Análise de β-amiloide-induzida de anormalidades na estrutura do coágulo de fibrina por espectroscopia e microscopia eletrônica

Resumo

Aqui apresentados são dois métodos que podem ser usados individualmente ou em combinação para analisar o efeito da beta-amiloide na estrutura do coágulo de fibrina. Incluído é um protocolo para criar um em vitro coágulo de fibrina, seguido pelo coágulo turbidez e microscopia eletrônica métodos.

Resumo

Este artigo apresenta métodos para gerar coágulos de fibrina em vitro e analisando o efeito da proteína de beta-amiloide (Aβ) na formação de coágulos e estrutura por espectrometria e microscopia eletrônica (SEM). Aβ, que forma neurotóxicos agregados amiloides na doença de Alzheimer (AD), foi mostrado para interagir com o fibrinogênio. Essa interação de Aβ-fibrinogênio faz o coágulo de fibrina estruturalmente anormal e resistente a fibrinólise. Induzida por aβ anormalidades na coagulação fibrina também podem contribuir para aspectos cerebrovasculares da patologia AD tais como microinfarcts, inflamação, bem como, Angiopatia amiloide cerebral (CAA). Dado o papel potencialmente crítico dos défices neurovasculares na patologia AD, desenvolvimento de compostos que podem inibir ou diminuir a interação de Aβ-fibrinogênio tem valor terapêutico promissor. Métodos in vitro pelo qual fibrina formação do coágulo pode ser facilmente e sistematicamente avaliada são potencialmente úteis ferramentas para o desenvolvimento de compostos terapêuticos. Apresentado aqui é um protocolo otimizado para in vitro geração do coágulo de fibrina, bem como a análise do efeito dos inibidores de interação Aβ e Aβ-fibrinogênio. O ensaio de turbidez do coágulo é rápida, altamente reprodutível e pode ser usado para testar várias condições simultaneamente, permitindo a seleção de um grande número de inibidores de Aβ-fibrinogênio. Sucesso compostos desta seleção podem ser mais avaliados por sua capacidade de amenizar induzida por Aβ anormalidades estruturais da arquitetura do coágulo de fibrina usando SEM. A eficácia destes protocolos otimizado é demonstrada aqui usando TDI-2760, um inibidor de interação de Aβ-fibrinogênio recentemente identificado.

Introdução

A doença de Alzheimer (AD), uma doença neurodegenerativa, levando ao declínio cognitivo em pacientes idosos, predominantemente decorre anormal expressão de beta-amiloide (Aβ), agregação e liberação prejudicada, resultando em neurotoxicidade^{1, 2}. apesar da associação bem caracterizada entre agregados Aβ e AD³, os mecanismos precisos subjacentes a patologia da doença não são bem compreendidas⁴. Aumentando a evidência sugere que os défices neurovascular desempenham um papel na progressão e gravidade da AD⁵, como Aβ interage diretamente com os componentes do sistema circulatório⁶. Aβ tem uma interação de alta afinidade com fibrinogênio^7,8, que localiza também aos depósitos Aβ em pacientes AD e rato modelos^9,10,11. Além disso, a interação de Aβ-fibrinogênio induz a formação do coágulo de fibrina anormal e estrutura, bem como resistência a fibrinólise^9,12. Uma possibilidade terapêutica no tratamento de AD, está aliviando o déficit circulatório, inibindo a interação entre Aβ e fibrinogênio^13,14. Nós, portanto, identificamos vários pequenos compostos, inibindo a interação de Aβ-fibrinogênio usando alto throughput triagem e química medicinal abordagens^13,14. Para testar a eficácia de inibidores de interação Aβ-fibrinogênio, nós aperfeiçoamos a dois métodos de análise de em vitro formação de coágulos de fibrina: coagular ensaio de turbidez e digitalização de microscopia eletrônica de varredura (MEV)¹⁴.

