JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada biz akciğer ifade değerlendirmek için bir yöntem tarif tahmin edilmektedir miRNAs inflamatuar genler düzenleyen fare kullanarak ozon için maruz veya hava estrous döngüsünün farklı aşamalarında filtre.

Özet

MikroRNA (miRNA) profil oluşturma biyoloji ve tıp çeşitli araştırma alanlarında çalışan araştırmacıların ilgi haline gelmiştir. Mevcut çalışmalar tanı ve akciğer hastalıkları Bakımı miRNAs kullanarak gelecekteki bir umut verici göster. Burada, biz miRNA inflamatuar bir ozon kaynaklı hava yolu iltihabı fare modeli akciğer dokusundan genlerinde düzenleyen tahmin miRNAs bir grup göreli bolluk ölçmek için profil oluşturma için bir iletişim kuralı tanımlar. Çünkü seks hormon düzeyleri dolaşan akciğer doğuştan gelen bağışıklık dişilerde Yönetmeliği etkileyebilir gösterilmiştir, bu yöntemin amacı protokolü dikkate alındığında estrous döngüsü dişi farelerde profil oluşturma bir enflamatuar miRNA tarif etmektir Her hayvan ozon pozlama zaman aşaması. Biz de limma, bir R/Bioconductor yazılım kullanarak miRNA bulma ve hedef tanımlama yöntemleri uygulanabilir Biyoinformatik yaklaşımlar adresi ve biyolojik bağlam ve yolları anlamaya fonksiyonel analiz yazılımı ile ilişkili fark miRNA ifade.

Giriş

mikroRNA (miRNAs) çoğu kısa (19-25 nukleotid), doğal olarak meydana gelen, kodlamayan RNA molekülleri. MiRNAs dizisi evrimsel türlerin fizyolojik fonksiyonları1düzenlenmesinde miRNAs önemini telkin, karşıdan karşıya korunmuş. mikroRNA ifade profil oluşturma işlemleri, bağışıklık yanıtı, hücre farklılaşması, gelişimsel süreçleri ve Apoptozis2de dahil olmak üzere çeşitli Yönetmelikte önemli miRNAs belirlemek için yardımcı olmak için kanıtlanmıştır. Daha yakın zamanlarda, miRNAs potansiyel kullanımları hastalığı teşhis ve tedavi için kabul edilmiştir. Özellikle miRNA bilgi mRNA profil oluşturma ve diğer genom ölçekli veri3ile birleştirildiğinde gen düzenlemesi mekanizmaları eğitim araştırmacılar için miRNA ifade ölçme sistemleri düzey modelleri düzenleyici işlemlerin aydınlatmak olabilir. Öte yandan, miRNAs mRNA'ların örnek türleri bir dizi daha kararlı olmak da gösterilmiş ve aynı zamanda protein4' ten büyük hassasiyetle ölçülebilir. Akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli moleküler tanı uygulamaları için biyolojik olarak miRNAs gelişiminde büyük ilgi yol açmıştır.

Akciğer miRNAs gelişimsel süreçleri ve homeostasis bakımında önemli rol oynarlar. Ayrıca, onların anormal ifade gelişme ve ilerleme çeşitli göğüs hastalıkları5ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Hava kirliliği tarafından indüklenen inflamatuar akciğer hastalığı büyük önem ve hormonlar ve estrous döngüsü akciğer doğuştan gelen bağışıklık ve miRNA ifade yanıt çevre sorunları olarak düzenleyen gösteren dişilerde yoksul prognoz göstermiştir 6. bu protokol için biz edinilmiş bağışıklığın yokluğunda oluşur dişi farelerde akciğer iltihabı şeklinde ikna etmek için hava kirliliği önemli bir bileşenidir, ozon pozlama kullanın. Ozon kullanılarak, hava yolu epitel hücre hasarı ve nötrofil artış ve proksimal airways7inflamatuar aracılar ile ilişkili hava yolu hyperresponsiveness gelişimi inducing. Şu anda değil karakterize ve ozon günese maruz kalan farelerde estrous döngüsü boyunca miRNAs analiz için iyi tarif protokolleri vardır.

