MicroARN pulmón perfilado a través de la el ciclo estral en ratones expuestos al ozono

Resumen

Aquí se describe un método para evaluar la expresión pulmonar de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios utilizando ratones expuestos al ozono o aire filtrado en las diferentes etapas del ciclo estral.

Resumen

Perfiles de microARN (miARN) ha sido de interés para los investigadores que trabajan en diversas áreas de investigación de biología y medicina. Los estudios actuales muestran un promisorio futuro de miRNAs en el diagnóstico y cuidado de enfermedades pulmonares. Aquí, se define un protocolo para miRNA perfilado para medir la abundancia relativa de un grupo de miRNAs predicho para regular genes inflamatorios en el tejido pulmonar de un modelo de ratón de inflamación de las vías respiratorias inducida por ozono. Ya se ha demostrado que los niveles de hormonas sexuales circulantes pueden afectar la regulación de la inmunidad innata del pulmón en las mujeres, el propósito de este método es describir un inflamatorio miRNA perfiles de protocolo en los ratones hembra, teniendo en cuenta el ciclo estral etapa de cada animal en el momento de exposición al ozono. Nos dirigimos también a enfoques de la bioinformática aplicable a miRNA descubrimiento y objetivo de los métodos de identificación usando limma, un software de R/Bioconductor, y software de análisis funcional para comprender el contexto biológico y vías asociadas con expresión diferencial de miRNA.

Introducción

microRNAs (miRNAs) son cortos (19 a 25 nucleótidos), que ocurre naturalmente, no-codificación moléculas de ARN. Secuencias de miRNAs son evolutivas conservada entre especies, lo que sugiere la importancia de los miRNAs en la regulación de funciones fisiológicas¹. perfiles de expresión de microRNA ha demostrado para ser útil para la identificación de miRNAs que son importantes en la regulación de una variedad de procesos, incluyendo la respuesta inmune, diferenciación celular, desarrollo y apoptosis². Más recientemente, miRNAs han sido reconocidos por su uso potencial en el diagnóstico de la enfermedad y terapéutica. Para los investigadores estudiando mecanismos de regulación génica, medición de expresión de miRNA puede iluminar modelos de nivel de sistemas de procesos regulatorios, especialmente cuando miRNA información se combina con perfiles de mRNA y otros datos de genoma-escala³. Por otro lado, los miRNAs también han demostrado ser más estable que los mRNAs en una gama de tipos de muestra y también son mensurables con mayor sensibilidad a las proteínas⁴. Esto ha llevado a un interés considerable en el desarrollo de miRNAs como biomarcadores para diversas aplicaciones diagnóstico moleculares, incluyendo enfermedades pulmonares.

En el pulmón, los miRNAs desempeñan papeles importantes en procesos de desarrollo y el mantenimiento de la homeostasis. Por otra parte, su expresión anormal se ha asociado con el desarrollo y progresión de varias enfermedades pulmonares⁵. Neumopatía inflamatoria inducida por contaminación del aire ha demostrado mayor severidad y peor pronóstico en las mujeres, lo que indica que las hormonas y el ciclo estral pueden regular pulmón innata inmunidad y miRNA expresión en respuesta a retos ambientales ⁶. en el presente Protocolo, utilizamos la exposición al ozono, que es un componente importante de la contaminación atmosférica, para inducir una forma de inflamación del pulmón en ratones hembra que se produce en ausencia de inmunidad adaptativa. Mediante el uso de ozono, estamos induciendo el desarrollo de hipersensibilidad de las vías respiratorias que se asocia con daño a las células epiteliales de las vías respiratorias y un aumento de neutrófilos y mediadores inflamatorios en las vías respiratorias proximales⁷. Actualmente, no existen protocolos bien-descritos para caracterizar y analizar miRNAs en el ciclo estral en ratones expuestos al ozono.