Ensaio de turbidez de coágulo é um método direto e rápido para monitorar a formação de coágulos de fibrina usando espectroscopia UV-visível. Como o coágulo de fibrina, formas, luz é cada vez mais dispersos e a turbidez da solução aumenta. Inversamente, quando Aβ está presente, a estrutura do coágulo de fibrina é alterada, e a turvação da mistura é reduzida (Figura 1). O efeito inibitório compostos pode ser avaliado para o potencial de restaurar o coágulo turbidez de anormalidades Aβ-induzida. Enquanto o ensaio de turbidez permite análise rápida de várias condições, fornece informações limitadas sobre a forma de coágulo e estrutura. SEM, em que a topografia de objetos sólidos é revelada pela sonda de elétron, permite a análise da arquitetura 3D do coágulo^16,15,17,18 e a avaliação de como a presença de Aβ e / ou compostos inibitórios altera essa estrutura^9,14. Tanto espectrometria e SEM são técnicas clássicas de laboratório que foram usadas para diversos fins, por exemplo, espectrofotometria usada para monitorar a agregação amiloide^19,20. Da mesma forma, SEM também é usado para analisar o coágulo de fibrina formado a partir do plasma do Alzheimer, Parkinson e AVC tromboembólico pacientes^21,22,23. Os protocolos aqui apresentados são otimizados para avaliar a formação do coágulo de fibrina de forma rápida e reprodutível.

O protocolo seguinte fornece as instruções para a preparação de um em vitro -coágulo de fibrina com e sem Aβ. Ele também detalha os métodos para analisar o efeito de Aβ na formação do coágulo de fibrina e estrutura. A eficácia destes dois métodos para medir a inibição da interação Aβ-fibrinogênio é demonstrada usando TDI-2760, um pequeno compostos inibitórios¹⁴. Esses métodos, tanto individualmente e em conjunto, permitem uma análise rápida e simples de em vitro formação de coágulos de fibrina.

Protocolo

1. preparação de Aβ42 e fibrinogênio para análise

1. Preparar Aβ42 monomérica de pó liofilizado
   1. Aquecer Aβ42 pó a temperatura ambiente e rotação para baixo a 1.500 x g, durante 30 s.
   2. Adicionar 100 µ l de gelado hexafluoroisopropanol (HFIP) por 0,5 mg de pó de Aβ42 e incube por 30 min no gelo.
      Cuidado: Tenha cuidado ao manusear HFIP e executar todas as etapas em uma capa de química.
   3. Preparar 20 alíquotas µ l e deixe o que ar seco em uma capa química para 2-3 h. filmes filmes pode ser armazenado a-20 ° C.
   4. Reconstitua o monomérico Aβ42 filme em 10 µ l de fresco dimetilsulfóxido (DMSO) por agitação em um sonicador de banho durante 10 minutos à temperatura ambiente.
   5. Adicione µ l 190 de 50 mM tris (hidroximetil) aminometano (Tris) de tampão (pH 7,4) e pipetar para cima e para baixo suavemente.
   6. Remova os agregados de proteínas por centrifugação a 20.817 x g a 4 ° C por 20 min.
   7. Incubar o sobrenadante a 4 ° C durante a noite e no dia seguinte centrifugar a solução a 20.817 x g a 4 ° C por 20 min descartar qualquer outra agregados de proteína.
   8. Medir a concentração de Aβ42 por ensaio de bicinchoninic ácido (BCA). Serial diluído purificada albumina de soro bovino (BSA) de 1 mg/mL de 0,0625 mg/mL para produzir um padrão de proteína, adicionar 10 µ l de cada norma aos poços de uma placa multi bem em triplicado. Diluir as amostras Aβ 1:4 e adicionar 10 µ l nos poços em triplicado. Misture BCA soluções A e B e adicionar 200 µ l de cada poço. Incubar durante 30 min a 37 ° C e um leitor de placa no 562 a ler nm. Manter o restante da solução Aβ no gelo e usar esta preparação para o ensaio de turbidez e SEM.
2. Preparar a solução de fibrinogênio
   1. Medir a 20 mg de pó liofilizado fibrinogênio em um tubo de 15 mL e ressuspender com 2ml pré-aquecido de 20 mM hidroxietilpiperazina etano sulfônico (HEPES) de tampão (pH 7,4).
   2. Incube em banho-maria 37 ° C por 10 min.
   3. Filtrar a solução através de um filtro de seringa 0,2 µm e armazenar a 4 ° C por 30 min. Retire a solução de 4 ° C e o filtro novamente através de filtro de seringa 0.1 µm para remover agregados de fibrinogênio ou pré-existente, fibrina.
   4. Medir a concentração de fibrinogênio por ensaio BCA. Siga as instruções da etapa 1.1.8. Manter o restante da solução fibrinogênio a 4 ° C e use esta preparação para o ensaio de turbidez e SEM.

