Aislamiento de las comunidades bacterianas intracelulares solo generados a partir de un modelo murino de infección del tracto urinario para posteriores análisis unicelular

Resumen

Este protocolo describe un método sencillo de aislar a las células epiteliales individuales, vejiga infectada de un modelo murino de infección del tracto urinario.

Resumen

En este artículo, describiremos un procedimiento utilizado para aislar a las comunidades bacterianas intracelulares de un ratón que ha sido infectado experimentalmente en las vías urinarias. El protocolo se puede dividir ampliamente en tres secciones: la infección, recolección de células epiteliales de vejiga y micropipetting boca para aislar las células epiteliales infectadas individuales. La célula epitelial aislada contiene células bacterianas viables y está casi libre de contaminantes bacterias extracelulares, lo que es ideal para el análisis unicelular aguas abajo. El tiempo desde el inicio de la infección para obtener una comunidad bacteriana intracelular es de aproximadamente 8 horas. Este protocolo es de bajo costo implementar y utiliza materiales ampliamente disponibles, y anticipamos que también puede ser utilizado en otros modelos de infección para aislar las células infectadas de las mezclas de células aunque esas células infectadas son raros. Sin embargo, debido al riesgo potencial de micropipetting de boca, este procedimiento no se recomienda para los agentes altamente infecciosos.

Introducción

Infecciones del tracto urinario (UTIs) son una de las infecciones bacterianas más comunes. Se espera que aproximadamente el 40-50% de las mujeres experimentan al menos una infección del tracto urinario (ITU) durante su curso de la vida¹. Uno de los principales agentes de infección urinaria es uropatógenos Escherichia coli (UPEC), que representa más del 70% de las infecciones urinarias no complicada². Además, aproximadamente una cuarta parte de aquellos que tienen una infección urinaria tendrá una infección recurrente, a menudo causada por la misma cepa, a pesar de tratamiento antibiótico adecuado³. La alta incidencia de infección urinaria representa una importante carga en los sistemas de salud, cuesta más de $ 2 billones al año en los Estados Unidos⁴. Además, el uso de antibióticos para tratar las infecciones urinarias también conduce al aumento de las tasas de resistencia a los antibióticos, que es una preocupación de salud pública⁵.

Por lo tanto, se ha puesto un gran esfuerzo en la comprensión de los mecanismos por los cuales UPEC infecta el tracto urinario, así como su capacidad para provocar infecciones recurrentes^6,7,8. En particular, un modelo de ratón de la infección se ha utilizado para examinar características bacterianas y host que contribuyen a de la UTI⁸. Este modelo de ratón tiene la ventaja de ser aplicable a sin modificar cepas clínicas aisladas de pacientes humanos. Este modelo también ha conducido al descubrimiento de caminos bacterianas druggable potencialmente importantes para el establecimiento de infección urinaria, como la tipo 1 Pilo⁹ y hierro adquisición sistemas¹⁰.

Frente a estos éxitos en el estudio de los acontecimientos tempranos en UTI, conocimiento de los mecanismos subyacentes a la IU recurrente todavía falta¹¹. Una hipótesis es que UPEC evade la terapia antibiótica y ocasiona infecciones recurrentes en la vejiga mediante la formación de comunidades bacterianas intracelulares (GRG) dentro de las células epiteliales de la vejiga. IBC ' s han sido identificados tanto en modelos murinos de infección humana UTI pacientes^12,13. La presencia de GRG en muestras de orina de pacientes pediátricos de IU se ha asociado con mayores tasas de recurrencia^14,15. Sin embargo, aislando los GRG y estudiando las bacterias dentro de ellos ha demostrado para ser técnicamente un reto debido a su rareza; se estima que una vejiga murina infectada por lo general sólo tiene 10-100 Rig¹⁶. Además, las células epiteliales de la vejiga son relativamente grandes (50-120 μm)¹⁷, lo que es difícil para implementar fluorescencia asistida celular clasificación (FACS) dado que típico boquillas FACS están diseñados con los diámetros del μm 70 o 100 μm. Así, las células tan grandes como las células epiteliales de vejiga a menudo se eliminan por filtración antes de FACS para evitar la obstrucción de los fluidos.