A continuación, describimos un método simple para identificar las etapas del ciclo estral y la expresión de miRNA en el tejido de pulmón de ratones femeninos expuestos a ozono. También abordamos enfoques eficaces bioinformática a miRNA de descubrimiento y objetivo de identificación, con énfasis en biología computacional. Analizamos los datos de microarray utilizando limma, un software de R/Bioconductor que proporciona una solución integrada para el análisis de datos del gene expresión experimentos⁸. Análisis de datos de matriz PCR de limma tiene una ventaja en términos de poder sobre procedimientos de prueba t de base cuando se utiliza un número pequeño de muestras de matrices para comparar la expresión. Para comprender el contexto biológico de los resultados de expresión de miRNA, entonces utilizamos el software de análisis funcional. Para entender los mecanismos de regulación transcripcionales cambios y predecir resultados probables, el software combina conjuntos de datos de expresión de miRNA y el conocimiento de la literatura⁹. Esto es una ventaja en comparación con el software que sólo buscan enriquecimiento estadístico en superposición a conjuntos de miRNAs.

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Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Penn State University.

1. evaluación de la fase del ciclo estral

1. Frenar correctamente una hembra de ratón C57BL/6 (8-9 semanas) utilizando la técnica de sujeción con una sola mano ratón descrita en Machholz et al¹⁰.
2. Llenar la pipeta plástica estéril con 10 μL de agua ultra pura.
3. Introduzca la punta de la pipeta de plástico en la vagina.
4. Suavemente Limpie el líquido de 4 a 5 veces para recolectar la muestra.
5. Coloque el final flush que contiene fluido vaginal en un portaobjetos de vidrio.
6. Observar la descarga vaginal sin manchas debajo de un microscopio óptico con un objetivo de 20 x.
   Nota: Animales que no muestran ciclos regulares por seudoembarazo u otras causas deben ser excluidos con el experimento. Se recomienda realizar las secreciones vaginales diario durante al menos tres ciclos consecutivos confirmar la ciclicidad.

2. exposición al ozono

1. Colocar un máximo de 4 ratones en dos recipientes de vidrio de 1,2 L con tapas de malla de alambre y agua ad libitum.
2. Poner un recipiente de vidrio en la cámara de ozono y el otro en la sala de exposición de aire filtrado.
3. Ajustar la concentración de ozono a los niveles de ozono de 2 ppm y monitor regularmente.
   Nota: El aparato de ozono proporciona un flujo de aire regulado (> 30 cambios por hora del aire) con control temperatura (25 ° C) y humedad relativa (50%). El sistema genera ozono por un descarga eléctrica el ozonizador, que es supervisado y controlado por un analizador de ozono ULTRAVIOLETA y controladores de flujo másico, como se describió anteriormente¹¹.
4. Eliminar envases de vidrio después de 3 horas de exposición al aire ozono/filtrada. Devolver los animales a la jaula con ropa de cama, comida y agua ad libitum.

3. pulmón colección

1. 4 h después de la exposición, anestesiar animales con una inyección intraperitoneal de un ketamina/xilacina cóctel (90 mg/kg ketamina, 10 mg/kg xilacina).
   Nota: Para confirmar un nivel adecuado de anestesia, compruebe el ratón para un pedal reflex (pellizco firme del dedo del pie) y ajustar la anestesia cuando sea necesario.
2. Humedezca la piel de ratón con etanol al 70%.
3. Haga una incisión de línea media de 2 cm con un funcionamiento de la tijera y pinzas quirúrgicas para exponer la vena cava.
4. Sacrificio de ratones por sección transversal de la vena cava y aorta. Si es necesario, introduzca una aguja de calibre 21 G en la vena cava por encima de las venas renales para recoger la sangre antes de exsanguination. Por otra parte, recoger la sangre mediante punción del corazón siguiendo protocolos estándar.
5. Utilice una tijera quirúrgica para abrir la cavidad abdominal y retire la piel superior del músculo, moviéndose hacia arriba hacia las costillas.
6. Usar una tijera quirúrgica para perforar el diafragma.
   Nota: Los pulmones se derrumbará de diafragma.
7. Corte la caja torácica usando una tijera quirúrgica para exponer el corazón y los pulmones.
8. Con unas pinzas, tomar una libre de Rnasa tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y sumergir en nitrógeno líquido para llenar el tubo.
   Nota: Utilizar gafas y guantes protectores para manipular nitrógeno líquido.
9. Eliminar de los pulmones, colocarlos en tubos libres de Rnasa microcentrífuga 1.5ml, llenados de nitrógeno líquido a presión-congelar el tejido y esperar unos segundos hasta que se evapore el líquido.
10. Cierre la tapa del tubo y almacenar el tejido a-80 ° C hasta su uso.