2. coágulo turbidez ensaio

1. A cada poço experimental da placa de 96 poços, adicione 20 µ l de solução de Aβ42 30 µM da etapa 1.1.8 para que sua concentração final é 3,0 µM em 200 µ l de buffer. Adicione o mesmo volume de 5% DMSO em tampão de 50 mM Tris (pH 7,4) para tamponar poços de controle da placa de 96 poços.
   Nota: O volume exato de Aβ42 neste passo não é importante. Para as preparações de baixa concentração, um volume mais elevado pode ser usado, e o volume de reserva de formação do coágulo pode ser ajustado. O volume final deve permanecer 200 µ l.
2. Se testes compostos inibitórios, dilua o composto para a concentração de trabalho como DMSO. Adicionar composto ou DMSO sozinho para um controle de poços com Aβ42 e misture bem.
   Nota: Solução de Aβ42 deve formar uma discreta da gota no fundo do poço, o composto ou DMSO deve ser pipetado diretamente para o centro da gota.
3. Diluir a solução-mãe da etapa 1.2.4 no buffer de formação do coágulo fibrinogênio (tampão HEPES de 20 mM (pH 7,4), 5 mM CaCl₂e 137 mM NaCl) e adicioná-lo ao Aβ42 contendo e controle de poços da placa de 96 poços. Ajuste o volume da solução de fibrinogênio para que sua concentração final torna-se 1,5 µM em volume de reação total 200 µ l. Adicionar a solução lentamente e evitar a formação de bolhas. Incube a placa à temperatura ambiente por 30 min tremendo em uma plataforma giratória.
   Nota: O volume da solução de fibrinogênio pode variar dependendo de sua concentração das ações, mas o volume total em cada bem deve ser 170 µ l durante a incubação.
4. Prepare a solução de trombina, dissolvendo o pó de trombina comercialmente purificado em ddH₂O tornar-se uma solução stock de 50 U/mL. Dilua a solução de trabalho 5 U/mL em tampão HEPES 20 mM (pH 7,4) diretamente antes da utilização.
5. Após 30 min de incubação, simultaneamente adicione 30 µ l de solução de trombina (5 U/mL) para as soluções de fibrinogênio na placa de 96 poços de 2.3 etapa usando uma pipeta multicanal. Adição de trombina iniciará imediatamente a formação de coágulos. Portanto, adicione trombina diretamente para o centro da solução de fibrinogênio com cuidado para evitar a formação de bolhas.
   Nota: A atividade de trombina pode variar entre condições experimentais, bem como lotes de trombina. A concentração correta necessária para produzir robustamente coágulos pode ter que ser determinado empiricamente.
6. Leia a absorvância do coágulo em vitro em um leitor de placa imediatamente após a adição de trombina. Medir a absorvância a 350 nm, ao longo de 10 min, cada 30-60 s. realizar o ensaio inteiro à temperatura ambiente.
   Nota: Alguns compostos inibidor podem alterar a absorvância da solução a 350 nm, em que caso a turbidez pode ser medido em 405 nm.

