conservato a-20 ° C.
   4. Ricostituire film monomerico Aβ42 in 10 µ l di fresco dimetilsolfossido (DMSO) agitazione in un sonicatore bagno per 10 min a temperatura ambiente.
   5. Aggiungere 190 µ l di tampone di 50 mM tris (idrossimetil) amminometano (Tris) (pH 7,4) e pipettare su e giù delicatamente.
   6. Rimuovere gli aggregati di proteine mediante centrifugazione a 20.817 x g a 4 ° C per 20 min.
   7. Incubare il supernatante a 4 ° C per una notte e giorno successivo Centrifugare la soluzione a 20.817 x g a 4 ° C per 20 min a scartare qualsiasi ulteriore aggregati proteici.
   8. Misurare la concentrazione di Aβ42 dall'analisi di bicinconinico acido (BCA). Seriale diluito purificato albumina di siero bovino (BSA) da 1 mg/mL a 0,0625 mg/mL per produrre un proteina standard, aggiungere 10 µ l di ogni standard dei pozzetti di una piastra multi-pozzetto in triplice copia. Diluire i campioni Aβ 1:4 e aggiungere 10 µ l dei pozzetti in triplice copia. Mescolare BCA soluzioni A e B e aggiungere 200 µ l a ciascun pozzetto. Incubare a 37 ° C per 30 minuti e leggere su un lettore di piastre a 562 nm. Tenere la soluzione rimanente di Aβ sul ghiaccio e usare questa preparazione per analisi di torbidità e SEM.
2. Preparare la soluzione di fibrinogeno
   1. Misura 20 mg di polvere liofilizzata fibrinogeno in una provetta da 15 mL e risospendere con pre-riscaldato 2 mL di tampone di 20 mM hydroxyethylpiperazine etano acido solfonico (HEPES) (pH 7,4).
   2. Incubare a bagnomaria a 37 ° C per 10 min.
   3. Filtrare la soluzione attraverso un filtro per siringa 0,2 µm e conservare a 4 ° C per 30 min. Adottare la soluzione dal 4 ° C e filtrare nuovamente attraverso 0,1 µm siringa filtro per rimuovere aggregati di fibrinogeno o pre-esistente della fibrina.
   4. Misurare la concentrazione di fibrinogeno dall'analisi di BCA. Seguire le istruzioni dal punto 1.1.8. Tenere la soluzione di fibrinogeno rimanente a 4 ° C e usare questa preparazione per analisi di torbidità e SEM.

2. coagulo torbidità Assay

1. A ciascun pozzetto sperimentale della piastra 96 pozzetti, aggiungere 20 µ l di soluzione di Aβ42 30 µM dal passaggio 1.1.8 affinché la sua concentrazione finale è 3,0 µM a 200 µ l di buffer. Aggiungere lo stesso volume di 5% DMSO in tampone Tris 50 mM (pH 7.4) per pozzetti di controllo della piastra a 96 pozzetti del buffer.
   Nota: L'esatto volume di Aβ42 in questa fase non è importante. Per le preparazioni di bassa concentrazione, un aumento del volume può essere utilizzato, e può essere regolato il volume di tampone di formazione del coagulo. Il volume finale deve rimanere 200 µ l.
2. Se il test composti inibitori, diluire il composto per la concentrazione di lavoro come DMSO. Aggiungere il composto o DMSO da solo per un controllo dei pozzetti con Aβ42 e mescolare bene.
   Nota: Soluzione di Aβ42 dovrebbe formare una gocciolina discreta nella parte inferiore del pozzo, il composto o DMSO dovrebbe essere dispensato direttamente nel centro della goccia.
3. Diluire la soluzione madre di fibrinogeno dal punto 1.2.4 nel buffer di formazione del coagulo (tampone di 20 mM HEPES (pH 7.4), 5 mM CaCl₂e 137 mM NaCl) e aggiungerlo al Aβ42 contenente e controllo pozzetti della piastra 96 pozzetti. Regolare il volume della soluzione di fibrinogeno in modo che la sua concentrazione finale diventa 1,5 µM in totale 200 µ l di reazione. Pipettare lentamente la soluzione ed evitare la formazione di bollicine. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 min agitazione su una piattaforma rotante.
   Nota: Il volume della soluzione di fibrinogeno può variare a seconda della sua concentrazione stock, ma il volume totale in ogni bene dovrebbe essere 170 µ l durante l'incubazione.
4. Preparare la soluzione di trombina sciogliendo polvere di trombina commercialmente purificata in ddH₂O per fare una soluzione stock di 50 U/mL. Diluire la soluzione di lavoro 5 U/mL in tampone di 20 mM HEPES (pH 7.4) direttamente prima dell'uso.
5. Dopo 30 minuti di incubazione, contemporaneamente aggiungere 30 µ l di soluzione di trombina (5 U/mL) nelle soluzioni di fibrinogeno nella piastra a 96 pozzetti da Step 2.3 utilizzando la pipetta multicanale. Aggiunta di trombina avvierà immediatamente la formazione del coagulo. Di conseguenza, è possibile aggiungere trombina direttamente nel centro della soluzione di fibrinogeno con cura per evitare la formazione di bollicine.
   Nota: L'attività della trombina può variare tra condizioni sperimentali, come pure un sacco di trombina. La corretta concentrazione richiesta per produrre robustamente coaguli potrebbe essere necessario essere determinata empiricamente.
6. Leggere l'assorbanza di coagulo in vitro su un lettore di piastra immediatamente dopo l'aggiunta di trombina. Misurare l'assorbanza a 350 nm nell'arco di 10 minuti, ogni 30-60 s. eseguire il dosaggio intero a temperatura ambiente.
   Nota: Alcuni composti inibitori possono alterare l'assorbanza della soluzione a 350 nm, nel quale caso la torbidità può essere misurata a 405 nm.

3. microscopia elettronica di esame

1. Preparazione di coagulo, fissazione e lavaggio
   1. Posto pulito siliconato vetrini copertura cerchio (12 mm) in una piastra 12-pozzetti o 24 pozzetti usando il forcipe.
   2. Preparare il fibrinogeno nel buffer di formazione del coagulo. Vedere il passaggio di protocollo 1.2 per dettagli.
   3. Per valutare l'effetto degli inibitori di interazione di Aβ-fibrinogeno sulla struttura del coagulo di fibrina, seguire le istruzioni per incubazione come descritto per il dosaggio di torbidità (passaggio 2). Includere sempre i pozzetti di controllo che contengono il fibrinogeno in assenza di Aβ e inibitori.
   4. Pipettare 80 µ l della miscela del fibrinogeno a partire da punto 3.1.3 le diapositive di copertura. Delicatamente diffondere la soluzione in modo che è uniformemente distribuito sulla diapositiva coperchio.
   5. Diluire il magazzino della trombina (50 U/mL) in soluzione salina tamponata HEPES 20 mM ad una concentrazione finale di 2,5 U/mL e aggiungere 20 µ l direttamente al centro di per la soluzione di fibrinogeno senza mescolare.
      Nota: Se necessario, una maggiore concentrazione di lavoro di trombina (5 U/mL) può essere utilizzata.
   6. Coprire la piastra 12-pozzetti con un coperchio di plastica e lasciarlo a temperatura ambiente per 30-60 min.
   7. Durante l'esecuzione di reazione di coagulazione, preparare soluzioni di disidratazione e la fissazione. Preparare tampone cacodilato di sodio (0,1 M, pH 7.4). Diluire la soluzione stock di 10% glutaraldeide in tampone cacodilato di sodio (0,1 M, pH 7.4) per fare un 2% soluzione di glutaraldeide di lavoro. Mantenere tutte queste soluzioni sul ghiaccio. Fresco diluito glutaraldeide (2%) deve essere utilizzato entro 1 settimana, quando correttamente conservato in frigorifero a 4 ° C.
   8. Diluire etanolo assoluto (100%) in acqua distillata doppia (80%, 50% e 20% etanolo). Mantenere queste soluzioni di etanolo ed etanolo assoluto (100%) sul ghiaccio.
      Attenzione: prestare attenzione quando si maneggia il sodio cacodilato e glutaraldeide, eseguire la procedura in una cappa chimica.
   9. Dopo 30 min, lavare delicatamente i coaguli con buffer di gelida sodio cacodilato (0,1 M) due volte. Aggiungere 2 mL di tampone in ciascun pozzetto, tale che il coagulo è completamente sommerso. Coprire la piastra ben con un coperchio e lasciare per 2 min a temperatura ambiente. Dopo 2 minuti, rimuovere delicatamente il buffer utilizzando una pipetta da 1 mL o gambo stretto delle pipette. Ripetere una volta.
   10. Difficoltà i coaguli con glutaraldeide ghiacciata (2%). Tenendo la piastra ben sul ghiaccio, aggiungere circa 2-3 mL di glutaraldeide 2% ad ogni pozzetto. Assicurarsi che i grumi sono completamente sommerse. Coprire e lasciare la piastra sul ghiaccio per 30 min.
   11. Dopo 30 min, delicatamente rimuovere la glutaraldeide da ogni pozzetto e lavare i coaguli utilizzando sodio cacodilato buffer (0.1 M), come descritto in precedenza (2 min, due volte). Tenere la piastra ben sul ghiaccio.
2. Seriale disidratazione del coagulo e punto critico di essiccazione
   1. Disidratare i coaguli in una serie graduata di lavaggi di etanolo ghiacciata preparata al punto 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% e again100%) per 5 minuti ciascuno. Per ogni serie di etanolo, aggiungere 2-3 mL, assicurandosi che i grumi sono sommerse. Coprire e incubare in ghiaccio.
   2. Dopo ogni passaggio di etanolo, rimuovere la soluzione di etanolo usando una pipetta da 1 mL o pipetta contagocce. Non rimuovere completamente l'etanolo. Assicurarsi che la superficie di coagulo non è esposto all'aria.
      Nota: Disidratazione in etanolo assoluto (100%) deve essere eseguita due volte.
   3. Pur mantenendo il campione sommerso in etanolo 100% finale, trasferimento a un punto critico essiccatore (CPD). È possibile utilizzare un portacampioni CPD o un titolare di slittamento del coperchio con una rondella per trasferire i vetrini nella camera di CPD. Inserire almeno una rondella tra ogni diapositiva.
   4. Estrarre il vetrino di copertura dalla camera di CPD e montarlo su un albero mozzo SEM utilizzando nastri di carbonio.
3. Polverizza rivestimento e imaging
   1. Trasferire tutti i campioni con stub SEM alla camera di rivestimento di polverizzazione.
   2. Polverizzi ricoprire meno di 20 nm di oro/palladio o altri materiali conduttivi, come il carbonio, utilizzando una macchina a vuoto polverizza.
      Nota: Abbiamo usato 18 nm di rivestimento oro/palladio. Il rivestimento di polverizzazione è stato effettuato per 45 s e la velocità del rivestimento era 4 Å / s. Sputter rivestito campioni sono stabili se conservati correttamente in un ambiente asciutto a temperatura ambiente per alcune settimane. Analisi SEM possono essere eseguita in qualsiasi momento.
   3. Acquisire immagini su un microscopio elettronico a scansione dotato di rilevatore SE2 a 4 kV.
      Nota: La dimensione in pixel immagine in questa immagine imposta intervallo di 13 nm-31 nm.

Risultati

In vitro test (torbidità) di coagulazione, la trombina enzima fende il fibrinogeno, causando la formazione della fibrina rete²⁴. Questa formazione del coagulo di fibrina provoca dispersione della luce che passa attraverso la soluzione, con conseguente maggiore torbidità (Figura 1), plateauing prima della fine del periodo di lettura (Figura 2, verde). Quando il fibrinogeno è stato incubato in pr...

Discussione

I metodi descritti qui consentono di valutare la fibrina coagulo formazione in vitroin modo rapido e riproducibile. Inoltre, la semplicità del sistema rende l'interpretazione di come Aβ influenza la formazione del coagulo di fibrina e la struttura relativamente semplice. Nella pubblicazione precedente di questo laboratorio, è stato dimostrato che queste analisi possono essere utilizzate per testare composti per la loro capacità di inibire le Aβ-fibrinogeno interazione^13,

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma	EMD Millipore	341578	keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture
Beta-Amyloid (1-42), Human	Anaspec	AS-20276
Thrombin from human plasma	Sigma-Aldrich	T7009
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%	Sigma-Aldrich	105228
DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED	Sigma-Aldrich	D2438
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Tris Base	Fischer Scientific	BP152
HEPES	Fischer Scientific	BP310
NaCl	Fischer Scientific	S271
CaCl2	Fischer Scientific	C70
Filter Syringe, 0.2µM, 25mm	Pall	4612
Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.	Millipore	SLVV033RS
Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom	Fischer Scientific	21377203
Spectramax Plus384	Molecular Devices	89212-396
Centrifuge, 5417R	Eppendorf	5417R
Branson 200 Ultrasonic Cleaner	Fischer Scientific	15-337-22
Lab Rotator	Thermo Scientific	2314-1CEQ
Spare washers for cover slip holder	Tousimis	8766-01
Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet	Electron Microscopy Sciences (EMS)	70967-13
Sample holder for CPD (Cover slip holder)	Tousimis	8766
Mount Holder Box, Pin Type	Electron Microscopy Sciences (EMS)	76610
Round glass cover slides (12 mm)	Hampton Research	HR3-277
10% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences (EMS)	16120
Ethanol	Decon Labs	11652
24 well plate	Falcon	3047
Na Cacodylate	Electron Microscopy Sciences (EMS)	11652
SEM Stubs, Tapered end pin.	Electron Microscopy Sciences (EMS)	75192
PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD	Ted Pella	16084-1
Autosamdri-815 Critical Point Dryer	Tousimis
Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target	Denton Vacuum
Leo 1550 FE-SEM	Carl Zeiss
Smart SEM Software	Carl Zeiss