Poumon microARN profilage à travers le œstrus chez les souris exposées à l’Ozone

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour évaluer l’expression de poumon des miARN qui est prévus pour réguler les gènes inflammatoires utilisant des souris exposées à l’ozone ou de l’air filtré à différents stades du cycle oestral.

Résumé

Profilage de microARN (miARN) est devenu d’intérêt pour les chercheurs qui travaillent dans divers domaines de recherche de biologie et de médecine. Les études actuelles montrent un prometteur future de l’utilisation des miARN dans le diagnostic et le soin des maladies pulmonaires. Ici, nous définissons un protocole pour miRNA profilage pour mesurer l’abondance relative d’un groupe des miARN prévues pour réguler les gènes inflammatoires dans le tissu pulmonaire, partir d’un modèle de souris de l’inflammation des voies respiratoires induite par l’ozone. Parce qu’il a été démontré que les niveaux de l’hormone sexuelle peuvent influer sur la régulation de l’immunité innée pulmonaire chez les femelles, cette méthode vise à décrire un miRNA inflammatoire protocole chez les souris femelles, prenant en considération le cycle oestral de profilage stade de chaque animal au moment de l’exposition à l’ozone. Nous abordons également approches bioinformatiques applicable miRNA découverte et cible méthodes d’identification Leduc, un logiciel R/Bioconductor, et logiciel d’analyse fonctionnelle pour comprendre le contexte biologique et les voies associées expression différentielle de miRNA.

Introduction

microARN (miARN) sont courts (19 à 25 nucléotides), naturels, non codantes des molécules d’ARN. Séquences de miARN sont évolutifs conservé selon les espèces, ce qui suggère l’importance des miARN dans la régulation des fonctions physiologiques¹. profil d’expression des micro-ARN a été prouvé pour être utile pour identifier les miARN qui sont importants dans la régulation de divers processus, y compris la réponse immunitaire, différenciation cellulaire, processus de développement et l’apoptose². Plus récemment, les miARN ont été reconnus pour leur utilisation potentielle dans le diagnostic de la maladie et la thérapeutique. Pour les chercheurs qui étudient les mécanismes de régulation génique, mesurant miRNA expression peut éclairer des modèles de systèmes au niveau des processus réglementaires, surtout quand les informations de miRNA sont fusionnées avec le profilage d’ADN messagère et autres données de génome-échelle³. En revanche, miARN ont également montré à être plus stables que les ARNm dans un éventail de types de spécimens et est également mesurables avec une plus grande sensibilité que les protéines⁴. Cela a conduit à un intérêt considérable dans le développement des miARN comme biomarqueurs pour diverses applications de diagnostiques moléculaires, y compris les maladies pulmonaires.

Dans le poumon, miRNAs jouent un rôle important dans le processus de développement et le maintien de l’homéostasie. En outre, leur expression anormale a été associée à l’apparition et la progression de diverses maladies pulmonaires⁵. La pneumopathie inflammatoire induite par la pollution de l’air a démontré une plus grande sévérité et pronostic moins favorable chez les femelles, ce qui indique que les hormones et le cycle oestral peuvent réglementer pulmonaire innée immunité et miRNA expression en réponse aux défis environnementaux ⁶. dans le présent protocole, nous utilisons exposition à l’ozone, qui est une composante majeure de la pollution atmosphérique, pour induire une forme d’inflammation des poumons chez les souris femelles qui se produit en l’absence d’immunité adaptative. En utilisant l’ozone, nous sommes induisant le développement d’hyperréactivité bronchique associé à la lésion des cellules épithéliales des voies respiratoires et une augmentation des neutrophiles et des médiateurs inflammatoires en proximal airways⁷. Actuellement, il n’y a pas des protocoles bien décrits pour caractériser et analyser des miARN tout le cycle oestral chez des souris exposées à l’ozone.

