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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Présentées ici sont deux méthodes qui peuvent être utilisés individuellement ou en combinaison pour analyser l’effet de la protéine bêta-amyloïde sur structure de caillot de fibrine. Inclus est un protocole créant un caillot de fibrine in vitro , suivie de turbidité de caillot et la microscopie électronique à balayage méthodes.

Résumé

Cet article présente des méthodes pour générer des caillots de fibrine in vitro et analyser l’effet de la protéine de bêta-amyloïde (Aß) sur la formation de caillots et de la structure par spectrométrie et microscopie électronique (MEB). Bêta-amyloïdes, qui forme des agrégats amyloïdes neurotoxiques dans la maladie d’Alzheimer (ma), s’est avéré d’interagir avec le fibrinogène. Cette interaction Aβ-fibrinogène rend le caillot de fibrine structurellement anormale et résistant à la fibrinolyse. Induite par l’Aß anomalies de coagulation de la fibrine peuvent aussi contribuer aux aspects cérébro-vasculaires de la pathologie AD tels que microinfarcts, l’inflammation, ainsi que, angiopathie amyloïde (CAA). Étant donné le rôle potentiellement critique des déficits neurovasculaire dans la pathologie de la ma, développement de composés qui peuvent inhiber ou réduire l’interaction Aβ-fibrinogène a une valeur thérapeutique prometteuse. Méthodes in vitro par lequel fibrine la formation de caillots peut être facilement et systématiquement évaluée sont des outils potentiellement utiles pour développer des composés thérapeutiques. Présenté ici est un protocole optimisé pour in vitro génération du caillot de fibrine, ainsi que l’analyse de l’effet des inhibiteurs d’interaction Aβ et Aβ-fibrinogène. Le test de turbidité de caillot est rapide, hautement reproductible et peut être utilisé pour tester plusieurs conditions en même temps, ce qui permet la projection d’un grand nombre d’inhibiteurs d’Aβ-fibrinogène. Succès composés de ce dépistage peuvent être évaluées davantage pour leur capacité à améliorer Aβ-induit des anomalies structurelles de l’architecture de caillot de fibrine à l’aide de SEM L’efficacité de ces protocoles optimisés est démontrée ici en utilisant TDI-2760, un inhibiteur d’interaction Aβ-fibrinogène identifié récemment.

Introduction

Maladie d’Alzheimer (ma), une maladie neurodégénérative conduisant à un déclin cognitif chez les personnes âgées, majoritairement découle anormale bêta-amyloïde (Aß) expression, d’agrégation et dégagement ayant une déficience entraînant neurotoxicité1, 2. Malgré l’association bien caractérisée entre les agrégats de bêta-amyloïdes et AD3, les mécanismes précis qui sous-tendent la pathologie de la maladie ne sont pas bien compris4. Plus en plus évident suggère que les déficits neurovasculaires jouent un rôle dans la progression et la sévérité des AD5, comme Aβ interagit directement avec les composants de l' appareil circulatoire6. Bêta-amyloïdes a une interaction de forte affinité avec le fibrinogène7,8, qui localise également aux dépôts de bêta-amyloïdes dans les patients de l’AD et les souris modèles9,10,11. Par ailleurs, l’interaction Aβ-fibrinogène induit la formation de caillot de fibrine anormale et structure, ainsi que la résistance à la fibrinolyse9,12. Une des possibilités thérapeutiques dans le traitement de la ma est atténuer les déficits circulatoires en inhibant l’interaction entre Aβ et fibrinogène13,14. Nous avons, par conséquent, identifié plusieurs petits composés inhibant l’interaction Aβ-fibrinogène à l’aide de criblage à haut débit et la chimie médicinale approches13,14. Pour tester l’efficacité des inhibiteurs de l’interaction Aβ-fibrinogène, nous avons optimisé les deux méthodes d’analyse de in vitro formation de caillots de fibrine : coagulation test de turbidité et scanning electron microscopy (SEM)14.