Nuestro laboratorio recientemente describe un método general y económico para aislar las células infectadas raras de mezclas como raspadas células epiteliales de la vejiga¹⁸. Para aislar efectivamente GRG, utilizamos boca tradicional pipeteo. Micropipetting boca es una técnica que ha sido utilizada para la micromanipulación de células y embriones para posteriores análisis^{19,20,21,22,23, 24 , 25}. boca tradicional pipeteo de grandes volúmenes de líquido (en mililitros) ha sido a menudo la causa de accidentes de laboratorio, y la técnica, con razón, ha sido rechazada por gran parte de la comunidad de investigación fuera de embriología tradicional y aplicaciones de la célula. Nuestro protocolo se inspira en las versiones de la célula de esta técnica^19,20, que mitigan el riesgo al proporcionar un almacenador intermediario grande (> 2 mL) de aire entre el investigador y la muestra en comparación con el volumen de líquido transferido (< 1 ΜL). Este método también aprovecha el control fino que boca proporciona micropipetting, que se traduce en un bajo volumen final de alrededor de solución transferido y alta pureza de células aisladas. La técnica utiliza materiales baratos (<$ 50) y así debe ser factible de implementar en todos los laboratorios.

Este protocolo visual describe nuestra técnica de aislamiento de IBC, proporcionando una referencia para ayudar a otros investigadores que buscan replicar esta técnica. El investigador tendrá acceso a un microscopio de disección fluorescente (o equipo similar) que puede utilizarse para visualizar las células epiteliales individuales y las bacterias fluorescentes durante la proyección de imagen vivo, con una etapa de proyección de imagen abierta y accesible para micropipetting (véase la Tabla de materiales para los detalles del microscopio utilizado, aunque también se pueden utilizar otros modelos de instrumento equivalente). Mientras que este protocolo se centrará en IBC ' s en un modelo murino de infección urinaria, deben aplicarse métodos similares para aislar las células infectadas de suspensiones celulares de otros modelos de la infección.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos sobre manejo de animales han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) del Instituto de genoma de Singapur y centro de recursos biológicos de la Agencia de ciencia, tecnología e investigación, Singapur.

