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要約

ここで肺式を評価する方法について述べる予測される miRNAs の炎症性遺伝子を調整するマウスを用いたオゾンにさらされるまたは発情周期の異なった段階で空気をフィルター処理します。

要約

生物学や医学のさまざまな分野で働く研究者の関心マイクロ Rna (miRNA) プロファイリングとなっています。有望な診断で、肺疾患ケア miRNAs の使用の将来を現在研究に表示されます。ここでは、我々 はマイクロ Rna プロファイリング miRNAs のオゾンによる気道炎症のマウス モデルから肺組織の炎症性遺伝子を調整する予測のグループの相対的な豊かさを測定するためのプロトコルを定義します。このメソッドの目的は発情周期を考慮した雌のマウス プロトコルをプロファイリング炎症 miRNA を記述するので血中性ホルモン濃度が女性の肺の免疫の調節に影響を与えることが示されている、オゾン暴露の時にそれぞれの動物の段階です。LimmaR/Bioconductor ソフトウェアを用いた miRNA 検出とターゲット識別の方法に該当するバイオインフォマティクス アプローチに取り組むも、生物学的文脈と経路を理解する機能解析ソフトウェアを関連付け差分の miRNA の表現。

概要

マイクロ Rna (Mirna) は短い (19 に 25 のヌクレオチド)、自然発生する、非コーディングの RNA 分子。Mirna のシーケンスは、miRNAs 生理機能1を調整することの重要性を示唆している種類を渡って節約進化。マイクロ Rna 発現プロファイルは、miRNAs の免疫反応、細胞の分化、発達プロセス、およびアポトーシス2を含め、プロセスの様々 な規制に重要な識別するために有用であると実証されています。最近では、miRNAs は病診断と治療の潜在的な使用のために認識されています。研究者は遺伝子制御のメカニズムを勉強して、miRNA 発現を測定照らすことができます規制プロセスのシステム レベル モデル miRNA 情報は mRNA プロファイリングと他のゲノム スケール データ3を結合したときに特に。その一方で、miRNAs は試料の種類の範囲における Mrna よりも安定にも示されている、蛋白質4に比べ高い感度で測定可能なも。これは肺疾患を含む、多様な分子診断アプリケーションのバイオ マーカーとしての miRNAs の開発に大きな関心につながっています。

肺の miRNAs は発達プロセスと恒常性の維持に重要な役割を再生します。また、その異常発現は開発と様々 な肺疾患5の進行に関連付けられています。大きいの重症度と予後を示すホルモンと発情周期が環境課題への対応における肺生得免疫と miRNA 発現を調節することが女性の大気汚染による炎症性肺疾患を示しています。6。 このプロトコルでは適応免疫の留守中に発生する雌ネズミの肺の炎症の形態を誘導するために大気汚染の主要な成分であるオゾン露出を使用します。オゾンを使用することにより、我々 は気道過敏性の亢進、気道上皮細胞の損傷および好中球の増加や近位気道7中の炎症メディエーターに関連付けられて開発に誘引すること。現在、特性評価、オゾン暴露マウスの発情周期にわたって Mirna の解析によく記述されていたプロトコルはないです。

以下は、発情周期の段階および miRNA 発現オゾンにさらされた雌マウスの肺組織を識別する簡単な方法をについて説明します。また計算生物学に重点を置いて、miRNA 検出とターゲット識別に効果的なバイオインフォマティクスのアプローチに取り組みます。我々 は、 limma、遺伝子発現実験8からのデータを分析するための統合ソリューションを提供する R/Bioconductor ソフトウェアを用いたマイクロ アレイ データを分析します。Limmaから PCR 配列データの解析アレイ/サンプルの数が少ないを使用して、式を比較するとき t 検定の手続き上力の面で利点があります。MiRNA の式の結果の生物学的文脈を理解するには、私たちは、機能解析ソフトウェアを使用されます。転写の変更を調節するメカニズムを理解するために、可能性が高い結果を予測する、ソフトウェアは miRNA 発現データセットと文献9から知識を兼ね備えています。これは、miRNAs のセットを重複で統計の濃縮を探してソフトウェアと比較した場合の利点です。