Test de turbidité de caillot est une méthode simple et rapide pour le suivi de formation de caillots de fibrine en utilisant la spectroscopie UV-visible. Tant que le caillot de fibrine, formes, lumière est plus en plus dispersés et la turbidité de la solution augmente. À l’inverse, lorsque Aβ est présent, la structure du caillot de fibrine est altérée et la turbidité du mélange est réduite (Figure 1). L’effet des composés inhibiteurs peut être évaluée pour le potentiel de restaurer caillot turbidité d’anomalies induite par l’Aß. Alors que le test de turbidité permet pour l’analyse rapide des conditions multiples, il fournit des informations limitées sur le caillot forme et la structure. SEM, dans lequel la topographie des objets solides est révélée par la sonde électronique, permettant l’analyse de l’architecture 3D du caillot15,16,17,18 et l’évaluation de la façon dont la présence de bêta-amyloïdes et composés inhibiteurs et/ou modifie cette structure9,14. Les deux spectrométrie et SEM sont des techniques de laboratoire classiques qui ont été utilisés à diverses fins, par exemple, spectrophotométrie est utilisée pour surveiller l’agrégation amyloïde19,20. De même, SEM est également utilisé pour analyser le caillot de fibrine formé à partir du plasma de l’Alzheimer, Parkinson et maladies thrombo-emboliques patients21,22,23. Les protocoles présentés ici sont optimisés pour l’évaluation de la formation de caillot de fibrine de façon reproductible et rapide.

Le protocole suivant fournit les instructions pour la préparation d’un in vitro -caillot de fibrine avec et sans Aβ. Il détaille également les méthodes pour analyser l’effet des bêta-amyloïdes sur la formation de caillots de fibrine et de la structure. L’efficacité de ces deux méthodes pour mesurer l’inhibition de l’interaction d’Aβ-fibrinogène est démontrée à l’aide de TDI-2760, un petit composé inhibiteur14. Ces méthodes, individuellement et ensemble, permettent une analyse rapide et simple de in vitro formation de caillots de fibrine.

Protocole

1. préparation du fibrinogène et Aβ42 pour l’analyse

  1. Préparer Aβ42 monomère de poudre lyophilisée
    1. Réchauffer Aβ42 poudre à température ambiante et de la rotation vers le bas à 1 500 g pendant 30 s.
    2. Ajouter 100 µL de hexafluoroisopropanol glacee (HFIP) par 0,5 mg de poudre de Aβ42 et incuber pendant 30 minutes sur la glace.
      ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous manipulez HFIP et effectuez toutes les opérations sous une hotte chimique.
    3. Préparer 20 µL d’extraits et de laisser que l’air films sec dans une hotte chimique pour 2-3 h. Films peut être conservé à-20 ° C.
    4. Reconstituer film monomère de Aβ42 dans 10 µL de frais diméthyl sulfoxyde (DMSO) en agitant dans un sonicateur bain pendant 10 min à température ambiante.
    5. Ajouter 190 µL de tampon de 50 mM tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris) (pH 7,4) et Pipeter monte et descend doucement.
    6. Supprimer les agrégats de protéines par centrifugation à 20 817 x g à 4 ° C pendant 20 min.
    7. Incuber le surnageant à 4 ° C pour la nuit et le lendemain Centrifuger la solution à 20 817 x g à 4 ° C pendant 20 min pour écarter d’autres agrégats de protéines.
    8. Mesurer la concentration de Aβ42 par dosage de l’acide (BCA) de bicinchoninic. Série diluée purifié l’albumine sérique bovine (BSA) de 1 mg/mL à 0,0625 mg/mL à produire un niveau de protéines, ajouter 10 µL de chaque étalon sur les puits d’une plaque multipuite en triple exemplaire. Diluer les échantillons Aβ 1:4 et ajouter 10 µL dans les puits en triple exemplaire. Mélanger BCA solutions A et B et ajouter 200 µL à chaque puits. Incuber 30 min à 37 ° C et de lire sur un lecteur de plaque à 562 nm. Conserver la solution d’Aβ restante sur la glace et utilisez cette préparation pour le dosage de la turbidité et SEM
  2. Préparer la solution de fibrinogène
    1. Mesurer 20 mg de poudre lyophilisée de fibrinogène dans un tube de 15 mL et une nouvelle suspension avec préchauffé 2 mL de 20 mM hydroxyethylpiperazine éthane sulfonique (HEPES) tamponné (pH 7,4).
    2. Incuber dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min.
    3. Filtrer la solution à travers un filtre de seringue 0,2 µm et conserver à 4 ° C pendant 30 min. Reprendre la solution de 4 ° C et le filtre par filtre de seringue 0,1 µm pour éliminer les agrégats de fibrinogène ou préexistants de fibrine.
    4. Mesurer la concentration de fibrinogène par dosage de la BCA. Suivez les instructions de l’étape 1.1.8. Garder la trace de la solution de fibrinogène à 4 ° C et utilisez cette préparation pour le dosage de la turbidité et SEM