Aşağıda, estrous döngüsü aşamaları ve ozon için maruz dişi farelerin akciğer dokusunda miRNA ifade tanımlamak için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca miRNA bulma ve hedef tanımlama, İşlemsel Biyoloji üzerine vurgu ile etkili Biyoinformatik yaklaşımlar ele. Biz limma, gen ifade deneyler8verileri analiz etmek için tümleşik bir çözüm sağlar bir R/Bioconductor yazılım kullanarak Mikroarray veri analiz. Analizini PCR dizi verileri limma diziler/örnekler az sayıda ifade karşılaştırmak için kullanırken t-test dayalı prosedürleri güç açısından avantaj vardır. MiRNA ifade sonucu biyolojik bağlamında anlamak için o zaman fonksiyonel analiz yazılımını kullanmıştır. Transkripsiyon değişiklikleri düzenleyen mekanizmalar anlamak için ve olası sonuçları tahmin etmek belgili tanımlık bilgisayar yazılımı miRNA-ifade veri kümeleri ve bilgi edebiyat9birleştirir. Bu sadece miRNAs kümeleri için üst üste yapılan istatistiksel zenginleştirme arayın yazılım ile karşılaştırıldığında bir avantajdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Penn State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Estrous döngüsü aşamasını değerlendirilmesi

  1. Düzgün bir erkek C57BL/6 fare (8 – 9 haftalık) kullanarak Machholz ve ark.10içinde açıklanan tek el fare kısıtlama tekniği dizginlemek.
  2. Steril plastik pipet 10 μL ultra saf su ile doldurun.
  3. Plastik pipet ucu vajina içine tanıtmak.
  4. Yavaşça sıvı 4-5 kez sifonu örnek toplamak için.
  5. Bir cam slayt üzerinde vajinal sıvı içeren son floş yerleştirin.
  6. 20 x amacı ile hafif bir mikroskop altında günahı vajinal floş gözlemlemek.
    Not: Pseudopregnancy ya da diğer sebepler nedeniyle normal döngüsü gösterme hayvanlar deneyden dışlanmaları gerekir. Bu endüstriyel onaylamak en az üç ardışık döngüleri için günlük vajinal salgılar gerçekleştirmek için tavsiye edilir.

2. Ozon maruz

  1. En fazla 4 fareler iki 1,2 L cam kaplar tel kafes kapakları ve su ile ad libitum yerleştirin.
  2. Ozon odası ve diğer filtre uygulanmış hava pozlama odasında bir cam kap koymak.
  3. Ozon konsantrasyonu 2 ppm ve monitör ozon seviyelerine düzenli olarak ayarlayın.
    Not: Ozon aparatı düzenlenmiş bir hava akımı sağlar (> 30 hava değişiklikleri/h) ile (% 50) sıcaklığı (25 ° C) ve bağıl nem kontrollü. Sistem tarafından izlenen ve11daha önce açıklandığı gibi bir ultraviyole ozon analizörü ve kitle akış kontrolcüler, tarafından kontrol edilen bir elektrik deşarj ozonizer ozon üretir.
  4. Cam kaplar ozon/filtre hava pozlama 3 h sonra kaldırın. Hayvan yatak, gıda ve su ad libitum ile kafes dönmek.