1. ratón infección

1. Preparación de capilares de vidrio
   1. Una fuente de llama abierta (quemador de alcohol o mechero de Bunsen) de luz.
   2. Sostenga un vaso capilar con las dos manos firmemente pellizcando ambos extremos, entonces la mitad del tubo de calor uniformemente hasta que el vidrio va suave. Gire el tubo capilar suavemente hacia adelante y hacia atrás a lo largo de su eje para facilitar incluso la calefacción del vidrio.
   3. Retire el capilar de vidrio de la fuente de calor e inmediatamente separe las manos, manteniendo la empuñadura en ambos extremos del tubo. La longitud final ideal del tubo capilar tirado es 3-5 cm más largo que un unpulled capilar para un diámetro interno apropiado para aislar las células epiteliales de vejiga sola.
      PRECAUCIÓN: La tubería continúa siendo extremadamente caliente para un período de tiempo, así que apartar el tubo capilar en una superficie de calor por unos minutos que se enfríe antes de proceder al siguiente paso.
   4. Compruebe para ver si se ha convertido en el centro del tubo de vidrio capilar más estrecho (figura 1A) y que el interior del tubo es hueco (figura 1B). Para el aislamiento de IBC ' s, un tamaño de alesaje de 200-400 μm es usable.
   5. Tome un extremo del tubo capilar tirado con una mano. Sostener un par de fórceps con la otra mano y se usa para recoger el vidrio tirado capilar en su punto más estrecho. Asegúrese de que el fórceps se ejerció con fuerza suficiente para sujetar firmemente el tubo capilar sin aplastarlo.
   6. Utilice un movimiento giratorio rápido por la mano que sostiene el fórceps a presión capilar tirado en el punto más estrecho para crear un micropipetting de boca capilar.
      Nota: Con dedos en lugar de fórceps también es aceptable, siempre y cuando se utiliza una protección adecuada de los fragmentos de vidrio.
   7. Repita los pasos 1.1.2-1.1.6 por lo menos 4 x más para producir suficiente repuesto micropipetting los tubos capilares y proporcionar una gama de diámetros para aislamiento de IBC. Si se prevé más de un grupo de infecciones, preparar 5 tubos capilares de micropipetting adicional para cada grupo de infección adicional.
      PRECAUCIÓN: No te olvides de apagar las llamas.
   8. Colocar los capilares tirados en una caja Petri de 100 mm y exponer el plato a la radiación UV durante 30 minutos esterilizar los tubos capilares.
   9. Vuelva a colocar la tapa en la caja Petri después de la esterilización ultravioleta y guarde la caja Petri con los tubos capilares a temperatura ambiente.
2. Preparación de los catéteres antes de la infección
   1. Preparar catéteres urinarios para la infección como se describe en Hung et al⁸ y Conover et al²⁶ por lo menos un día antes de la infección.
3. Preparación de uropatógenos fluorescente cultura de e. coli
   1. Crecen los uropatógenos fluoróforo expresando las bacterias cepa según protocolos establecidos.
      Nota: Las opciones de cepa y fluoróforo en gran parte dependen del microscopio y las cepas disponibles en los laboratorios individuales. En este ejemplo, utilizamos una cepa derivada de UTI89, que es un aislamiento clínico de un paciente con cistitis recurrente. Esta tensión, SLC-638, lleva un plásmido (pSLC-77) que expresa vsfGFP-9 y kanamicina resistencia¹⁸. SLC-638 se cultiva en caldo LB a 37 ° C con 50 kanamicina μg/mL.
   2. Cepa SLC-638 de la raya en una Luria Bertani (LB)-placa de agar suplementada con 50 kanamicina μg/mL. Incubar la placa a 37 ° C durante la noche.
   3. (Opcional) Ver la placa en el microscopio de disección para confirmar la expresión de marcadores fluorescentes antes de seleccionar una colonia.
   4. Utilizando un asa de inoculación bacteriana, transferir la Colonia seleccionada a un erlenmeyer de 125 mL con 10 mL de caldo LB con kanamicina μg/mL 50. Incube el frasco estáticamente a 37 ° C durante 24 h.
   5. Subcultura las bacterias de este frasco tomando 10 μl de cultivo del frasco y diluir en 10 mL de LB caldo suplementado con 50 kanamicina μg/mL en un matraz de 125 mL fresco (una dilución de 1: 1000). Incubar este segundo frasco estáticamente a 37 ° C por 24 h otro.
   6. Girar por la cultura bacteriana por 5 min a 5.000 x g a 4 ° C.
   7. Decantar el sobrenadante y resuspender el precipitado bacteriano en PBS frío en OD₆₀₀ de 0.5.
      Nota: Aunque puede variar de cultura a cultura, normalmente 1 mL de cultivo estático da unos 4-5 mL de OD₆₀₀ = 0,5 cultivo bacteriano. El volumen total de inóculo bacteriano necesario para cada cepa puede calcularse como sigue: se requiere para cada ratón 50 μl y 50 μl es necesaria para llenar la cabeza de la aguja. Un 10-20% adicional (mínimo de 50 μL) del inóculo se recomienda para tomar en cuenta volumen muerto de la jeringa.
   8. Utilice el resto de la mezcla bacteriana para determinar el título de la infección como se describe en Hung et al⁸.
      Nota: Este paso puede ser retrasado por algunas horas por almacenar la mezcla bacteriana a 4 ° C.
4. Modelo murino de infección del tracto urinario
   1. Infectar a los ratones según lo descrito por Hung et al⁸, con un grupo experimental para cada cepa de fluorescente e. coli cultivada en la sección 1.3.
      Nota: También consulte Conover et al²⁶ para ayuda visual.
   2. Tenga en cuenta el tiempo de la inoculación bacteriana para el ratón o jaula.
   3. Repetir infecciones para todo el grupo experimental.
      Nota: El catéter de la infección puede reutilizarse para todos los ratones en el mismo grupo.
   4. Repita los pasos 1.4.1-1.4.3 para cada grupo experimental planeado, asegurando que un catéter fresco y nuevo gel lubricante está preparado para cada grupo.
      Nota: Para experimentos con un gran número de animales, es mejor dividir los animales en grupos de cinco y escalonar las infecciones los que cada grupo es infectado unos 30 min a 1 h aparte. Esto le dará tiempo suficiente para que los siguientes pasos (secciones 2 y 3).