4. ARN preparación

1. Pulverizar todo pulmones usando un pulverizador de acero inoxidable tejido.
   Nota: El pulverizador de tejido debe colocarse en nitrógeno líquido antes de utilizarlo. Limpiar el pulverizador después de cada uso con solución de Rnasa.
2. Divide los pulmones pulverizados y coloque en dos tubos de 1,5 mL (medio pulmón).
3. Añadir 500 μl de guanidinio tiocianato por el tubo de muestra y mezclar.  Homogeneizar cada muestra usando 18 G, 21 G y agujas 23 G, respectivamente.
   Nota: Muestras pueden ser enriquecidas con 5.6 x 10⁸ copias de un pequeño RNA spike en el control (de una especie diferente) antes de proceder a la extracción.
4. Añadir 500 μl de etanol a cada muestra y agitar durante 15 s.
5. Carga de la mezcla en una columna de spin en un tubo y centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto deseche el flujo a través.
6. Para DNase I tratamiento (en-columna);
   1. Añadir 400 μL de RNA Wash Buffer y centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto.
   2. En un tubo libre de Rnasa, añadir 5 μl de DNasa I y 75 μl de 1 x digestión de DNA tampón y mezclar. Agregue la mezcla directamente en la matriz de la columna.
   3. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
7. Añadir 400 μL de solución especial para el prelavado de RNA a la columna y centrifugar a 12.000 x g durante 1 min descartar el flujo a través y repita este paso.
8. Añadir 700 μl de tampón de lavado del RNA a la columna y centrifugar a 12.000 x g durante 1 minuto deseche el flujo a través.
9. Centrifugar a 12.000 x g durante 2 min quitar el tampón restante. Transferir la columna en un tubo libre de Rnasa.
10. Para eluir el RNA, añadir 35 μl de agua libre de DNasa/Rnasa directamente a la columna matriz y centrifugar a 12.000 x g durante 1,5 minutos.
11. Medir la concentración de RNA total (260 nm) y pureza utilizando un espectrofotómetro. Siga las instrucciones para realizar la cuantificación de RNA en un 1,5 μl de muestra alícuota. En blanco el instrumento con agua libre de DNasa/Rnasa de elución.
    Nota: Una relación 260/280 de ~2.0 está generalmente aceptada como "puro" para el ARN. Concentración típica de RNA generalmente oscila entre los 750 y 2.500 ng/μl.
12. Tienda a-80 ° C.