Ci-dessous, nous décrivons une méthode simple pour identifier les étapes du cycle oestral et miRNA expression dans les tissus pulmonaires chez des souris femelles exposées à l’ozone. Nous abordons également approches bioinformatiques efficace miRNA découverte et cible d’identification, en mettant l’accent sur la biologie computationnelle. Nous analysons les données microarray à l’aide de Leduc, un logiciel R/Bioconductor qui offre une solution intégrée d’analyse de données d’expression de gène des expériences⁸. Analyse des données de tableau PCR de Leduc a un avantage en termes de puissance sur les procédures de test t basé lorsque vous utilisez le petit nombre de tableaux/échantillons pour comparer l’expression. Pour comprendre le contexte biologique miRNA des résultats d’expression, nous avons ensuite utilisé le logiciel d’analyse fonctionnelle. Afin de comprendre les mécanismes de régulation transcriptionnelles changements et pour prédire les résultats probables, le logiciel combine les datasets miRNA-expression et connaissance de la littérature⁹. Il s’agit d’un avantage par rapport aux logiciels qu’il suffit de regarder pour l’enrichissement statistique dans le recoupement d’ensembles des miARN.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de la Penn State University.

1. évaluation de la phase du Cycle oestral

1. Bien retenir une femelle souris C57BL/6 (8-9 semaines) en utilisant la technique de retenue une main souris décrite dans Machholz et al.,¹⁰.
2. Remplir la pipette en plastique stérile avec 10 μL d’eau ultra pure.
3. Introduire l’embout de la pipette en plastique dans le vagin.
4. Doucement purger le liquide 4-5 fois pour prélever l’échantillon.
5. Placez l’éclat final contenant des sécrétions vaginales sur une lame de verre.
6. Observer l’éclat vaginale non colorée sous un microscope optique avec un objectif 20 x.
   Remarque : Les animaux qui ne présentent pas de cycles réguliers en raison de la pseudo-grossesse ou d’autres causes doivent être exclus de l’expérience. Il est recommandé d’effectuer des sécrétions vaginales quotidiennes au moins trois cycles consécutifs confirmer la cyclicité.

2. exposition à l’Ozone

1. Placer un maximum de 4 souris dans deux récipients en verre 1,2 L avec couvercles de maille de fil et de l’eau ad libitum.
2. Mettre un récipient en verre dans la chambre de l’ozone et l’autre dans la salle d’exposition de l’air filtré.
3. Ajuster la concentration d’ozone à des concentrations d’ozone 2 ppm et moniteur régulièrement.
   Remarque : L’appareil de l’ozone fournit un flux d’air régulé (> 30 changements/h d’air) avec contrôle de température (25 ° C) et humidité relative (50 %). Le système génère de l’ozone, un ozoniseur de décharge électrique, qui est surveillé et contrôlé par un analyseur d’ozone ultraviolet et contrôleurs de débit massique, comme décrit plus haut¹¹.
4. Supprimer les récipients en verre après 3 h d’exposition à l’air d’ozone/filtré. Retour animaux de cage avec literie, nourriture et eau ad libitum.

3. poumon Collection

1. 4 heures après l’exposition, anesthésier les animaux avec une injection intrapéritonéale d’un kétamine/xylazine cocktail (90 mg/kg de kétamine, xylazine 10 mg/kg).
   Remarque : Pour confirmer un niveau correct de l’anesthésie, vérifiez la souris pour une pédale reflex (pincement de l’orteil ferme) et réglez l’anesthésie si nécessaire.
2. Humidifier la peau de souris avec l’éthanol à 70 %.
3. Faire une incision médiane de 2 cm à l’aide d’un fonctionnement ciseaux et pinces chirurgicales pour exposer la veine cave.
4. Sacrifier la souris par résection de la veine cave supérieure et l’aorte. Si nécessaire, introduire une aiguille de calibre 21 G dans la veine cave supérieure les veines rénales à recueillir le sang avant l’exsanguination. Vous pouvez également prélever le sang par ponction cardiaque suite de protocoles standard.
5. Utiliser ciseaux chirurgicaux à ciel ouvert la cavité abdominale et enlever les muscles peau/haut, se déplaçant vers le haut vers les côtes.
6. Ciseaux chirurgicaux permet de perforer la membrane.
   Remarque : Poumons seront effondrera loin du diaphragme.
7. Découper la cage thoracique à l’aide de ciseaux chirurgicaux pour exposer le cœur et les poumons.
8. À l’aide de pinces, prendre un tube de microcentrifuge RNase-libre de 1,5 mL et il submerge dans l’azote liquide pour remplir le tube.
   Remarque : Utiliser des lunettes et des gants de protection pour gérer l’azote liquide.
9. Supprimer les poumons, placez-les dans le libre de RNase microtubes 1,5 mL à rempli d’azote liquide à snap-gel le tissu et attendez quelques secondes jusqu'à ce que le liquide s’évapore.
10. Fermer le couvercle du tube et conserver les tissus à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.