2. caillot turbidité Assay

  1. Dans chaque loge expérimentale de la plaque à 96 puits, ajouter 20 µL de solution de Aβ42 30 µM de l’étape 1.1.8 afin que sa concentration finale est 3,0 µM dans 200 µL de tampon. Ajouter le même volume de DMSO 5 % dans un tampon Tris 50 mM (pH 7,4) pour tamponner les puits de contrôle dans la plaque à 96 puits.
    Remarque : Le volume exact de Aβ42 à cette étape n’est pas important. Pour les préparations de faible concentration, un volume plus élevé peut être utilisé, et le volume de la mémoire tampon la formation de caillot peut être ajusté. Le volume final devrait rester 200 µL.
  2. Si les essais composés inhibiteurs, diluer le composé à la concentration de travail comme le DMSO. Ajouter composé ou le DMSO uniquement pour un contrôle dans les puits avec Aβ42 et bien mélanger.
    NOTE : Solution Aβ42 devrait former une gouttelette discrète au fond du puits, le composé ou DMSO devrait être distribué directement dans le centre de la goutte.
  3. Diluer la solution mère de fibrinogène 1.2.4 d’étape dans le tampon de la formation de caillot (un tampon HEPES 20 mM (pH 7,4), 5 mM CaCl2et 137 mM NaCl) et ajoutez-le à Aβ42 contenant et le contrôle des puits de la plaque à 96 puits. Réglez le volume de la solution de fibrinogène afin que sa concentration finale devient 1,5 µM dans 200 µL réaction valorisé. La solution, déposer lentement et éviter la formation de bulles. Incuber les plaques à température ambiante pendant 30 min en secouant sur une plate-forme tournante.
    Remarque : Le volume de solution de fibrinogène peut varier selon sa concentration en stock, mais le volume total dans chacun devrait bien être 170 µL en incubation.
  4. Préparer la solution de thrombine en dissolvant la poudre de thrombine commercialement purifiée dans ddH2O pour faire une solution de 50 U/mL. Diluer à la solution de travail 5 U/mL dans un tampon HEPES 20 mM (pH 7,4) directement avant utilisation.
  5. Après 30 min d’incubation, en même temps ajouter 30 µL de solution de thrombine (5 U/mL) dans les solutions de fibrinogène dans la plaque à 96 puits de 2,3 étape à l’aide de la pipette multicanaux. Addition de thrombine mettent immédiatement en branle la formation de caillots. Par conséquent, ajouter la thrombine directement dans le centre de la solution de fibrinogène avec soin afin d’éviter la formation de bulles.
    Remarque : L’activité de la thrombine peut varier entre des conditions expérimentales, mais aussi beaucoup de thrombine. La concentration correcte requise pour produire robuste caillots peut-être devoir être déterminées empiriquement.
  6. Lire l’absorbance d’in vitro caillot sur un lecteur de plaque immédiatement après l’addition de thrombine. Mesurer l’absorbance à 350 nm au cours des 10 min, chaque 30-60 s. effectuer l’essai entier à température ambiante.
    Remarque : Certains composés inhibiteurs peuvent altérer l’absorbance de la solution à 350 nm, dans lequel cas la turbidité peut être mesurée à 405 nm.