3. microscopia eletrônica

1. Preparação de coágulo, fixação e lavagem
   1. Lugar limpo siliconizado círculo capa lâminas (12 mm) em uma placa bem-12 ou 24-bem usando fórceps.
   2. Prepare o fibrinogênio no buffer de formação do coágulo. Ver protocolo passo 1.2 para obter detalhes.
   3. Para avaliar o efeito dos inibidores de interação Aβ-fibrinogênio na estrutura do coágulo de fibrina, siga as instruções para a incubação, conforme descrito para o ensaio de turbidez (etapa 2). Sempre incluem poços de controle que contêm fibrinogênio na ausência de Aβ e inibidores.
   4. Pipete 80 µ l da mistura da etapa 3.1.3 nas corrediças de capa de fibrinogênio. Delicadamente, espalhe a solução para que é uniformemente distribuída no slide capa.
   5. Diluir o estoque de trombina (50 U/mL) em solução salina HEPES buffer de 20 mM a uma concentração final de 2,5 U/mL e adicionar 20 µ l, diretamente para o centro de para a solução de fibrinogênio sem misturar.
      Nota: Se necessário, uma maior concentração de trabalho de trombina (5 U/mL) pode ser usada.
   6. Cobrir a placa de 12 com uma tampa de plástico e deixá-lo em temperatura ambiente por 30-60 min.
   7. Enquanto a reação de coagulação está executando, prepare soluções de desidratação e fixação. Prepare o tampão de cacodylate de sódio (0,1 M, pH 7,4). Dilua a solução de glutaraldeído 10% das ações no buffer de cacodylate de sódio (0,1 M, pH 7,4) tornar-se um 2% solução de glutaraldeído a trabalhar. Manter todas essas soluções no gelo. Recentemente diluída de glutaraldeído (2%) deve ser usado dentro de 1 semana, quando devidamente armazenado em geladeira a 4 ° C.
   8. Dilua o etanol absoluto (100%) em água bidestilada (20%, 50% e 80% de etanol). Manter estas soluções de etanol e o etanol absoluto (100%) no gelo.
      Cuidado: tenha cuidado ao manusear o cacodylate de sódio e glutaraldeído, execute estas etapas em uma capa de química.
   9. Após 30 min, delicadamente lave duas vezes os coágulos com buffer de cacodylate gelada de sódio (0,1 M). Adicione 2 mL de tampão de para cada poço, tal que o coágulo está completamente submersa. Cobrir a placa bem com uma tampa e deixe por 2 min à temperatura ambiente. Depois de 2 min, retire com cuidado o buffer usando uma pipeta de 1 mL ou pipeta de transferência tronco estreito. Repeti uma vez.
   10. Corrigi os coágulos com glutaraldeído gelado (2%). Mantendo a placa bem no gelo, adicione cerca de 2-3 mL de glutaraldeído 2% a cada poço. Assegure-se de que os coágulos estão completamente submersos. Cubra e deixe a placa no gelo por 30 min.
   11. Após 30 min, delicadamente Retire o glutaraldeído de cada poço e lave os coágulos usando o buffer de cacodylate de sódio (0,1 M) como descrito acima (2 min, duas vezes). Manter a placa bem no gelo.
2. Desidratação serial de coágulo e ponto crítico de secagem
   1. Desidrate os coágulos em uma série graduada de lavagens de etanol gelado preparado na etapa 3.1.8 (20%, 50%, 80%, 100% e again100%) por 5 min cada. Para cada série de etanol, adicione 2-3 mL, certificando-se que os coágulos são submergidos. Cobrir e incubar no gelo.
   2. Após cada etapa de etanol, remova a solução de etanol utilizando uma pipeta de 1 mL ou conta-gotas pipeta descartável. Não remova completamente o etanol. Certifique-se que a superfície do coágulo não é exposta ao ar.
      Nota: Desidratação de etanol absoluto (100%) deve ser realizada duas vezes.
   3. Mantendo a amostra submergida no final 100% de etanol, transferi para um ponto crítico secador (CPD). Use um porta-amostras CPD ou titular de uma lamela com uma máquina de lavar para a transferência de slides para a câmara CPD. Coloque pelo menos uma arruela entre cada slide.
   4. Leve deslize a tampa da câmara de CPD e montá-lo em um esboço SEM usando fita de carbono.
3. Salpicar o revestimento e a imagem latente
   1. Transferi todas as amostras com esboço SEM à câmara de revestimento por pulverização catódica.
   2. Por pulverização catódica revestir a menos de 20 nm de ouro/paládio ou outros materiais condutores, tais como carbono, usando um aplicador de vácuo por pulverização catódica.
      Nota: Nós usamos 18 nm do revestimento de ouro/paládio. O revestimento por pulverização catódica foi realizado por 45 s e a velocidade de revestimento foi 4 Å / s. Sputter revestido de amostras são estáveis quando mantidos adequadamente em um ambiente seco à temperatura ambiente por algumas semanas. SEM análise pode ser realizada a qualquer momento.
   3. Adquirir imagens em um microscópio eletrônico, equipado com o detector de SE2 em 4 kV.
      Nota: O tamanho de pixel da imagem nesta imagem definir intervalo de 13 nm nm-31.