4. préparation d’ARN

1. Pulvériser des poumons entiers à l’aide d’un pulvérisateur de tissu en acier inoxydable.
   Remarque : Le pulvérisateur de tissu doit être placé dans l’azote liquide avant de l’utiliser. Nettoyer le pulvérisateur après chaque utilisation avec solution de RNAse.
2. Diviser les poumons pulvérisés et placer dans deux tubes de 1,5 mL (la moitié du poumon chaque).
3. Ajouter 500 µL de guanidinium thiocyanate par tube échantillon et mélanger.  Homogénéiser chaque échantillon à l’aide de 18 G, 21 G et aiguilles 23 G, respectivement.
   Remarque : Les échantillons peuvent être fortifiés avec 5,6 x 10⁸ exemplaires d’un petit RNA spike-en contrôle (d’une autre espèce) avant de procéder à l’extraction.
4. Ajouter 500 µL d’éthanol à chaque échantillon et vortexer pendant 15 s.
5. Charge le mélange dans une colonne dans un tube de prélèvement et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min. jetez l’accréditif.
6. Pour la DNase I traitement (en colonne) ;
   1. Ajouter 400 µL de RNA Wash Buffer et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min.
   2. Dans un tube exempt de RNase, ajouter 5 µL de DNase I et 75 µL de 1Ã de digestion de l’ADN de la mémoire tampon et mélanger. Ajouter le mélange directement à la matrice colonne.
   3. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
7. Ajouter 400 µL de solution de prelavage RNA à la colonne et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min. jetez les intermédiaires et répétez cette étape.
8. Ajouter 700 µL de tampon de lavage RNA à la colonne et centrifuger à 12 000 x g pendant 1 min. jetez l’accréditif.
9. Centrifuger à 12 000 x g pendant 2 min retirer le tampon restant. Transférer la colonne dans un tube de RNase-libre.
10. Pour éluer l’ARN, ajouter 35 µL d’eau exempte de DNase/RNase directement à la matrice colonne et centrifuger à 12 000 x g pendant 1,5 min.
11. Mesurer la concentration d’ARN totale (260 nm) et de la pureté à l’aide d’un spectrophotomètre. Suivez les instructions pour effectuer la quantification du RNA dans un échantillon de 1,5 µL aliquote. Blanc l’instrument avec de l’eau exempte de DNase/RNase utilisé pour l’élution.
    Remarque : Un ratio 260/280 de ~2.0 est généralement accepté comme « pure » pour l’ARN. Concentration d’ARN typique varie habituellement entre 750 et 2 500 ng/µL.
12. Conserver à-80 ° C.