3. akciğer koleksiyonu

  1. 4 h pozlama sonra bir ketamin/xylazine kokteyl (90 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazine) mayi bir enjeksiyon hayvanlarla anestezi.
    Not: Anestezi uygun bir düzeyde onaylamak için kontrol edin bir pedal için fare (firma ayak tutam) refleks ve anestezi gerektiği gibi ayarlayın.
  2. % 70 etanol ile fare cildinizi nemlendirin.
  3. Vena kava ortaya çıkarmak için bir işletim makas ve cerrahi Cımbız kullanarak bir 2 cm ensizyon olun.
  4. Fareler tarafından vena kava ve aort transeksiyon kurban. Gerekirse, kan kan kaybı önce toplamak için böbrek damarları yukarıda vena kava 21 G gauge iğne takın. Alternatif olarak, kan yolu ile kalp ponksiyon standart protokolleri takip toplamak.
  5. Cerrahi makas karın kesip ve cilt/üst kas, yukarı doğru kaburga hareket kaldırmak için kullanın.
  6. Cerrahi makas diyafram ponksiyon için kullanın.
    Not: Akciğerler uzak diyafram çökecek.
  7. Kalp ve akciğerler duyurmak cerrahi makas kullanarak göğüs kafesi kes gitsin.
  8. Forseps kullanarak, 1.5 mL microcentrifuge tüp RNase free al ve sıvı azot tüpü doldurmak için daldırın.
    Not: Sıvı azot işlemek için gözlük ve koruyucu eldiven kullanın.
  9. Akciğerleri kaldırmak, onları RNase free microcentrifuge 1,5 mL tüpler ek-doku dondurmak için sıvı azot ile dolu içine koyun ve sıvı buharlaşarak kadar birkaç saniye bekleyin.
  10. Tüp kapağını kapatın ve-80 ° C'de doku kullanmak kadar saklamak.

4. RNA hazırlık

  1. Tüm akciğer bir paslanmaz çelik dokusu Montaj cihazları-Pulverizatör kullanarak ezmek.
    Not: Doku Montaj cihazları-Pulverizatör sıvı azot içinde kullanmak için önceden yerleştirilmesi gerekiyor. Montaj cihazları-Pulverizatör RNAse çözümü ile her kullanımdan sonra temiz.
  2. Toz akciğerler bölünmüş ve iki 1,5 mL tüpler (yarım her akciğer) içine yerleştirin.
  3. Guanidinium thiocyanate örnek tüp başına 500 µL ekleyip karıştırın.  18 G, 21 G ve 23 G iğneler, sırasıyla kullanarak her örnek lunaparkçı.
    Not: Örnekleri 5,6 x 108 kopya küçük RNA spike bileşenini denetimden (farklı bir tür) çıkarma işlemine devam etmeden önce ile çivili.
  4. Her örnek ve 15 için girdap etanol 500 µL eklemek s.
  5. Yük karışımı bir spin sütunundaki bir koleksiyon tüp ve 1 dk. 12.000 x g , santrifüj atmak akışı aracılığıyla.
  6. DNaz için ben tedavi (içinde sütun);
    1. RNA yıkama arabellek ve santrifüj 400 µL 12.000 x g 1 dk. için ekleyin.
    2. RNase free tüp içinde 5 ekleyin µL DNaz, ben ve DNA sindirim x 1 75 µL tampon ve karıştırın. Mix doğrudan sütun matris ekleyin.
    3. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  7. Sütun ve 1 dk. atma akışı üzerinden 12.000 x g , santrifüj 400 µL RNA prewash çözüm ekleyin ve bu adımı yineleyin.
  8. 700 µL RNA yıkama arabelleği sütun ekleyin ve 1 dakika süreyle santrifüj 12.000 x g de atın akışı aracılığıyla.
  9. 12.000 x g kalan arabellek kaldırmak 2 min için de santrifüj kapasitesi. Sütun bir RNase free tüp içine aktarın.
  10. RNA elute sütun matris ve 12.000 x g , santrifüj 1,5 dk 35 µL DNaz/RNase-ücretsiz su ekleyin.
  11. Ölçmek toplam RNA konsantrasyonu (260 nm) ve saflık bir spektrofotometre kullanarak. RNA miktar bir 1,5 µL örnekte aliquot gerçekleştirmek için yönergeleri izleyin. DNaz/RNase-ücretsiz su elüsyon için kullanılan ile araç boş.
    Not: ~2.0 260/280 oranında genellikle "gibi saf" RNA için kabul edilir. Tipik RNA konsantrasyonu genellikle 750 ve 2500 ng/µL arasında değişmektedir.
  12. Mağaza-80 ° C'de