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プロトコル

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ペンシルベニア州立大学のによって承認されています。

1。 発情周期の段階の評価

  1. C57BL/6 マウス (8-9 週齢) を使用して Machholz ら10で説明した片手マウス拘束テクニック女性を正しく抑制します。
  2. 超純水の 10 μ L の滅菌プラスチック ピペットを入力します。
  3. プラスチック ピペットの先端を膣に投入します。
  4. 優しくのフラッシュ液体 4 ~ 5 回、サンプルを採取します。
  5. ガラス スライド膣分泌液を含む最終的なフラッシュを配置します。
  6. 光顕微鏡 20 × 対物で無染色の膣にフラッシュを観察します。
    注:偽妊娠や他の原因のための定期的なサイクルを表示しない動物は、実験から除外する必要があります。周期を確認する少なくとも 3 つの連続したサイクルの膣分泌物毎日を実行することをお勧めします。

2. オゾン暴露

  1. アドリブ ワイヤー メッシュ蓋と水で 2 つの 1.2 L のガラス容器で最大 4 マウスを配置します。
  2. オゾン室と他のフィルターの空気暴露チャンバー内に 1 つのガラス容器を置きます。
  3. 定期的にオゾン濃度が 2 ppm とモニターにオゾン濃度を調整します。
    注:オゾン装置提供規制気流 (> 30 空気変更/h) と制御温度 (25 ° C) と湿度 (50%)。監視され、11を前述のように紫外線オゾン アナライザーと質量流量コント ローラーによって制御、放電オゾナイザによるオゾンが生成されます。
  4. 大気暴露のオゾン/フィルターの 3 時間後ガラス容器を削除します。寝具、食糧および水のアドリブでケージに動物を返します。

3. 肺コレクション

  1. 4 時間後、麻酔動物、ケタミン ・ キシラジン カクテル (90 mg/kg ケタミン ・ キシラジン 10 mg/kg) の腹腔内注入。
    注:麻酔の適切なレベルを確認するには、チェック マウス ペダルの反射 (しっかりつま先ピンチ) は、必要に応じて麻酔薬を調整します。
  2. マウス皮膚の 70% エタノールを湿らせます。
  3. 上大静脈を公開する動作のシザーと外科ピンセットを使用して 2 cm 正中切開を行います。
  4. 下大静脈と大動脈の断裂によってマウスを犠牲に。必要な場合は、急激に血液を収集する腎静脈上大静脈に 21 G ゲージ針を挿入します。また、心臓穿刺次の標準プロトコルを介して血液を収集します。
  5. 外科はさみを使用して、腹腔内を開いてカットし、肌/上筋、肋骨に向かって上に移動を削除します。
  6. 横隔膜をパンクに手術用ハサミを使用します。
    注:肺は横隔膜から崩壊します。
  7. 手術用ハサミを使用して心臓と肺を公開する胸郭を切り取る。
  8. 鉗子を使用して、1.5 mL 遠心チューブの RNase フリーを取るし、管を埋めるため液体窒素で水没します。
    注:ゴーグル ・防護手袋を使用して液体窒素を処理します。
  9. 肺を削除、スナップ凍結組織、液体窒素で満たされた、RNase フリー遠心 1.5 mL チューブにそれらを置くし、液体が蒸発するまで数秒待ってから。
  10. チューブのふたを閉じ、使用するまで-80 ° C で組織を保存します。