5. miRNA profilage

1. Pour rétro-transcrire les petits ARN, utilisation 200 ng d’ARN total.
   1. Préparer le mélange de la réaction de transcription inverse sur la glace (volume total par réaction est 20 µL). Pour chaque réaction, ajouter 4 µL de 5 x 2 µL d’eau exempte de RNase, 2 µL de la transcriptase inverse, tampon et 2 µL de x 10 nucléotides mélangent. Mélanger tous les composants et l’aliquote dans 600 µL exempte de RNAse tubes en plastique (10 µL du mélange par réaction).
      Remarque : Transcription inverse master mix contient tous les composants requis pour la synthèse de cDNA de premier-brin sauf modèle RNA.
      Remarque : Calculer un volume excessif (10 %) lors de la préparation du mélange principal.
   2. Ajouter le modèle RNA (200 ng dans 10 µL) à chaque éprouvette contenant la transcription inverse mélange principal. Mélanger, centrifuger pendant 15 s à 1 000 x get de les stocker sur la glace jusqu’en plaçant dans le thermocycleur ou bloc sec.
   3. Incuber pendant 60 min à 37 ° C.
   4. Incuber 5 min à 95 ° C et placer les tubes sur la glace.
   5. Diluer le cDNA en ajoutant 200 µL d’eau exempte de RNase à chaque réaction de transcription inverse de 20 µL.
2. Effectuer une PCR en temps réel à l’aide de la souris la réponse inflammatoire et l’auto-immunité miRNA PCR Array.
   1. Préparer un mélange de réaction (volume total 1100 µL) : pour chaque réaction, ajouter 550 µL du mélange principal de 2 x PCR, 110 µL de 10 x mix amorce universelle, 340 µL d’eau exempte de RNase et 340 µL du modèle cDNA (réaction diluée de l’étape 5.1.5).
   2. Ajouter 10 µL du mélange réactionnel dans chaque loge de la miRNA pré-chargés tableau de PCR à l’aide d’une pipette multicanaux.
   3. Sceller le miRNA plaque PCR Array avec film adhésif optique.
   4. Centrifuger la plaque pendant 1 min à 1 000 x g à température ambiante pour enlever les bulles.
   5. Programmer le cycler en temps réel, à l’étape d’activation initiale de l’ACP à 95 ° C pendant 15 minutes, 3 étapes cyclisme contenant dénaturation pendant 15 s à 94 ° C, recuit pendant 30 s à 55 ° C et extension pendant 30 s à 70 ° C pendant 40 cycles nombre.
      Remarque : Instructions pour configurer le cycler en temps réel les conditions suivez fabricant vélo. Exécute l’étape de courbe de dissociation intégrée dans le logiciel de cycler en temps réel.
   6. Effectuer l’analyse des données.

6. analyse de données

1. Extraire les valeurs de Ct par le logiciel PCR en temps réel pour chaque échantillon dans un logiciel d’analyse.
   Remarque : Ct A valeur de 34 est considérée comme seuil de décision. Si les échantillons contiennent des épi-dans le contrôle (par exemple, cel-mir-39), normaliser les valeurs de Ct à la hausse de contrôle pour chaque échantillon. Valeurs seuils devrez peut-être être réglée manuellement. Valeurs de base sont automatiquement définies.
2. Normaliser les valeurs de Ct à la Ct moyenne de six contrôles d’entretien ménager de miRNA : SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, en utilisant l’équation suivante :
   ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
3. Pour plier le changement calculs, calculer les valeurs de ΔΔCt en utilisant un échantillon spécifique comme le contrôle, à l’aide de l’expression relative équation¹²:
   miRNA expression relative :
   2^-∆∆Ct, où - ∆∆Ct =-[test ∆Ct - ∆Ct control]
   Remarque : Changer le pli de 200 est considérée comme seuil de décision.
4. Exporter des valeurs d’expression de changement pli pour effectuer une analyse statistique sur R en utilisant le package Leduc Bioconductor⁸.
5. Corriger les comparaisons multiples à l’aide de la méthode de Benjamini-Hochberg¹³.
   Remarque :  Une copie du script R est disponible à : http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Ensembles de données et les données analysées sont également disponibles à l’Omnibus de Expression de gène sous le numéro GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. data Analysis : Analyse fonctionnelle logiciel

1. Organiser le groupe de données. Inclure les miARN avec leur expression respective journal ratios et les valeurs prédictives. Voir le tableau 1 pour la mise en forme du jeu de données spécifique.
2. Logiciel d’analyse fonctionnelle ouverte (version 01-10).
3. Télécharger le jeu de données en utilisant le format suivant : format de fichier : « Format Flexible », l’en-tête de colonne contient : « Yes », sélectionnez le type d’identificateur : « miRBase (mature) », plate-forme tableau utilisé pour des expériences : choisir la plate-forme de tableau.
   Remarque : Accepte les formats de fichiers sont .txt (fichiers texte délimité par tabulation), .xls (fichiers excel) et .diff (fichiers cuffdiff).
4. Sélectionnez « Déduire des Observations » et vérifiez que le groupe expérimental d’étiquetage est correct.
5. Allez à « Résumé du Dataset » de réviser le montant total des miARN cartographiés et non mappés.
6. Cliquez sur le bouton « nouveau » en haut à gauche du programme. Sélectionnez « Nouveau micro-ARN cible filtre » et télécharger un ensemble de données micro-ARN.
   1. La valeur Source : TarBase, conclusions d’Experts ingéniosité, miRecords.
   2. La valeur confiance : expérimentalement observée ou élevé (prévu).
   3. Sélectionnez « Ajouter des colonnes » d’inclure une variété d’informations biologiques sur les cibles tels que les espèces, maladies, tissus, voies et plus encore.
   4. Se pour concentrer sur des cibles qui ont changé l’expression dans l’expérience, sélectionnez « Ajouter / remplacer les ARNm dataset ». Utilisez « Expression appairer » pour localiser les microARN avec les niveaux d’expression identiques ou différents.
      Remarque : L’analyse de filtre fournira des microARN noms et symboles, cibles de l’ARNm, la source qui décrit la relation de la cible et le niveau de confiance de la relation prévue (Figure 2).
7. Cliquez sur « Ajouter à ma voie » pour envoyer l’ensemble de données filtré à une toile de voie et d’explorer les relations biologiques plus.
8. Chemin Designer permet de créer un modèle de qualité de publication, des effets de micro-ARN.
9. Une autre option consiste à créer une analyse de base.
   1. Pour le type de base de l’analyse, sélectionnez « Analyse de l’Expression ».
   2. Pour le type de mesure, sélectionnez « Expr Log Ratio ».
   3. Résumé analytique de la filtre : tenir compte seulement des molécules et/ou des relations où : (espèces = mouse) AND (confiance = observées expérimentalement) AND (sources de données = « Ingéniosité Expert Findings », « Ingéniosité ExpertAssist conclusions », « miRecords », « TarBase », ou « TargetScan homme »).
   4. Sélectionnez un seuil de valeur p = 0,05.
   5. Exécuter l’analyse.
      Remarque : Le rapport comprendra : voies canoniques, analyse régulateurs en amont, les maladies et les fonctions, effets de régulateur, réseaux, molécules et plus.

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Résultats

Les différents types cellulaires observés dans les frottis sont utilisés pour identifier l’étape de cycle oestral de la souris (Figure 1). Ceux-ci sont identifiés par la morphologie des cellules. Au cours du proestrus, cellules sont presque exclusivement des amas de cellules épithéliales nucléées (Figure 1 a) forme ronde, bien formées. Lorsque la souris est dans la phase d’oestrus, les cellules sont des cellules ép...

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Discussion

Profilage de microARN est une technique avantageuse pour diagnostic des maladies et recherches mécanistes. Dans ce manuscrit, nous avons défini un protocole visant à évaluer l’expression des miARN qui est prévus pour réguler les gènes inflammatoires dans les poumons des souris femelles exposées à l’ozone dans le cycle oestral différents stades. Méthodes pour la détermination du cycle oestral, telles que la méthode de détection visuelle, ont été décrits¹⁶. Cependant, ceux-ci s?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice	The Jackson Laboratory	000664	8 weeks old
UltraPure Water	Thermo Fisher Scientific	10813012
Sterile plastic pipette	Fisher Scientific	13-711-25	Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope Slides	Thermo Fisher Scientific	2951TS
Light microscope	Microscope World	MW3-H5	10x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP	Henry Schein Animal Health	55853	90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution	Lloyd Laboratories	139-236	10 mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100	Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needle	BD Biosciences	305165
Syringe	Fisher Scientific	329654	1 mL
Operating Scissors	World Precision Instruments	501221, 504613	14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit	World Precision Instruments	504616
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers	Fisher Scientific	08-418-1	Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	AM12400	1.5 mL
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus	Zymo Research	R2071
NanoDrop	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W
miScript II RT kit	Qiagen	218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array	Qiagen	MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes	Thermo Fisher Scientific	AM12225	for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control	Qiagen	219610
Microsoft Excel	Microsoft Corporation		https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen		https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software	The R Foundation		https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block	General Lab Supplier
Microcentrifuge	General Lab Supplier
Real-time PCR cycler	General Lab Supplier
Multichannel pipettor	General Lab Supplier
RNA wash buffer	Zymo Research	R1003-3-48	48 mL
DNA digestion buffer	Zymo Research	E1010-1-4	4 mL
RNA pre-wash buffer	Zymo Research	R1020-2-25	25 mL
Ultraviolet ozone analyzer	Teledyne API	Model T400	http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers	Sierra Instruments Inc	Flobox 951/954	http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html