5. miRNA profil oluşturma

  1. Küçük RNA'lar, kullanım 200 ng toplam RNA'ın Retro uyarlamak için.
    1. (Toplam reaksiyon başına 20 µL birimdir) buz üzerinde ters transkripsiyon tepki karışımı hazırlayın. Her reaksiyon için 4 µL 5 x arabellek, nükleotit mix 10 x 2 µL, ters transkriptaz 2 µL ve 2 µL RNase free su ekleyin. Mix tüm bileşenleri ve aliquot 600 µL RNAse free Plastik tüpler (Mix tepki başına 10 µL).
      Not: Ters transkripsiyon ana şablon RNA dışında ilk iplikçikli cDNA sentezi için gerekli tüm bileşenleri içermektedir.
      Not: Aşırı cilt (% 10) ana karışımı hazırlarken hesaplayın.
    2. RNA şablonu ekleme (200 ng 10 µL) Ters transkripsiyon ana karışımı içeren her tüp için. Mix, santrifüj 15 1000 x g, s ve buza thermocycler veya kuru blok yerleştirme kadar saklayabilirsiniz.
    3. 37 ° C'de 60 dk için kuluçkaya
    4. 95 ° C'de 5 min için kuluçkaya ve tüpler buza koyun.
    5. CDNA her 20 µL Ters transkripsiyon tepki 200 µL RNase free su ekleyerek sulandırmak.
  2. Gerçek zamanlı PCR fare inflamatuar yanıt ve otoimmünite miRNA PCR dizi kullanarak gerçekleştirin.
    1. Bir reaksiyon mix (Toplam hacim 1100 µL) hazırlamak: 550 µL 2 x PCR ana Mix, 10 evrensel astar mix x 110 µL, 340 µL RNase free su ve şablon cDNA (adım 5.1.5 seyreltilmiş reaksiyon) 340 µL her tepki için ekleyin.
    2. Reaksiyon Mix 10 µL PCR çok kanallı bir pipettor kullanarak dizi önceden yüklenmiş miRNA her şey için ekleyin.
    3. MiRNA PCR dizi plaka optik yapıştırıcı film ile kapatın.
    4. 1 dk 1000 x g kabarcıklar kaldırmak için oda sıcaklığında az plaka santrifüj kapasitesi.
    5. Program gerçek zamanlı cycler, PCR ilk harekete geçirmek için 95 ° C'de 15 dakika, adım 3-adım Bisiklete binme içeren denatürasyon 15 94 ° C'de 30 için TAV, s s 55 ° C ve uzantısı için 30 s 40 70 ° C'de devir sayısı.
      Not: Takip üreticisinin Bisiklete binme talimatları kadar gerçek zamanlı cycler ayarlamak için koşullar. Gerçek zamanlı cycler yazılımı yerleşik ayrılma eğrisi adımı gerçekleştirin.
    6. Veri çözümlemesi gerçekleştirin.