5. miRNA perfilado

1. Retro-transcribir pequeños RNAs, uso 200 ng de RNA total.
   1. Preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa en el hielo (es el volumen total por reacción de 20 μl). Para cada reacción, añadir 4 μL de 5 x buffer, 2 μl de 10 x nucleótidos mezclan, 2 μl de transcriptasa reversa y 2 μl de agua libre de ARNasa. Mezclar todos los componentes y alícuota en 600 μl libre de Rnasa tubos de plástico (10 μl de la mezcla por reacción).
      Nota: La mezcla principal reverso-transcripción contiene todos los componentes requeridos para síntesis de cDNA primera cadena excepto plantilla de RNA.
      Nota: Calcular el volumen de exceso (10%) durante la preparación de la mezcla principal.
   2. Añadir la plantilla de RNA (200 ng de 10 μl) a cada tubo conteniendo mezcla principal reverso-transcripción. Mezcle, centrifugue durante 15 s a 1.000 x gy guardarlos en hielo hasta colocar en termociclador o bloque seco.
   3. Incubar por 60 min a 37 ° C.
   4. Incubar por 5 min a 95 ° C y coloque los tubos en hielo.
   5. Diluir el cDNA mediante la adición de 200 μL de agua libre de ARNasa a cada reacción de la reverso-transcripción de 20 μl.
2. Realizar PCR en tiempo real usando el ratón respuesta inflamatoria y autoinmunidad miRNA Array PCR.
   1. Preparar una mezcla de reacción (volumen total 1100 μL): para cada reacción, añadir 550 μl de 2 x PCR master mix, 110 μl de 10 x mezcla de imprimación universal, 340 μl de agua libre de ARNasa y 340 μl de cDNA de plantilla (reacción diluido del paso 5.1.5).
   2. Añadir 10 μl de la mezcla de reacción en cada pocillo de la miRNA pre-cargado matriz de PCR utilizando una pipeta multicanal.
   3. Sello de miRNA placa matriz de PCR con la película adhesiva óptica.
   4. Centrifugar la placa durante 1 min a 1.000 x g a temperatura ambiente para eliminar burbujas.
   5. Programa el cycler en tiempo real, paso de activación inicial de PCR durante 15 min a 95 ° C, 3 pasos desnaturalización que contienen bicicleta por 15 s a 94 ° C, recocido de 30 s a 55 ° C y la extensión de 30 s a 70 ° C durante 40 ciclos de número.
      Nota: Siga fabricante ciclismo condiciones instrucciones para configurar el cycler en tiempo real. Realizar el paso de la curva de disociación en el software de tiempo real cycler.
   6. Realizar análisis de datos.

6. Análisis de datos

1. Extraer valores de Ct de lo software PCR tiempo real para cada muestra en un software de análisis.
   Nota: Valor de un TAC de 34 se considera como atajo. Si las muestras contienen punto de control (por ejemplo,, cel-mir-39), normalizar valores de Ct para el aumento de control para cada muestra. Valores umbral deben configurarse manualmente. Valores de referencia se establecen automáticamente.
2. Normalizar los valores de Ct para el Ct promedio de seis controles de limpieza de miRNA: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, utilizando la siguiente ecuación:
   ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
3. Para pliegue cambiar cálculos, calcular los valores de ΔΔCt con una muestra específica como el control, utilizando la expresión relativa de ecuación¹²:
   expresión relativa de miRNA:
   2^{- ∆∆}Ct, donde - ∆∆Ct =-[∆Ct prueba - control ∆Ct]
   Nota: Un cambio doble de 200 se considera como atajo.
4. Doblez de exportación cambiar valores de expresión para realizar el análisis estadístico en R usando el paquete limma en Bioconductor⁸.
5. Corregir para comparaciones múltiples mediante el método de Benjamini-Hochberg¹³.
   Nota:  Una copia de la escritura de R está disponible en: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Conjuntos de datos y analizados los datos también están disponibles en el ómnibus de la expresión de genes bajo número GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. Análisis: Software de análisis funcional

1. Organizar el conjunto de datos. Incluyen miRNAs con su respectiva expresión log cocientes y valores p. Vea la tabla 1 para el formato de conjunto de datos específico.
2. Software de análisis funcional abierta (versión 01-10).
3. Subir el conjunto de datos utilizando el siguiente formato: formato de archivo: "Formato Flexible", contiene el encabezado de columna: "Sí", seleccione el tipo de identificador: "miRBase (maduro)", plataforma de matriz usada para experimentos: elegir la plataforma de la matriz.
   Nota: Acepta los formatos de archivos son txt (delimitado por tabulaciones archivos de texto), XLS (archivos excel) y .diff (archivos cuffdiff).
4. Seleccionar "Inferir observaciones" y verificar que el grupo experimental el etiquetado es correcto.
5. Ir a "Resumen de conjunto de datos" para revisar la cantidad total de miRNAs asignados y no asignados.
6. Haga clic en el botón "nuevo" en la parte superior izquierda del programa. Seleccione "Nuevo MicroRNA objetivo filtro" y cargar un dataset de microARN.
   1. Establece la fuente en: TarBase, ingenio expertos resultados, miRecords.
   2. Establece confianza en: experimentalmente observada o alta (predicho).
   3. Seleccione "Agregar columnas" para incluir una variedad de información biológica acerca de los objetivos como especies, enfermedades, tejidos, vías y mucho más.
   4. Para centrarse en objetivos que han cambiado la expresión en el experimento, seleccione "añadir / reemplazar mRNA dataset". Usa "la Asociación de la expresión" para situar los microRNAs con los niveles de expresión de igual o diferente.
      Nota: El análisis de filtro proporcionará microRNA nombres y símbolos, objetivos del mRNA, la fuente que describe la relación de destino y el nivel de confianza de la relación prevista (figura 2).
7. Haga clic en "Añadir a mi camino" para enviar el conjunto de datos filtrado a un lienzo de camino y explorar relaciones biológicas más.
8. Usar ruta Designer para crear un modelo de calidad de la publicación de efectos de microARN.
9. Una opción alternativa es hacer un análisis de la base.
   1. Tipo de análisis de base, seleccione "Análisis de la expresión".
   2. Tipo de medida, seleccione "Expr registro relación".
   3. Resumen de análisis de filtro: considera sólo moléculas o relaciones donde: (especie = ratón) y (confianza = observadas experimentalmente) y (fuentes de datos = "Ingenio experto los resultados", "Ingenio ExpertAssist hallazgos", "miRecords", "TarBase", o " TargetScan humanos").
   4. Seleccione un atajo de valor p = 0.05.
   5. Ejecutar el análisis.
      Nota: El informe incluirá: vías canónicas, análisis de reguladores aguas arriba, enfermedades y funciones, de los efectos del regulador, redes, moléculas y más.

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Resultados

Los diferentes tipos celulares observados en los frotis se utilizan para identificar la etapa del ciclo estral del ratón (figura 1). Estos están identificados por la morfología de la célula. Durante el proestro, las células son casi exclusivamente agrupaciones de células epiteliales nucleadas en forma de redondo, bien formadas (figura 1A). Cuando el ratón está en la etapa de estro, las células son células epiteliales sq...

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Discusión

Perfiles de microARN es una técnica ventajosa para investigación mecanicista y diagnosis de la enfermedad. En este manuscrito, se definió un protocolo para evaluar la expresión de miRNAs que se predicen para regular genes inflamatorios en los pulmones de ratones femeninos expuestos a ozono en etapas del ciclo estral diferentes. Métodos para la determinación del ciclo estral, como el método de detección visual, han sido descrito¹⁶. Sin embargo, estos dependen de las mediciones de una sola v...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664	8 weeks old
UltraPure Water	Thermo Fisher Scientific	10813012
Sterile plastic pipette	Fisher Scientific	13-711-25	Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	2951TS
Light microscope	Microscope World	MW3-H5	10x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein Animal Health	55853	90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Laboratories	139-236	10 mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100	Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needle	BD Biosciences	305165
Syringe	Fisher Scientific	329654	1 mL
Operating Scissors	World Precision Instruments	501221, 504613	14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit	World Precision Instruments	504616
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers	Fisher Scientific	08-418-1	Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	AM12400	1.5 mL
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus	Zymo Research	R2071
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
miScript II RT kit	Qiagen	218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array	Qiagen	MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes	Thermo Fisher Scientific	AM12225	for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control	Qiagen	219610
Microsoft Excel	Microsoft Corporation		https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen		https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software	The R Foundation		https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block	General Lab Supplier
Microcentrifuge	General Lab Supplier
Real-time PCR cycler	General Lab Supplier
Multichannel pipettor	General Lab Supplier
RNA wash buffer	Zymo Research	R1003-3-48	48 mL
DNA digestion buffer	Zymo Research	E1010-1-4	4 mL
RNA pre-wash buffer	Zymo Research	R1020-2-25	25 mL
Ultraviolet ozone analyzer	Teledyne API	Model T400	http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers	Sierra Instruments Inc	Flobox 951/954	http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html