3. microscopie électronique

  1. Préparation du caillot, la fixation et lavage
    1. Endroit propre siliconé lames de couverture cercle de verre (12 mm) dans une assiette de 12 puits ou 24 puits avec une pincette.
    2. Préparer le fibrinogène dans le tampon de la formation de caillot. Voir protocole étape 1.2 pour plus de détails.
    3. Pour évaluer l’effet des inhibiteurs de l’interaction Aβ-fibrinogène sur structure de caillot de fibrine, suivez les instructions pour l’incubation comme décrit pour le dosage de la turbidité (étape 2). Incluez toujours les puits témoins contenant fibrinogène en l’absence de bêta-amyloïdes et inhibiteurs.
    4. Distribuer 80 µL du mélange de l’étape 3.1.3 sur les diapositives de couverture fibrinogène. Délicatement étalées la solution afin qu’elle est répartie sur la diapositive de la couverture.
    5. Diluer le stock de thrombine (50 U/mL) dans une solution saline de 20 mM HEPES tamponnée à une concentration finale de 2,5 U/mL et ajouter 20 µL directement au centre de la solution de fibrinogène sans mélange.
      Remarque : Si nécessaire, une concentration plus élevée de travail thrombine (5 U/mL) peut être utilisée.
    6. Couvrir la plaque de 12 puits avec un couvercle en plastique et laissez-le à température ambiante pendant 30-60 min.
    7. Tandis que la réaction de coagulation est en marche, préparer des solutions de déshydratation et de la fixation. Préparer le tampon de cacodylate de sodium (0,1 M, pH 7,4). Diluer la solution glutaraldéhyde 10 % dans du tampon de cacodylate de sodium (0,1 M, pH 7,4) pour faire une solution de glutaraldéhyde diluée de 2 %. Garder toutes ces solutions sur la glace. Glutaraldéhyde fraîchement diluée (2 %) doit être utilisé dans la semaine, lorsque entreposé dans un réfrigérateur à 4 ° C.
    8. Diluer l’éthanol absolu (100 %) dans l’eau bidistillée (80 %, 50 % et 20 % d’éthanol). Gardez ces solutions d’éthanol et l’éthanol absolu (100 %) sur la glace.
      Attention: Soyez prudent lorsque vous manipulez le cacodylate de sodium et le glutaraldéhyde, effectuez ces opérations sous une hotte chimique.
    9. Après 30 min, laver doucement les caillots avec tampon de cacodylate de sodium glacee (0,1 M). Ajouter 2 mL de tampon dans chaque puits, tels que le caillot est complètement immergé. Couvrir la plaque bien avec un couvercle et laissez-le pendant 2 min à température ambiante. Après 2 min, retirez délicatement le tampon à l’aide d’une pipette 1 mL ou une pipette de transfert tige étroite. Répéter une fois.
    10. Difficulté les caillots au glutaraldéhyde glacé (2 %). Garder la plaque bien sur la glace, ajouter environ 2-3 mL de glutaraldéhyde à 2 % dans chaque puits. Veillez à ce que les caillots sont complètement immergés. Couvrez et laissez la plaque sur la glace pendant 30 min.
    11. Après 30 min, retirez le glutaraldéhyde de chaque puits doucement et laver les caillots à l’aide de tampon de cacodylate de sodium (0,1 M) tel que décrit ci-dessus (2 min, deux fois). Maintenir la plaque bien sur la glace.
  2. Série déshydratation du caillot et du séchage du point critique
    1. Déshydrater les caillots dans une série graduée de lave-éthanol glacé, préparé à l’étape 3.1.8 (20 %, 50 %, 80 %, 100 % et again100 %) de 5 min chacun. Pour chaque série d’éthanol, ajouter 2 à 3 mL, en s’assurant que les caillots sont submergées. Couvrir et laisser incuber sur la glace.
    2. Après chaque étape de l’éthanol, supprimer la solution d’éthanol à l’aide d’une pipette 1 mL ou un compte-gouttes pipette à usage unique. Ne pas enlever complètement l’éthanol. Assurez-vous que la surface de caillot n’est pas exposée à l’air.
      NOTE : Déshydratation de l’éthanol absolu (100 %) doit être effectuée deux fois.
    3. Tout en gardant l’échantillon immergé dans la finale 100 % d’éthanol, transfert à un point critique sèche (CPD). Utiliser un porte-échantillon DPC ou le titulaire de la lamelle couvre-objet avec une rondelle pour transférer les diapositives dans la chambre de la CPD. Placez au moins une rondelle entre chaque diapositive.
    4. Sortir la lame de la couverture de la chambre de DPC et montez-la sur un talon de SEM à l’aide de ruban de carbone.
  3. Pulvérisation cathodique revêtement et imagerie
    1. Transférer tous les échantillons avec talon de SEM dans la chambre de revêtement par pulvérisation cathodique.
    2. Par pulvérisation cathodique manteau inférieur à 20 nm d’or/palladium ou autres matériaux conducteurs, comme le carbone, à l’aide d’une coucheuse par pulvérisation cathodique sous vide.
      NOTE : Nous avons utilisé 18 nm de revêtement or/palladium. Le revêtement par pulvérisation cathodique a été réalisé pour 45 s et la vitesse de revêtement a 4 Å / s. échantillons de pulvérisation enduite sont stables lorsqu’ils sont conservés correctement dans un endroit sec à température ambiante pendant quelques semaines. SEM analyse peut être effectuée à tout moment.
    3. Acquisition d’images sur un microscope électronique à balayage équipé avec le détecteur de SE2 à 4 kV.
      Remarque : Taille de pixel de l’image dans cette image la valeur gamme de 13 nm-31 nm.