Resultados

No em vitro ensaio (turbidez) de coagulação, a trombina enzima cliva fibrinogênio, resultando na formação do fibrina rede²⁴. Esta formação do coágulo de fibrina provoca a dispersão da luz que passa através da solução, resultando em maior turbidez (Figura 1), platô antes do final do período de leitura (Figura 2, verde). Quando o fibrinogênio foi incubado na presença de Aβ42, diminu...

Discussão

Os métodos descritos aqui fornecem um meio rápido e reprodutível de avaliação fibrina coágulo formação em vitro. Além disso, a simplicidade do sistema torna a interpretação de como Aβ afeta a formação do coágulo de fibrina e estrutura relativamente simples e direta. Na publicação anterior deste laboratório, foi mostrado que estes ensaios podem ser usados para testar compostos por sua capacidade de inibir a interação de Aβ-fibrinogênio^13,1...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibriogen, Plasminogen-Depleted, Plasma	EMD Millipore	341578	keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture
Beta-Amyloid (1-42), Human	Anaspec	AS-20276
Thrombin from human plasma	Sigma-Aldrich	T7009
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%	Sigma-Aldrich	105228
DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTERED	Sigma-Aldrich	D2438
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Tris Base	Fischer Scientific	BP152
HEPES	Fischer Scientific	BP310
NaCl	Fischer Scientific	S271
CaCl2	Fischer Scientific	C70
Filter Syringe, 0.2µM, 25mm	Pall	4612
Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.	Millipore	SLVV033RS
Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat Bottom	Fischer Scientific	21377203
Spectramax Plus384	Molecular Devices	89212-396
Centrifuge, 5417R	Eppendorf	5417R
Branson 200 Ultrasonic Cleaner	Fischer Scientific	15-337-22
Lab Rotator	Thermo Scientific	2314-1CEQ
Spare washers for cover slip holder	Tousimis	8766-01
Narrow Stem Pipets - Sedi-Pet	Electron Microscopy Sciences (EMS)	70967-13
Sample holder for CPD (Cover slip holder)	Tousimis	8766
Mount Holder Box, Pin Type	Electron Microscopy Sciences (EMS)	76610
Round glass cover slides (12 mm)	Hampton Research	HR3-277
10% Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences (EMS)	16120
Ethanol	Decon Labs	11652
24 well plate	Falcon	3047
Na Cacodylate	Electron Microscopy Sciences (EMS)	11652
SEM Stubs, Tapered end pin.	Electron Microscopy Sciences (EMS)	75192
PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm OD	Ted Pella	16084-1
Autosamdri-815 Critical Point Dryer	Tousimis
Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium target	Denton Vacuum
Leo 1550 FE-SEM	Carl Zeiss
Smart SEM Software	Carl Zeiss