4. RNA の準備

  1. ステンレス鋼の組織の粉砕機を使用して全体の肺を粉砕します。
    注:組織の粉砕機は、液体窒素中で使用前に配置する必要があります。RNAse ソリューションで各使用後きれいに粉砕。
  2. 微粉の肺を分割し、2 つの 1.5 mL チューブ (半分肺) に配置します。
  3. 500 μ L のサンプル チューブあたりためチオシアン酸イ オンを加え、混ぜます。 それぞれ 18 G、21 G、23 G 針を使用して各サンプルをホモジナイズしてください。
    注:サンプルは 108小さな RNA スパイクでコントロール (種) から抽出する前に、部数 x 5.6 でスパイクします。
  4. 各サンプルと 15 の渦にエタノール 500 μ L を追加 s。
  5. コレクション チューブ、12,000 × gで 1 分間遠心する [スピン] 列に混合物の負荷を流れを破棄します。
  6. DNase の私治療 (内の列)。
    1. 12,000 × gで 1 分で 400 μ L の RNA 洗浄バッファーと遠心分離機を追加します。
    2. RNase フリーのチューブでは、追加 5 μ L の DNase 私と 75 μ L の DNA 消化 × 1 バッファーし、ミックスします。列の行列に直接には、ミックスを追加します。
    3. 15 分間室温でインキュベートします。
  7. 列と 1 分流れを破棄、12,000 × gで遠心分離する RNA prewash ソリューションの 400 μ L を追加し、この手順を繰り返します。
  8. 列に 700 μ L の RNA 洗浄バッファーを追加し、12,000 × gで 1 分間遠心を流れを破棄します。
  9. 残りのバッファーを削除する 2 分間 12,000 × gで遠心分離機します。RNase フリーのチューブに列を転送します。
  10. RNA を溶出するには、列マトリックスおよび 1.5 分、12,000 × gで遠心分離に直接水の DNase、RNase フリーの 35 μ L を追加します。
  11. 総 RNA 濃度を測定 (260 nm) と純度分光光度計を使用しています。1.5 μ L サンプル分注で RNA 定量を実行する指示に従います。楽器が DNase、RNase フリー水溶出用ブランクです。
    注:~2.0 の 260/280 の比率は、RNA の「純粋な」として一般に認められます。典型的な RNA 濃度通常 750 と 2,500 ng/μ L の間の範囲します。
  12. -80 ° C でストア

5. miRNA プロファイリング

  1. レトロ-議事録使用 200 ng のトータル RNA の Rna。
    1. (反応あたり合計量は 20 μ L) 氷の上逆のトランスクリプション反作用の組合せを準備します。各反応バッファー、ヌクレオチド ミックス 10 x の 2 μ L、逆転写酵素の 2 μ L、RNase フリー水 2 μ L x 5 の 4 μ L を追加します。すべてのコンポーネントと 600 μ L RNAse フリー プラスチック チューブ (反応あたりミックスの 10 μ L) の因数をミックスします。
      注:逆のトランスクリプションのマスターの組合せには、テンプレート RNA を除く最初繊維の cDNA の統合に必要なすべてのコンポーネントが含まれています。
      注:マスター ミックスを準備するときは、余分なボリューム (10%) を計算します。
    2. テンプレート RNA を追加 (200 10 μ L で ng) 逆のトランスクリプションのマスターの組合せを含む各管に。ミックス 15 遠心 1,000 x gで s したちのドライ ブロックを配置するまで氷の上保存します。
    3. 37 ° C で 60 分間インキュベートします。
    4. 95 ° C で 5 分間インキュベートし、氷の上、管を配置します。
    5. 各 20 μ L 逆転写反応に RNase フリーの水の 200 μ L を追加することによって Dna を希釈します。
  2. マウス炎症反応や自己免疫の miRNA PCR アレイを用いたリアルタイム PCR を行います。
    1. 反応混合物 (総量 1100 μ L) を準備: 各反作用のため 550 μ L 2 x PCR マスター ミックスの普遍的なプライマー ミックス x 10 の 110 μ L、RNase フリー水 340 μ および cDNA テンプレート (ステップ 5.1.5 から希釈反応) の 340 μ L を追加。
    2. プリインストールされた miRNA マルチ チャンネル pipettor を用いた PCR アレイの各ウェルに反応混合物の 10 μ L を追加します。
    3. MiRNA PCR 配列板光学接着フィルムをシールします。
    4. 1,000 x g気泡を除去するために室温で 1 分のプレートを遠心します。
    5. プログラム リアルタイム サーマルサイクラー、PCR の初期活性化ステップ 95 ° C で 15 分間、15 の 3 ステップ サイクリング含む変性 94 ° c、30 の焼鈍 s 55 ° C、および 30 の拡張子 s 40 70 ° C で s サイクル数。
      注:リアルタイムのサーマルサイクラーを設定する指示を条件に従って製造元のサイクリングします。リアルタイム サーマルサイクラー ソフトウェアに組み込まれた解離曲線のステップを実行します。
    6. データ解析を実行します。