6. veri analizi

  1. CT değerleri bir analiz yazılımı her örnek için gerçek zamanlı PCR yazılım ayıklayın.
    Not: 34 A Ct değerini kesme kabul edilir. Örnekleri spike denetimi (örneğin, cel-mir-39) içeriyorsa, ani artış her örnek için denetimi için Ct değerleri normalize. Eşik değerleri el ile ayarlamanız gerekebilir. Temel değerlerini otomatik olarak ayarlanır.
  2. Altı miRNA temizlik denetimleri ortalama ct ct değerleri normalize: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, aşağıdaki denklemi kullanarak:
    ΔCt (Ct_Target − Ct_housekeeping) =
  3. Kat için hesaplamaları değiştirebilir, belirli bir örnek göreli ifade denklem12kullanarak denetimi kullanarak ΔΔCt değerleri hesaplamak:
    miRNA göreli ifade:
    2-∆∆Ct, nerede - ∆∆Ct =-[∆Ct test - ∆Ct kontrol]
    Not: 200 kat değişimine kesim kabul edilir.
  4. İhracat kat Bioconductor8' limma paketi kullanarak r istatistiksel analiz gerçekleştirmek için ifade değerleri değiştirin.
  5. 13Benjamini-Hochberg yöntemini kullanarak birden çok karşılaştırmaları için düzeltin.
    Not:  R senaryonun bir kopyasını elde edilebilir vasıl: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Veri kümeleri ve analiz veri are da elde edilebilir, gen ifade Omnibus numarası GSE111667 altında https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. veri analizi: Fonksiyonel analiz yazılımı

  1. Veri kümesi düzenleyin. MiRNAs ile onların anılan sıraya göre ifade Günlük oranları ve p-değerleri içerir. Belirli veri kümesi biçimlendirmek için bkz: Tablo 1 .
  2. Açık fonksiyonel analiz yazılımı (sürüm 01-10).
  3. Aşağıdaki biçimi kullanarak veri kümesi upload: dosya biçimi: "Esnek Format", sütun üstbilgisi içerir: "Evet", tanımlayıcı türünü seçin: "miRBase (Olgun)", deneyler için kullanılan dizi platformu: dizi platform seçebilir.
    Not: Dosya biçimleri .txt kabul edilmektedir (sekmeyle sınırlandırılmış metin dosyaları), .xls (excel dosyaları) ve .diff (cuffdiff dosyaları).
  4. "Sonucuna gözlemler" seçin ve deney grubu etiketleme doğru olduğundan emin olun.
  5. "Veri kümesi eşlenen ve eşlenmemiş miRNAs toplam miktarını gözden geçirmek için Özet" için gidin.
  6. Üst "yeni" düğmesine tıkladığınızda program yaptı. "Yeni mikroRNA hedef filtresi" seçin ve mikroRNA veri kümesi yükleyin.
    1. Ayarlanmış kaynak: TarBase, marifet uzmanlar bulgular, miRecords.
    2. Güven ayarla: deneysel olarak gözlenen veya yüksek (tahmin).
    3. "Eklemek çeşitli türler, hastalıklar, dokular, yollar ve daha fazla gibi hedefleri hakkında biyolojik bilgiler eklenecek sütunları" seçin.
    4. İfade deneyinde değişti hedeflerine odaklanmak için seçin "Ekle / mRNA veri kümesini değiştirmek". "Eşleştirme ifade" mikroRNA'lar aynı veya farklı ifade düzeyleri ile bulmak için kullanın.
      Not: Filtre analiz mikroRNA adları ve semboller, mRNA hedefleri, hedef ilişki ve tahmin edilen ilişki (Şekil 2) güven düzeyini tanımlayan kaynak sağlar.
  7. "Eklemek için My filtre uygulanmış veri kümesi bir yolu tuvale göndermek ve daha fazla biyolojik ilişkileri keşfetmek için yolu"'ı tıklatın.
  8. Yol bir yayın kalitesinde model mikroRNA efektleri oluşturmak için Designer'ı kullanın.
  9. Diğer bir seçenek bir çekirdek analiz oluşturmaktır.
    1. Temel analiz türü için "İfade analizi" seçin.
    2. Ölçüm türü için "Expr günlük oranı" seçin.
    3. Analiz filtre Özeti: yalnızca molekülleri ve/veya ilişkileri düşünün nerede: (tür fare =) ve (güven deneysel olarak gözlenen =) ve (veri kaynakları = "Marifet uzman bulgular", "Marifet ExpertAssist bulgular", "miRecords", "TarBase", veya " TargetScan insan").
    4. P-değeri bir kesim seçin = 0,05.
    5. Analizi yap.
      Not: Rapora dahil edilir: kanonik yolları, ters yönde düzenleyiciler analiz, hastalıklar ve işlevler, düzenleyici etkileri, ağlar, moleküller ve daha fazlası.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Smear içinde gözlenen farklı hücre tipleri fare estrous döngüsü aşamasını (Şekil 1) tanımlamak için kullanılır. Bunlar hücre morfolojisi tarafından tanımlanır. Proestrus sırasında neredeyse sadece kümeleri yuvarlak şekilli, iyi biçimlendirilmiş çekirdekli epitel hücresi (Şekil 1A) hücrelerdir. Fare estrus aşamasında olduğunda, cornified skuamöz epitel hücreleri, yoğun paketlenmiş kümelerinde (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