Résultats

Dans in vitro test (turbidité) de la coagulation, la thrombine enzyme clive fibrinogène, entraînant la formation de la fibrine réseau24. Cette formation de caillot de fibrine entraîne la diffusion de la lumière passant à travers la solution, ce qui entraîne une augmentation de la turbidité (Figure 1), plafonnement avant la fin de la période de lecture (Figure 2, vert). Lorsque le fibrino...

Discussion

Les méthodes décrites ici constituent un moyen reproductible et rapid d’évaluation de fibrine caillot formation in vitro. En outre, la simplicité du système rend l’interprétation de la façon dont Aβ affecte la formation de caillots de fibrine et la structure relativement simple. La dernière publication de ce laboratoire, il a été démontré que ces tests peuvent servir à tester les composés pour leur capacité à inhiber l’Aβ-fibrinogène interaction13,

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Auteurs remercient Masanori Kawasaki, Kazuyoshi Aso et Michael Foley de Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute (TDI), New York pour la synthèse d’inhibiteurs d’interaction Aβ-fibrinogène et leurs précieuses suggestions. Auteurs remercient également les membres du laboratoire Strickland de discussion utile. Ce travail a été soutenu par les NIH grant NS104386, Alzheimer Drug Discovery Foundation et fonds de développement thérapeutique Robertson pour H.A., NIH grant NS50537, la Tri-institutionnels Therapeutics Discovery Institute, Alzheimer Drug Discovery Foundation, Rudin Family Foundation et John A. Herrmann pour la S.S.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Fibriogen, Plasminogen-Depleted, PlasmaEMD Millipore341578keep lid parafilm wrapped to avoid exposure to moisture
Beta-Amyloid (1-42), HumanAnaspecAS-20276
Thrombin from human plasmaSigma-AldrichT7009
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol, Greater Than or Equal to 99%Sigma-Aldrich105228
DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO), STERILE-FILTEREDSigma-AldrichD2438
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Tris BaseFischer ScientificBP152
HEPESFischer ScientificBP310
NaClFischer ScientificS271
CaCl2Fischer ScientificC70
Filter Syringe, 0.2µM, 25mmPall4612
Millex Sterile Syringe Filters, 0.1 um, PVDF, 33 mm dia.MilliporeSLVV033RS
Solid 96 Well Plates High Binding Certified Flat BottomFischer Scientific21377203
Spectramax Plus384Molecular Devices89212-396
Centrifuge, 5417REppendorf5417R
Branson 200 Ultrasonic CleanerFischer Scientific15-337-22
Lab RotatorThermo Scientific2314-1CEQ
Spare washers for cover slip holderTousimis8766-01
Narrow Stem Pipets - Sedi-PetElectron Microscopy Sciences (EMS)70967-13
Sample holder for CPD (Cover slip holder)Tousimis8766
Mount Holder Box, Pin TypeElectron Microscopy Sciences (EMS)76610
Round glass cover slides (12 mm)Hampton ResearchHR3-277
10% GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences (EMS)16120
EthanolDecon Labs11652
24 well plateFalcon3047
Na CacodylateElectron Microscopy Sciences (EMS)11652
SEM Stubs, Tapered end pin.Electron Microscopy Sciences (EMS)75192
PELCO Tabs, Carbon Conductive Tabs, 12mm ODTed Pella16084-1
Autosamdri-815 Critical Point DryerTousimis
Denton Desk IV Coater with Gold/Palladium targetDenton Vacuum
Leo 1550 FE-SEMCarl Zeiss
Smart SEM SoftwareCarl Zeiss

Références

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