6. データの分析

  1. 解析ソフトウェアに各サンプルのリアルタイム PCR ソフトウェアからの Ct 値を抽出します。
    注:34 の Ct 値は、カットオフとして考慮されます。サンプルには、スパイクの制御 (例:, cel-ミール-39) が含まれている場合、は、各サンプルのコントロールのスパイクに Ct 値を正規化します。しきい値の値は、手動で設定する必要があります。基準値は自動的に設定されます。
  2. 六つの miRNA ハウスキーピング コントロールの平均 Ct の Ct 値を正規化: SNORD61、SNORD68、SNORD72、SNORD95、SNORD96A、RNU6 2、次の式を使用します。
    ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
  3. 倍の計算を変更、相対式方程式12を使用して、コントロールとして特定のサンプルを使用して、ΔΔCt 値を計算します。
    miRNA の相対的な表現:
    2-∆∆Ct、ここで-∆∆Ct =-[∆Ct テスト - ∆Ct コントロール]
    注:200 のフォールドの変更は、カットオフとして考慮されます。
  4. 輸出倍 Bioconductor8のlimmaパッケージを使用して R の統計分析を実行する式の値を変更します。
  5. Benjamini ホフベルク方法13を使用して複数の比較を修正します。
    注: R スクリプトのコピーがで利用できる: http://psilveyra.github.io/silveyralab/。データセットと解析データ番号 GSE111667 の下で遺伝子発現のオムニバスでも https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667。

7. データ解析: 解析ソフトウェア

  1. データセットを配置します。それぞれ式ログ比と p 値の Mirna が含まれます。特定のデータセットのフォーマットのテーブル 1を参照してください。
  2. オープン機能解析ソフトウェア (バージョン 01-10)。
  3. 次の形式を使用してデータセットをアップロード: ファイル形式:「柔軟なフォーマット」が含まれている列見出し:「はい」識別子種類を選択:「miRBase (成熟)」、実験用アレイ プラットフォーム: 配列プラットフォームを選択。
    注:ファイル形式が .txt を受け入れ (タブ区切りテキスト ファイル)、.xls (excel ファイル)、および .diff (cuffdiff ファイル)。
  4. 「推測の意見」を選択し、、実験グループ ラベルが正しいことを確認します。
  5. マップとマップされていない Mirna の合計金額を修正する「データセットの概要」に進みます。
  6. 上部の「新規」ボタンをクリックしてプログラムの左。「新しいマイクロ Rna ターゲット フィルター」を選択し、、マイクロ Rna データセットをアップロードします。
    1. ソースに設定: TarBase、創意工夫、専門家の調査結果 miRecords。
    2. 信頼を設定: 実験的観察および高 (予想)。
    3. 生物学的種、疾患、組織、経路などのターゲットについての様々 なを含めるの「列の追加」を選択します。
    4. 実験式は変わったターゲットに焦点を当てる、するを選択"追加/mRNA データセットを交換する」。「ペアリング」の式を使用して、同じまたは別の発現レベルとマイクロ Rna を探します。
      注:フィルター分析はマイクロ Rna の名前と記号、mRNA ターゲット、ターゲット リレーションシップおよび予測関係 (図 2) の信頼区間を示すソースを提供します。
  7. 経路キャンバスにフィルター処理されたデータセットを送信しより多くの生物学的関係を調べる「マイ経路を追加する」をクリックします。
  8. パス デザイナーを使用すると、マイクロ Rna 効果の出版品質モデルを作成します。
  9. 別のオプションは、コア解析を作成します。
    1. コア分析型「発現解析」を選択します。
    2. 計測タイプの「Expr ログ比」を選択します。
    3. 分析フィルターの概要: 分子および関係のみを考慮する、: (種 = マウス) と (自信 = 実験で観測) と (データ ソース =「創意工夫の専門家調査結果」、「創意工夫 ExpertAssist 調査結果」、"miRecords"、"TarBase"、または"TargetScan 人間」)。
    4. P 値のカットオフを選択 = 0.05。
    5. 分析を実行します。
      注:レポートに含まれます: 正規の経路、上流レギュレータ解析、疾患や機能、レギュレータの効果、ネットワーク、分子。