MikroRNA profil oluşturma hastalık tanı ve mekanik araştırma için avantajlı bir tekniktir. Bu makale, ozon için farklı estrous döngüsü aşamaları içinde maruz dişi farelerin akciğerlerde inflamatuar genler düzenleyen tahmin edilmektedir miRNAs ifade değerlendirmek için bir protokol tanımlı. Yöntemleri gibi görsel algılama yöntemi, estrous döngüsü belirlenmesi için açıklanan16olmuştur. Ancak, bu tek seferlik ölçümler güveniyor ve bu nedenle güvenilir değildir. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir ilgi alanlarına sahip bildirin.

Teşekkürler

Bu araştırma hibe NIH K01HL133520 (PS) ve K12HD055882 (PS) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr Joanna Floros ozon pozlama deneyleri ile yardım için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6J miceThe Jackson Laboratory0006648 weeks old
UltraPure WaterThermo Fisher Scientific10813012
Sterile plastic pipetteFisher Scientific13-711-25Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope SlidesThermo Fisher Scientific2951TS
Light microscopeMicroscope WorldMW3-H510x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USPHenry Schein Animal Health5585390 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile SolutionLloyd Laboratories139-23610 mg/kg. Controlled Drug.
EthanolFisher ScientificBP2818100Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needleBD Biosciences305165
SyringeFisher Scientific3296541 mL
Operating ScissorsWorld Precision Instruments501221, 50461314 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer KitWorld Precision Instruments504616
Spectrum Bessman Tissue PulverizersFisher Scientific08-418-1Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge TubesThermo Fisher ScientificAM124001.5 mL
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026
Direct-zol RNA MiniPrep PlusZymo ResearchR2071
NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-W
miScript II RT kitQiagen218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR ArrayQiagenMIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubesThermo Fisher ScientificAM12225for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610
Microsoft ExcelMicrosoft Corporationhttps://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenhttps://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R SoftwareThe R Foundationhttps://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating blockGeneral Lab Supplier
MicrocentrifugeGeneral Lab Supplier
Real-time PCR cyclerGeneral Lab Supplier
Multichannel pipettorGeneral Lab Supplier
RNA wash bufferZymo ResearchR1003-3-4848 mL
DNA digestion bufferZymo ResearchE1010-1-44 mL
RNA pre-wash bufferZymo ResearchR1020-2-2525 mL
Ultraviolet ozone analyzerTeledyne APIModel T400http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllersSierra Instruments IncFlobox 951/954http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

Referanslar

  1. Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
  2. Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
  3. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
  4. Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
  5. Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
  6. Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18(2018).
  7. Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
  8. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47(2015).
  9. Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
  10. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  11. Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
  14. Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
  15. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  16. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538(2012).
  17. Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
  18. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
  20. Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
  21. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
  22. Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
  23. Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
  24. Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
  25. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005(2015).
  26. Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
  27. Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 143hava kirlili iakci er miRNomebronchoalveolar lavajakci er iltihabcinsiyet hormonlarPCR dizilerestrous d ng svajinal smear

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır