Analyse der β-Amyloid-induzierte Anomalien auf Fibrin Gerinnsel Struktur von Spektroskopie und Rasterelektronenmikroskopie

Zusammenfassung

Hier sind zwei Methoden, die einzeln oder in Kombination verwendet werden können, um die Wirkung von Beta-Amyloid auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu analysieren. Enthalten ist ein Protokoll für die Schaffung einer in Vitro Fibrin Gerinnsel, gefolgt von Gerinnsel Trübung und Rasterelektronenmikroskopie Methoden.

Zusammenfassung

Dieser Artikel stellt Methoden zur Erzeugung von in Vitro Fibrin Gerinnsel und Analyse der Wirkung von Beta-Amyloid (Aβ)-Protein auf Bildung von Blutgerinnseln und Struktur durch Spektrometrie und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Aβ, die neurotoxischen Amyloid Aggregate bei der Alzheimer-Krankheit (AD) bildet, hat sich gezeigt, zur Interaktion mit Fibrinogen. Dieses Zusammenspiel von Aβ-Fibrinogen macht das Fibrin-Gerinnsel strukturell abnorme und Fibrinolyse. Aβ-induzierte Anomalien in Fibrin Blutgerinnung können auch dazu beitragen, zerebrovaskuläre Aspekte der AD Pathologie wie Microinfarcts, Entzündungen sowie zerebralen Amyloid-Angiopathie (CAA). Angesichts der potenziell kritische Rolle der neurovaskulären Defizite in der AD-Pathologie, hat Verbindungen hemmen oder vermindern die Aβ-Fibrinogen-Interaktion zu entwickeln vielversprechenden therapeutischen Wert. In-vitro- Methoden nach dem Fibrin Gerinnselbildung leicht und systematisch beurteilt werden kann sind potenziell nützliche Werkzeuge für die Entwicklung von therapeutischen Substanzen. Hier vorgestellten ist ein optimierte Protokoll für in-vitro- Erzeugung von Fibrin-Gerinnsel sowie Analyse der Wirkung von Aβ und Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren. Die Gerinnsel Trübung Assay ist schnelle und hoch reproduzierbare und kann verwendet werden, um mehrere Bedingungen gleichzeitig testen, zulassend die Vorführung einer großen Zahl von Aβ-Fibrinogen-Inhibitoren. Hit-Verbindungen aus diesem Screening können weiter für ihre Fähigkeit, Aβ-induzierte strukturelle Anomalien der Fibrin-Gerinnsel-Architektur mit SEM verbessern ausgewertet werden Die Wirksamkeit dieser optimierte Protokolle ist hier demonstriert mit TDI-2760, eine neu identifizierte Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitor.

Einleitung

Alzheimer-Krankheit (AD), ergibt sich eine Neurodegenerative Erkrankung führt zu kognitiven Verfall bei älteren Patienten, überwiegend aus abnorme Beta-Amyloid (Aβ) Ausdruck, Aggregation und eingeschränkter Freiraum was zu Neurotoxizität^{1, 2}. trotz der gut-gekennzeichneten Assoziation zwischen Aβ-Aggregate und AD³, sind die genauen Mechanismen der Krankheit-Pathologie nicht gut verstanden⁴. Erhöhung der Beweis schlägt vor, dass neurovaskuläre Defizite bei der Progression und Schweregrad der AD⁵, eine Rolle spielen wie Aβ direkt mit den Komponenten des Herz-Kreislauf-System^{6 interagiert}. Aβ hat eine hohe Affinität Interaktion mit Fibrinogen^7,8, die auch zu Aβ Ablagerungen bei Alzheimer-Patienten und Maus Modelle^9,10,11lokalisiert. Darüber hinaus induziert die Aβ-Fibrinogen-Interaktion abnorme Fibrin-Klumpenbildung sowie Struktur und Widerstand gegen die Fibrinolyse^9,12. Eine therapeutische Möglichkeit bei der Behandlung von AD, ist Kreislauf Defizite durch die Hemmung der Interaktion zwischen Aβ und Fibrinogen^13,14Linderung. Wir, identifiziert daher mehrere kleine Verbindungen hemmen die Aβ-Fibrinogen-Interaktion mit Hochdurchsatz-Screening und medizinische Chemie Ansätze^13,14. Um die Wirksamkeit von Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren zu testen, haben wir zwei Methoden für die Analyse von in-vitro- Bildung von Blutgerinnseln Fibrin optimiert: Blutgerinnung Trübung Assay und Scannen Rasterelektronenmikroskopie (SEM)¹⁴.

Gerinnsel Trübung-Assay ist eine unkomplizierte und schnelle Methode zur Überwachung der Bildung von Blutgerinnseln Fibrin mit UV-VIS Spektroskopie. Als das Fibrin-Gerinnsel wird zunehmend Formen, Licht gestreut und die Trübung der Lösung erhöht. Umgekehrt, wenn Aβ vorhanden ist, die Struktur der das Fibrin-Gerinnsel wird geändert, und die Trübung des Gemisches wird reduziert (Abbildung 1). Die Wirkung von hemmenden Verbindungen kann das Potenzial Gerinnsel Trübung von Aβ-induzierte Anomalien wiederherstellen beurteilt werden. Während die Trübung Assay für die schnelle Analyse von mehreren Bedingungen ermöglicht, informiert es begrenzt auf die Gerinnsel Form und Struktur. SEM, in dem die Topographie von festen Körpern von Elektron Sonde offenbart, ermöglicht die Analyse der 3D-Architektur der Gerinnsel^15,16,17,18 und die Bewertung wie das Vorhandensein von Aβ und und/oder hemmende Verbindungen verändert die Struktur^9,14. Beide Spektrometrie und SEM sind klassische Labor-Techniken, die für verschiedene Zwecke verwendet wurden, z. B. Spektralphotometrie dient zur Überwachung von Amyloid Aggregation^19,20. Ebenso dient SEM auch Fibrin Gerinnsel gebildet aus dem Plasma von Alzheimer, Parkinson und thromboembolische Schlaganfall Patienten^21,22,23zu analysieren. Die hier vorgestellten Protokolle sind für die Beurteilung der Fibrin-Gerinnselbildung in einer reproduzierbaren und schnelle Art und Weise optimiert.

Das folgende Protokoll enthält die Anweisungen für die Zubereitung von einer in-Vitro Fibrin-Gerinnsel sowohl mit als auch ohne Aβ. Es beschreibt auch die Methoden, um die Wirkung von Aβ auf Bildung von Blutgerinnseln Fibrin und Struktur zu analysieren. Die Wirksamkeit dieser beiden Methoden für die Messung der Hemmung der Aβ-Fibrinogen Interaktion wird demonstriert mit TDI-2760, eine kleine hemmende Verbindung¹⁴. Diese Methoden können sowohl einzeln als auch gemeinsam, für schnelle und einfache Analyse von in-vitro- Bildung von Blutgerinnseln Fibrin.

Protokoll

1. Vorbereitung des Aβ42 und Fibrinogen zur Analyse

1. Bereiten Sie Monomere Aβ42 aus gefriergetrockneten Pulver
   1. Warm Aβ42 Pulver auf Raumtemperatur und Spin down bei 1.500 x g für 30 s.
   2. Fügen Sie 100 µL der eiskalte Hexafluoroisopropanol (HFIP hinzu) pro 0,5 mg Aβ42 Pulver und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
      Achtung: Vorsicht beim Umgang mit HFIP und führen Sie alle Schritte in einer chemischen Kapuze.
   3. Bereiten Sie 20 µL Aliquots und lassen Sie die Filme Luft trocken in einem chemischen Abzug für 2-3 h. Filme bei-20 ° c gelagert werden können
   4. Rekonstruieren Sie Monomere Aβ42 Film in 10 µL des frischen Dimethyl Sulfoxid (DMSO) durch Agitation in einem Bad Sonikator für 10 min bei Raumtemperatur.
   5. Fügen Sie 190 µL 50 mM Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (Tris) Puffer (pH 7,4) und pipette vorsichtig nach oben und unten.
   6. Entfernen Sie die Protein-Aggregate durch Zentrifugation bei 20.817 x g bei 4 ° C für 20 Minuten.
   7. Übernachtung den Überstand bei 4 ° C inkubieren und nächsten Tag Zentrifugieren Sie die Lösung bei 20.817 x g bei 4 ° C für 20 Minuten, jede weitere Protein-Aggregate zu verwerfen.
   8. Bicinchoninic Säure (BCA) Assay messen Sie Aβ42 Konzentration. Serielle verdünnte gereinigt Rinderserumalbumin (BSA) von 1 mg/mL 0,0625 mg/ml, einen Protein-Standard zu produzieren, fügen Sie 10 µL jeder Norm in die Vertiefungen von Multi-well-Platte in dreifacher Ausfertigung. Aβ Proben 1:4 zu verdünnen und die Brunnen in dreifacher Ausfertigung 10 µL hinzufügen. BCA Lösungen A und B und 200 µL in jede Vertiefung. 30 min bei 37 ° C inkubieren und lesen auf einer Platte Leser bei 562 nm. Halten Sie die restliche Aβ-Lösung auf dem Eis und verwenden Sie diese Vorbereitung für Trübung Assay und SEM.
2. Fibrinogen Lösung vorbereiten
   1. 20 mg gefriergetrockneten Fibrinogen Pulver in ein 15 mL Röhrchen zu messen und wieder mit vorgewärmten 2 mL 20 mM Hydroxyethylpiperazine Ethan Sulfonsäure (HEPES) Puffer (pH 7,4) aussetzen.
   2. Im Wasserbad 37 ° C für 10 min inkubieren.
   3. Lösung durch einen 0,2 µm Spritze Filter filtern und speichern bei 4 ° C für 30 Minuten. Nehmen Sie die Lösung von 4 ° C und Filter wieder durch 0,1 µm Spritze Filter, Fibrinogen Aggregate zu entfernen oder bereits vorhandene Fibrin.
   4. Messen Sie die Fibrinogen Konzentration von BCA-Assay. Befolgen Sie die Anweisungen ab Schritt 1.1.8. Halten Sie die restliche Fibrinogen-Lösung bei 4 ° C und verwenden Sie diese Vorbereitung für Trübung Assay und SEM.

(2) Gerinnsel Trübung Assay

1. Fügen Sie in jede experimentelle Vertiefung der 96-Well-Platte 20 µL 30 µM Aβ42 Lösung aus Schritt 1.1.8 hinzu, so dass die Endkonzentration 3,0 µM in 200 µL des Puffers ist. Fügen Sie das gleiche Volumen von 5 % DMSO in 50 mM Tris-Puffer (pH 7,4), Kontroll-Vertiefungen in der 96-Well-Platte zu puffern.
   Hinweis: Das genaue Volumen der Aβ42 bei diesem Schritt ist nicht wichtig. Für niedrige Konzentration Vorbereitungen ein höheres Volumen kann verwendet werden, und die Lautstärke des Puffers Gerinnsel-Bildung. Das Endvolumen sollte 200 µL bleiben.
2. Verdünnen Sie hemmende Verbindungen zu testen, die Verbindung zur Arbeit Konzentration als DMSO. Fügen Sie zusammengesetzte oder DMSO allein für ein Steuerelement in die Vertiefungen mit Aβ42 und gut mischen.
   Hinweis: Aβ42 Lösung sollte einen diskrete Tropfen an der Unterseite des Brunnens, die Verbindung zu bilden oder DMSO sollte direkt in der Mitte des Tropfenabscheiders pipettiert werden.
3. Die Fibrinogen-Stammlösung aus Schritt 1.2.4 Blutgerinnsel Bildung Puffer verdünnen (20 mM HEPES-Puffer (pH-Wert 7,4), 5 mM CaCl₂und 137 mM NaCl) und fügen Sie es in Aβ42 Eindämmung und Kontrolle Vertiefungen der 96-Well-Platte. Stellen Sie die Lautstärke der Fibrinogen-Lösung, so dass die Endkonzentration 1,5 µM in insgesamt 200 µL Reaktionsvolumen wird. Pipette die Lösung langsam und vermeiden Sie Luftblasen bilden. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur für 30 min schütteln auf einer rotierenden Plattform.
   Hinweis: Das Volumen der Fibrinogen-Lösung variieren je nach Konzentration Lager, aber das Gesamtvolumen in jedem gut 170 µL während der Inkubation werden sollte.
4. Thrombin-Lösung durch Auflösen von kommerziell gereinigten Thrombin Pulver in DdH₂O eine Stammlösung von 50 U/mL zu bereiten. Auf die 5 U/mL Arbeitslösung in 20 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) direkt vor dem Gebrauch verdünnen.
5. Fügen Sie nach 30 min Inkubation gleichzeitig 30 µL Thrombin-Lösung (5 U/mL hinzu) in die Fibrinogen-Lösungen in der 96-Well-Platte aus Schritt 2.3 mit Mehrkanal-Pipette. Zugabe von Thrombin wird sofort die Bildung von Blutgerinnseln einleiten. Aus diesem Grund fügen Sie Thrombin direkt in der Mitte der Fibrinogen-Lösung mit Sorgfalt, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden hinzu.
   Hinweis: Die Aktivität von Thrombin kann zwischen experimentellen Bedingungen sowie Thrombin viel variieren. Die richtige Konzentration erforderlich, um robust Klumpen produzieren müssen empirisch ermittelt werden.
6. Lesen Sie die Absorption von in-vitro- Gerinnsel auf eine Platte Leser sofort nach dem Thrombin hinzufügen. Messung der Extinktion bei 350 nm im Laufe von 10 Minuten, alle 30-60 S. führen die gesamte Probe bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Einige Inhibitor-Verbindungen ändern können die Extinktion der Lösung bei 350 nm, in dem Fall die Trübung, bei 405 gemessen werden nm.

3. die Rasterelektronenmikroskopie

1. Vorbereitung der Gerinnsel, Fixierung und waschen
   1. Hotel sauber silikonisiert Kreis Abdeckung Objektträger (12 mm) in einer 12-Well oder 24-Well-Platte mit Pinzette.
   2. Fibrinogen in Blutgerinnsel Bildung Puffer vorzubereiten. Siehe Protokoll Schritt 1.2 für Details.
   3. Um die Wirkung von Aβ-Fibrinogen-Interaktion-Inhibitoren auf Fibrin Gerinnsel Struktur zu bewerten, befolgen Sie die Anweisungen für die Inkubation, wie für die Trübung Assay (Schritt2) beschrieben. Immer auch Kontroll-Vertiefungen die Fibrinogen in der Abwesenheit von Aβ und Inhibitoren enthalten.
   4. Pipette 80 µL der Fibrinogen-Mischung aus Schritt 3.1.3 auf den Cover-Folien. Sanft verteilt die Lösung, so dass es gleichmäßig auf der Abdeckung Folie verteilt wird.
   5. Verdünnen Sie Thrombin-Lager (50 U/mL) in 20 mM HEPES gepufferten Kochsalzlösung, eine Endkonzentration von 2,5 U/mL zu und fügen Sie 20 µL direkt ins Zentrum von Fibrinogen-Lösung hinzu, ohne sich zu vermischen.
      Hinweis: Bei Bedarf kann eine höhere Thrombin arbeiten Konzentration (5 U/mL) verwendet werden.
   6. 12-Well-Platte mit einem Kunststoffdeckel und lassen Sie es bei Raumtemperatur für 30-60 Minuten.
   7. Während Gerinnung Reaktion läuft, bereiten Sie Austrocknung und Fixierung Lösungen vor. Natrium Cacodylate Puffer (0,1 M, pH 7,4) vorzubereiten. Verdünnen Sie 10 % Glutaraldehyd Stammlösung in Natrium-Cacodylate-Puffer (0,1 M, pH 7,4), einen 2 % Lösung von Glutaraldehyd arbeiten zu machen. Halten Sie diese Lösungen auf Eis. Frisch verdünnten Glutaraldehyd (2 %) sollte verwendet werden, innerhalb von 1 Woche, bei sachgemäßer Lagerung im Kühlschrank bei 4 ° C.
   8. Verdünnen Sie absoluten Ethanol (100 %) in doppelt destilliertem Wasser (80 %, 50 % und 20 % Ethanol). Bewahren Sie diese Ethanol Lösungen und absolute Ethanol (100 %) auf dem Eis.
      Achtung: Vorsicht beim Umgang mit Natrium Cacodylate und Glutaraldehyd, führen Sie diese Schritte in einer chemischen Kapuze.
   9. Waschen Sie nach 30 min die Klumpen mit eiskalten Natrium Cacodylate Puffer (0,1 M) zweimal vorsichtig. Fügen Sie 2 mL des Puffers in jede Vertiefung, sodass das Gerinnsel vollständig eingetaucht sind. Decken Sie die well-Platte mit einem Deckel ab und lassen Sie ihn für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach 2 min vorsichtig den Puffer mit einer 1-mL-Pipette oder schmalen Stiel Transferpipette. Einmal wiederholen.
   10. Befestigen Sie die Klumpen mit eiskalten Glutaraldehyd (2 %). Halten die well-Platte auf dem Eis, fügen Sie etwa 2-3 mL 2 % Glutaraldehyd in jede Vertiefung. Sicherstellen Sie, dass die Klumpen vollständig eingetaucht sind. Decken Sie ab und die Platte für 30 min auf Eis.
   11. Nach 30 min sanft entfernen Sie das Glutaraldehyd aus jedem Brunnen zu und waschen Sie die Klumpen mit Natrium Cacodylate Puffer (0,1 M), wie oben (2 min, zweimal) beschrieben. Halten Sie die well-Platte auf dem Eis.
2. Serielle Austrocknung der Gerinnsel und kritischer Punkt-Trocknung
   1. Entwässern Sie die Klumpen in eine abgestufte Reihe von eiskaltem Ethanol Wäschen in Schritt 3.1.8 (20 %, 50 %, 80 %, 100 % und again100 %) für 5 min zubereitet. Fügen Sie für jede Serie Ethanol 2-3 mL, sicherstellen, dass die Klumpen untergetaucht sind. Decken Sie und inkubieren Sie auf Eis.
   2. Entfernen Sie nach jedem Schritt Ethanol die Ethanol-Lösung mit einer 1-mL-Pipette oder Einweg-Pipette Pipette. Entfernen Sie das Ethanol nicht vollständig. Sicherstellen Sie, dass die Gerinnsel Oberfläche nicht Luft ausgesetzt ist.
      Hinweis: Dehydrierung in absoluten Ethanol (100 %) sollte zweimal durchgeführt werden.
   3. Halten Sie die Probe in das endgültige 100 % Ethanol getaucht und auf einen kritischen Punkt Trockner (CPD) übertragen. Verwenden Sie ein CPD-Probenhalter oder ein Deckglas Halter mit einer Unterlegscheibe für die Folien in der CPD-Kammer zu übertragen. Legen Sie mindestens eine Unterlegscheibe zwischen den einzelnen Folien.
   4. Nehmen Sie die Abdeckung Folie aus der CPD-Kammer und an ein SEM-Stub mit Kohlenstoff Klebeband befestigen.
3. Sputter-Beschichtung und Bildgebung
   1. Übertragen Sie alle Proben mit SEM Stub auf der Sputter-Beschichtungskammer.
   2. Sputter-Beschichtung weniger als 20 nm Gold/Palladium oder anderen leitfähigen Materialien wie Karbon, mit einem Vakuum Sputter Coater.
      Hinweis: Wir haben verwendet 18 nm Gold/Palladium-Beschichtung. Die Sputter-Beschichtung erfolgte für 45 s und die Beschichtung Geschwindigkeit war 4 Å / S. Sputter beschichteten Proben sind stabil, wenn Sie richtig in trockener Umgebung bei Raumtemperatur einige Wochen lang zur Verfügung. SEM-Analyse kann jederzeit durchgeführt werden.
   3. Abrufen von Bildern auf einem Rasterelektronenmikroskop, ausgestattet mit dem SE2-Detektor bei 4 kV.
      Hinweis: Die Bildgröße Pixel in diesem Bild stellen Bereich von 13 nm-31 nm.

Ergebnisse

In der in-vitro- Gerinnung (Trübung) Assay spaltet das Enzym Thrombin Fibrinogen, was zur Bildung von Fibrin Netzwerk²⁴. Diese Bildung von Blutgerinnseln Fibrin verursacht Streuung des Lichtes durch die Lösung, was zu erhöhten Trübung (Abbildung 1), plateauing vor dem Ende der Lesung Periode (Abbildung 2, grün). Wenn die Fibrinogen in Anwesenheit von Aβ42 inkubiert wurde, die Trübung der L?...

Diskussion

Die hier beschriebenen Methoden bieten eine reproduzierbare und schnelles Mittel zur Bewertung der Fibrin Gerinnsel Bildung in Vitro. Darüber hinaus macht die Einfachheit des Systems die Interpretation der Auswirkungen Aβ die Bildung von Blutgerinnseln Fibrin und Struktur relativ geradlinig. In dieser Übungseinheit früheren Publikation zeigte sich, dass diese Tests verwendet werden, können um Verbindungen für ihre Fähigkeit, hemmen die Aβ-Fibrinogen Interaktion^13,

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma	EMD Millipore	341578	keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture
Beta-Amyloid (1-42), Human	Anaspec	AS-20276
Thrombin from human plasma	Sigma-Aldrich	T7009
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%	Sigma-Aldrich	105228
DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED	Sigma-Aldrich	D2438
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Tris Base	Fischer Scientific	BP152
HEPES	Fischer Scientific	BP310
NaCl	Fischer Scientific	S271
CaCl2	Fischer Scientific	C70
Filter Syringe, 0.2µM, 25mm	Pall	4612
Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.	Millipore	SLVV033RS
Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom	Fischer Scientific	21377203
Spectramax Plus384	Molecular Devices	89212-396
Centrifuge, 5417R	Eppendorf	5417R
Branson 200 Ultrasonic Cleaner	Fischer Scientific	15-337-22
Lab Rotator	Thermo Scientific	2314-1CEQ
Spare washers for cover slip holder	Tousimis	8766-01
Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet	Electron Microscopy Sciences (EMS)	70967-13
Sample holder for CPD (Cover slip holder)	Tousimis	8766
Mount Holder Box, Pin Type	Electron Microscopy Sciences (EMS)	76610
Round glass cover slides (12 mm)	Hampton Research	HR3-277
10% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences (EMS)	16120
Ethanol	Decon Labs	11652
24 well plate	Falcon	3047
Na Cacodylate	Electron Microscopy Sciences (EMS)	11652
SEM Stubs, Tapered end pin.	Electron Microscopy Sciences (EMS)	75192
PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD	Ted Pella	16084-1
Autosamdri-815 Critical Point Dryer	Tousimis
Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target	Denton Vacuum
Leo 1550 FE-SEM	Carl Zeiss
Smart SEM Software	Carl Zeiss