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結果

塗抹標本にみられる異なった細胞のタイプは、マウスの発情期 (図 1) を識別するために使用されます。これらは細胞の形態によって識別されます。Proestrus の間に細胞はほとんど専ら丸い形、整形式の有核細胞 (図 1 a) のクラスターです。マウスが発情期にある細胞、角化扁平上皮細胞、高密度クラスター (?...

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ディスカッション

マイクロ Rna プロファイリングは、病気の診断と機構の研究のための有利な方法です。この原稿では、発情サイクルの異なる段階でオゾンにさらされた雌マウスの肺に炎症性の遺伝子を調節すると予測されている Mirna の式を評価するためのプロトコルを定義します。視覚的検出法などの発情周期の定量方法は、記述されている16をされています。しかし、これらは 1 回の測?...

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開示事項

著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

謝辞

この研究は、NIH K01HL133520 (PS) と K12HD055882 (PS) からの助成金によって支えられました。著者は博士ジョアンナ フロロスのオゾン暴露試験との援助をありがちましょう。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
C57BL/6J miceThe Jackson Laboratory0006648 weeks old
UltraPure WaterThermo Fisher Scientific10813012
Sterile plastic pipetteFisher Scientific13-711-25Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope SlidesThermo Fisher Scientific2951TS
Light microscopeMicroscope WorldMW3-H510x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USPHenry Schein Animal Health5585390 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile SolutionLloyd Laboratories139-23610 mg/kg. Controlled Drug.
EthanolFisher ScientificBP2818100Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needleBD Biosciences305165
SyringeFisher Scientific3296541 mL
Operating ScissorsWorld Precision Instruments501221, 50461314 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer KitWorld Precision Instruments504616
Spectrum Bessman Tissue PulverizersFisher Scientific08-418-1Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge TubesThermo Fisher ScientificAM124001.5 mL
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific15596026
Direct-zol RNA MiniPrep PlusZymo ResearchR2071
NanoDropThermo Fisher ScientificND-ONE-W
miScript II RT kitQiagen218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR ArrayQiagenMIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubesThermo Fisher ScientificAM12225for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in ControlQiagen219610
Microsoft ExcelMicrosoft Corporationhttps://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway AnalysisQiagenhttps://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R SoftwareThe R Foundationhttps://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating blockGeneral Lab Supplier
MicrocentrifugeGeneral Lab Supplier
Real-time PCR cyclerGeneral Lab Supplier
Multichannel pipettorGeneral Lab Supplier
RNA wash bufferZymo ResearchR1003-3-4848 mL
DNA digestion bufferZymo ResearchE1010-1-44 mL
RNA pre-wash bufferZymo ResearchR1020-2-2525 mL
Ultraviolet ozone analyzerTeledyne APIModel T400http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllersSierra Instruments IncFlobox 951/954http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

参考文献

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