2. célula epitelial de la vejiga cosecha para obtener una suspensión

1. Cosecha e invertir vejigas murinos
   1. Preparar tres tubos cónicos de 50 mL con 45 mL de etanol al 70% para la esterilización del material quirúrgico.
   2. En dos de los tubos preparados en el paso 2.1.1, coloque un par de tijeras y un par de pinzas cada uno. Colocar dos pares de pinzas (una preferencia más estrecha y con una punta redondeada, para la inversión de la vejiga) en el tercer tubo.
      Nota: Las herramientas en el primer tubo se utilizará en la región externa, las herramientas en el segundo se utilizará en la recolección de la vejiga, y los dos pares de pinzas en la última voluntad de tubo utilizan en la inversión de la vejiga.
   3. A las 6 h post infección, eutanasia a los ratones infectados según protocolos de la institución IACUC.
      Nota: Nuestro protocolo IACUC pide eutanasia mediante dislocación cervical realizada cuando el ratón está bajo anestesia (isoflurano).
   4. Pone los animales sobre sus espaldas y una botella de spray llenada con etanol al 70% para esterilizar su área abdominal.
   5. Usando un par de pinzas y tijeras quirúrgicas de primer tubo (preparado en el paso 2.1.2), apertura hace una pequeña incisión transversa en la piel a 1 cm por encima de la uretra. Ampliar la incisión diagonalmente hacia los miembros superiores del ratón, creando un corte en forma de V a lo largo de todo el anterior del ratón que expone el contenido del peritoneo. Asegúrese de que durante este proceso, las tijeras no cortan a través de los intestinos del ratón (figura 2A, B).
   6. Cambiar a la segunda serie de herramientas (preparado en el paso 2.1.2). Usando las cuchillas de las tijeras o los ejes de las pinzas, empuje suavemente hacia abajo sobre las almohadillas de grasa cerca de la región pélvica del ratón.
      Nota: Este paso provoca la vejiga sobresale hacia el exterior y asegura una visibilidad para la cosecha.
   7. Agarre la vejiga expuesta en el ápice con un par de fórceps (figura 2C).
   8. Mantener un agarre firme en el vértice de la vejiga con el fórceps, cortar y liberar la vejiga desde el resto del animal (corte de la uretra y los uréteres lejos) con las tijeras quirúrgicas. No suelte el fórceps con la vejiga aún.
   9. Cambio de las tijeras a las pinzas redondeadas más estrechas desde el tercero cónico del tubo (en el paso 2.1.2), inserte la punta de eje de una de las pinzas redondeadas en la abertura de la vejiga donde sólo se cortó en el paso anterior (figura 2D). Con la punta de las pinzas redondeadas con seguridad se inserta en la abertura de la vejiga, suelte el par de pinzas para agarrar el vértice de la vejiga y volver al segundo tubo cónico.
   10. Con el segundo par de pinzas del tercer tubo, gire suavemente la vejiga "inside out", primero tirando del extremo exterior de la boca de la vejiga de las pinzas redondeadas (figura 2D, flecha 1) y guiarla alrededor y en el otro extremo del las pinzas redondeadas (figura 2D, flecha 2).
       Nota: La acción puede compararse a la eliminación de un calcetín de un pie y tirando sobre el otro.
       1. Durante el proceso de inversión, mantener el primer redondo par de fórceps casi completamente cerrada. Esto proporciona suficiente libertad de movimiento para sacar la vejiga desde el primer eje de las pinzas redondeadas, pero también trae el segundo eje de las pinzas redondeadas más cercanas a la primera y permite que la vejiga para ser transferidos fácilmente. El resultado final de este paso es que la vejiga debe ser invertida y en la punta del eje del segundo del primer par de pinzas (figura 2E).
       2. Con el segundo par de pinzas, coaxial suavemente la vejiga invertida frente a la punta de las pinzas en 1 mL de PBS frío.
          Nota: (Opcional) Este es el momento oportuno para tomar imágenes de todo el invertido, vejiga infectada para observar la frecuencia general y distribución de Rig, si cualquier.
   11. Repita los pasos 2.1.1-2.1.10 para cada vejiga en el grupo experimental (a un máximo de cinco animales).
2. Raspado de células epiteliales de vejiga
   1. Con dos pares de pinzas de limpiar, raspar suavemente el exterior de la vejiga invertida (que es la capa interna de la célula epitelial). PBS circundante aparece nublado como raspar las ganancias y las células epiteliales se liberan en la solución de PBS.
   2. (Opcional) Confirmar visualmente que el raspado de la vejiga ha liberado las células en solución utilizando un microscopio de disección. Figura 3 A, B). El PBS debe aparecer turbio a simple vista, y las células epiteliales de raspado vejiga individual pueden verse en aumento x 10.
   3. Repita los pasos 2.2.1-2.2.2 para cada vejiga cosechada en el paso 2.1.

3. intracelular aislamiento bacteriano comunidad (IBC): boca pipeteo de IBC ' s

Nota: Todos los métodos descritos en esta sección han sido sometidos a una evaluación del riesgo institucional. Pipeteo de boca lleva el riesgo inherente de la ingestión de la solución que está siendo transferida. Este riesgo se mitiga en gran parte por los volúmenes nanoliter que utiliza este protocolo, y le recomendamos que preste atención a todos los usuarios de la paga de protocolo a la precaución y notas prácticas enumeran aquí y en la discusión.

1. Después las células han sido raspada en el PBS, configurar el aparato de micropipetting de la boca (figura 3C).
   1. Inserte el extremo más grueso de la tiró un capilar de vidrio (unpulled final) en el tapón de goma (extremo blanco) del tubo del aspirador.
   2. Inserte el extremo estrecho de la punta de una pipeta de 1 mL en el otro extremo (rojo) abierto del tubo aspirador, asegurando que hay un ajuste apretado.
   3. Inserte el extremo estrecho de un mL 2 pipeta de aspiración en el extremo abierto, más ancho de la punta de la pipeta de 1 mL, otra vez asegurando que hay un ajuste de ajuste.
      Nota: La configuración resultante permite el investigador pipeta de boca desde el extremo más amplio y abierto de la pipeta de aspiración para crear una fuerza de succión suave desde el extremo delgado del tubo capilar en el otro extremo del aparato.
   4. Prueba el aparato de micropipetting final de boca con un plato de Petri de 100 mm que contiene agua desionizada. Un ligero movimiento de succión en el extremo abierto de la pipeta de aspiración (similar a disfruta de una bebida a través de una pajita) debe aumentar el nivel de líquido en el capilar, pero sin que el agua desionizado se desborde en el tubo aspirador. Use una mano para controlar el tubo capilar, mientras con la otra mano para ajustar la posición de la caja Petri.
      Nota: La fuerza de succión necesaria para el pipeteo de boca un IBC solo variará entre los investigadores. Sin embargo, se recomienda que cada investigador intenta esta técnica empieza con una succión débil e incrementando lentamente si el líquido no fluye por el tubo capilar. No hay necesidad de una fuerza mayor que chupar una paja para beber. Si el capilar no parece ser recoger líquido durante la prueba en el paso 3.1.4, es posible que el capilar o el tubo de aspiración está obstruido y necesita ser reemplazada. También se recomienda que los nuevos investigadores primera práctica control de succión en el aparato de pipetas de boca con esteriliza agua. Además, observe que el control del volumen tomado por el aparato de pipetas de boca mediante el uso de la lengua del investigador. La lengua puede finalmente ajustar la fuerza de succión aplicada, así como actuar como una parada de emergencia.
   5. Después de lograr la exitosa absorción de líquido, prueba de la capacidad de expulsar del capilar soplando suavemente el extremo abierto de la pipeta de aspiración. Garantizar que no hay burbujas se crean en el proceso de expulsar el líquido para evitar la contaminación de la IBC durante paso 3.5.
      Nota: Como con la succión, la fuerza de presión positiva aplicada por el investigador para expulsar el IBC en el tubo de centrífuga varía entre los investigadores. Se recomienda a los investigadores nuevos en el presente Protocolo paso de práctica 3.1 unos días antes de la infección real. Una sugerencia para practicar micropipetting boca es práctica transferir pequeños volúmenes de agua esterilizada mezclada con unas gotas de colorante alimentario (de visibilidad) usando el aparato de la micropipeta de boca.
2. Coloque la suspensión de raspado de células bajo el microscopio de disección y el IBC se identifican como grandes agregados fluorescentes (figura 3A, B). El rango ideal de ampliación es 20-40 x. Sumerja el extremo fino del vaso capilar en un tubo nuevo de PBS para 1 s para reducir la absorción del volumen no deseado a través de la acción capilar.
3. Mirando a través del microscopio, identificar el IBC de interés y llevar lentamente el extremo abierto del tubo capilar hacia lo IBC. Utilice el extremo fino del vaso capilar para barrer las células extras junto a cada IBC para evitar la aspiración de dos o más células, o para romper apartes agregados más grandes de las células.
4. Mientras mira por el microscopio, se aplica una fuerza muy pequeña de la succión en el extremo (aspiración con una pipeta) de los aparatos de micropipetting de boca para guiar el IBC en el capilar de vidrio.
5. Después de recoger el IBC, mueva el tubo capilar a un tubo de centrífuga de 1.5 mL vacío y aplicar una ligera presión positiva para expulsar la gota y el IBC en el tubo de centrífuga (figura 3D).
6. Repita los pasos 3.3-3.6 en como muchos GRG son necesarias de la cámara actual, antes de proceder a la vejiga siguiente. Cambio aspiración pipetas y tubos capilares con frecuencia para evitar la acumulación de saliva.
   PRECAUCIÓN: Cuando se trabaja con cepas infecciosas (o clínicas) de bacterias, monitorear constantemente el nivel de solución en el capilar. No deje que el nivel de líquido ser pipeteado desbordamiento del borde del tubo capilar en el tubo aspirador. Si esto ocurre, inmediatamente cambiar a un tubo de aspirador diferentes y deseche el conjunto anterior arriba.
7. Repita los pasos 3.2-3.6 en vejigas cosechados todos, o hasta que se han recogido un número suficiente de muestras biológicas para el grupo experimental.
8. (Opcional) Repita los pasos 3.6 y 3.7 hasta todos experimental grupos (o ratones) han sido sacrificados y suficientes muestras biológicas han sido extraídas de cada grupo.

Resultados

Aparte de confirmación (figura 3D) de la presencia de una IBC aislada solo en el tubo de la colección mediante el microscopio de disección, la pureza de la IBC aislado puede confirmarse también mediante microscopía confocal. Como se muestra en la figura 4A, las células aisladas deben manchar para e. coli y uroplakin y son del tamaño esperado para IBC ' s (50-120 μm)¹⁷. Además, e. coli tinción no está presente en el líquido circundante. Basado en nuestros datos, más del 90% de las células aisladas con esta técnica son de IBC ' s¹⁸. Después de aislamiento, la presencia y viabilidad de las células bacterianas en el IBC individual pueden confirmarse a través de la Colonia formando unidad (UFC) enumeración (figura 4B) o reacción en cadena polimerasa cuantitativa (qPCR) para (equivalentes genómicos Figura 4 C). figura 4C también demuestra que las células epiteliales no infectadas aisladas con el mismo protocolo no tienen cantidades cuantificables de las bacterias. Basado en estos datos, se estima que el rango de unidades formadoras de colonias en una IBC solo es 10²-10³ en el modelo murino de infección del tracto urinario. Uno de los principales objetivos del aislamiento individual de IBC es realizar análisis aguas abajo como la secuencia de RNA. Para comprobar que nuestro método de aislamiento es capaz de obtener RNA de bacterias en IBC para el análisis, se realizó cuantificación de (qRT-PCR) reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa cuantitativa de tres genes (16S, cyoB y frdA) para un gama de GRG individualmente aislados y combinados (figura 4D). Todos los datos que se muestra en la figura 4 se ha adaptado con el permiso de Duraiswamy et al.¹⁸. Un esquema de Resumen de nuestro protocolo de aislamiento de IBC puede verse en la figura 5, que se reproduce de Duraiswamy et al.¹⁸.

Figura 1 : Mano-tirado capilares mantienen estrechas aberturas. (A) muestras de tubos capilares estirados a mano aparecen sobre un fondo negro para el contraste. De abajo hacia arriba, un unpulled capilar, un tubo capilar que no fue lo suficiente, se muestran un tubo capilar que se puede utilizar para la recolección de células epiteliales de vejiga solo y un capilar que se ha tirado demasiado finos (y así separada en dos piezas). Una regla de 15 cm se coloca en la parte inferior de la imagen de la escala. El punto Estimado partiendo el capilar útil se indica en la figura por la flecha roja. (B) imagen tomada con un microscopio de disección confirmando el diámetro interno hueco de un capilar tirado (abajo). Un unpulled capilar se coloca por encima para demostrar la diferencia de tamaño relativo de los dos tubos capilares. Barra de escala = 4,0 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Disección del ratón para cosechar las células epiteliales de la vejiga. (A) una imagen de un ratón con líneas blancas para indicar la ubicación estimada y ángulo de incisiones para exponer la cavidad peritoneal murina y la vejiga. Incisión posterior de la cavidad peritoneal ratón de la (B) una imagen de los expuestos. (C) una imagen de lo expuesto la vejiga (flecha roja) que sobresale entre las almohadillas de grasa. (D) una imagen de la vejiga murina con la punta de las pinzas que se inserta en el lumen, con flechas para indicar la dirección del movimiento es necesario invertir la vejiga. La vejiga se tira ligeramente hacia fuera, primero entonces alrededor y del primer eje de las pinzas. Las direcciones de movimiento de ambas acciones son como se indica por flechas blancas numeradas 1 y 2. (E) una imagen que muestra la posición final de la vejiga invertida insertada en el segundo eje de las pinzas. Los ejes de las pinzas están marcados en ambos paneles D y E con flechas rojas y texto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : IBC recolección de las células de la vejiga. (A) una vejiga infectada e invertida en solución de PBS frío antes de raspar de la célula. (B) una imagen que muestra raspa células de la vejiga como se ha visto bajo un microscopio. GRG pueden ser identificados como grandes agregados fluorescentes verdes en las dos imágenes (ver flechas rojas). (C) una imagen del aparato de micropipetting de boca. La pipeta de aspiración, pipeta, tubo de aspirador y tubo capilar tirado se identifican con las flechas numeradas como se indica a la derecha. (D) una imagen de un único aislado IBC dentro de un tubo de recogida de 1,5 mL (contorneado en rojo). Barras de escala (como se indica) son representadas por líneas blancas en los paneles A, B y D. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : GRG cosechados son puros y puede ser utilizados para posteriores análisis. Esta figura se ha modificado con permiso de Duraiswamy et al¹⁸. (A) imágenes de dos células GFP-positivas aisladas que fueron teñidas con anticuerpos de anti-uroplakin y anti -e. coli . La primera célula (IBC 1) tiene imágenes de canales individuales (a bajos aumentos) a la izquierda, y una imagen combinada de alta magnificación está a la derecha. La segunda celda (IBC 2) se muestra en la alta ampliación en canales individuales y combinados. Barras de escala son como se indica. ADN es manchado con 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y en el canal azul. Anti -e. coli se tiñe con un anticuerpo secundario conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y en el canal verde. Anti-uroplakin se tiñe con un anticuerpo secundario conjugado a isotiocianato (TRITC) de tetramethylrhodamine y en el canal rojo. (B) bacterias UFC de GRG aislados. GRG fueron procesados inmediatamente, o incubados en 0,1% Triton-X para cuentas de UFC combinaron 10 o 30 min de GRG individual aislada de n = 3 se muestran diferentes experimentos. Límite de detección = 0,7 log₁₀ UFC/IBC. Trazada en el límite de detección de puntos rojos indican las muestras que no fueron recuperadas colonias. Todas las muestras que contienen el IBC no son significativamente diferentes (p > 0.05, test de Mann-Whitney); las células epiteliales no infectadas son significativamente diferentes de los datos IBC (10 min) (p < 0,001, prueba de Mann-Whitney). (C) qPCR cuantificación de bacterias en los GRG y las células epiteliales no infectadas después de una incubación de 10 min en 0,1% Triton-X (*, p < 0.0001, prueba de Mann-Whitney, n = 4). Límite de detección = 1.18 Registro₁₀ genoma bacteriano equivalentes/IBC. Puntos rojos indican las muestras que no fueron recuperadas colonias en titering en el panel B. (D) la cuantificación de los genes 16S rRNA, cyoB y frdA para diferentes números de GRG individualmente aislados y combinados (n = 1 experimento; cada uno punto indica la media de 3 repeticiones técnicas). NC no = control negativo del ADN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Un esquema y sus fotografías asociadas que representan el aislamiento de GRG via micropipetting boca de vejigas de ratones infectaron. Esta figura se reproduce de Duraiswamy et al.¹⁸. (A) A cosecha toda vejiga; (B) una invertida toda vejiga exponiendo la GFP expresando IBC; (C) un primer plano del borde de una vejiga raspado mostrando GRG individuales en suspensión en el búfer adyacente; (D) un único aislado IBC pipeta en un tubo. Flechas rojas en el panel B indican ejemplos de GRG de GFP-positivas en la superficie luminal de la vejiga. La línea punteada roja en el panel C indica el borde derecho de la vejiga invertida (indicado como "BL"); flechas rojas en el panel C indican aparente individual GFP-positivas las células epiteliales que han sido raspadas la superficie de la vejiga. Línea punteada blanca en panel D indica una gotita de micropipetted sub-microlitro con IBC aislada, que es indicada por una flecha blanca. Barras de escala = 2 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Permite que el protocolo que hemos descrito para el aislamiento de GRG solo de un modelo murino de infección urinaria. Este protocolo aísla GRG conteniendo bacterias intracelulares viables, que pueden ser verificadas por cultivo de CFU. Los resultados de protocolo en bacterias intracelulares de GRG con poca contaminación por bacterias extracelulares, permitiendo más caracterización de dos bacterias y anfitrión de la célula de una IBC (figura 4C). También mostramos que las bacterias de una IBC solo pueden utilizarse en aplicaciones posteriores como qPCR (figura 4C), lo que sugiere que la técnica puede utilizarse para proceso GRG para otros análisis in vitro. Por agrupación de las bacterias de tan sólo 5 GRG, además demostramos nuestra capacidad para realizar análisis de qRT-PCR en los tres genes bacterianos, sugiriendo que el RNA de buena calidad puede ser cosechado de las bacterias en nuestro Rig aislado (figura 4D). Combinada, indican los datos que hemos demostrado que realizar análisis del ARN del genoma (por ejemplo, la secuencia de RNA) en GRG solo puede ser posible usar esta técnica de aislamiento.

En este protocolo, nos hemos centrado en el punto de tiempo de 6 h porque es cuando máximo del IBC números en las vejigas de negro 6 ratones infectados por el UTI89²⁷. Además, también hemos usado un sistema de cultivo bacteriano estático para mejorar el nivel de expresión del pilus de tipo 1 en UTI89. La expresión de pilus de tipo 1 es fundamental para e. coli unir a y de infectar las células epiteliales de vejiga²⁸. Sin embargo, esta expresión está fuertemente regulado²⁹ y señales ambientales son conocidos por alterar³⁰. Para mantener un fenotipo de infección constante y un número suficiente de contenedores IBC, recomendamos usar un cultivo bacteriano estático de 2 x 24 h (levemente modificado de Hung et al.⁸) y el momento de la infección 6 h funciona con anteriormente probado e. coli cepas como NU14 y UTI89^28,29. Sin embargo, es posible que estas variables tendrán que ajustarse en otras cepas UTI o en otras cepas de ratones para obtener el número ideal de IBC de cada infección.

Mientras que el protocolo de Hung et al.⁸ utiliza sólo ratones femeninos, otros protocolos para el establecimiento de infección del tracto urinario en ratones machos han sido reportados³¹. En este modelo, cistitis en ratones machos también siguió el camino IBC. Como las vejigas de los ratones machos y hembras son similares en tamaño, Anticipamos que nuestro protocolo de aislamiento de IBC puede ser utilizado en ratones machos infectados también.

La tecnología relativamente simple utilizada en este protocolo también asegura que pueden implementarse en la mayoría de los laboratorios. Uno de los pasos claves involucrados en el presente Protocolo es la tracción de tubos capilares de vidrio para crear microcapilares para seleccionar el tipo de célula de interés. Este paso permite la flexibilidad en los diámetros de microcapilares creado, y por lo tanto el método puede ser extendido a múltiples tipos de células diferentes. Sin embargo, debido a la variación inherente en la creación de estos capilares, debe tenerse cuidado para asegurar que el diámetro final es en un rango útil. Si los capilares son demasiado angostos, no recoger las células de interés, pero si se hacen demasiados, podrían ser seleccionados varias celdas en un solo intento. Además, el uso de una llama abierta durante el proceso de tirar capilar lleva riesgo de quemaduras e incendios, así que el investigador intenta crear microcapilares debe tener cuidado para evitar que este tipo de eventos. Para reducir la variabilidad, así como el riesgo de fuego abierto involucrados en la fabricación de estos tubos capilares, el investigador podría hacer uso de una micropipeta tradicional tirando de máquina, tales como los utilizados para los experimentos electrofisiológicos (p. ej., PC-100, grupo Narishige). Como estas máquinas hacen uso de gravedad o de plataformas robóticas para tirar de los capilares, pueden ser adaptados para satisfacer las necesidades del modelo de infección. Sin embargo, la amplia gama de tirar máquinas micropipeta significará que el investigador tendrá que ir a través de algún ensayo y error para determinar el diámetro capilar final apropiado para su uso con este protocolo.

El protocolo presentado hace uso de bacterias expresando una etiqueta fluorescente para identificar visualmente el IBC. Por lo tanto, esta técnica está limitada por la capacidad de los investigadores para modificar genéticamente el organismo infeccioso. Específicamente para UPEC, cepas formadoras de IBC como CFT073 NU14 se han transformado con éxito con GFP-expresando plásmidos^32,33,34; por lo tanto estos deben ser utilizables en el mismo protocolo. Basado en el área de la vejiga (70 mm²) ratón del³⁵, la longitud de las células epiteliales individuales (50-120 μm)¹⁷y la frecuencia de GRG en una vejiga solo¹⁶, trata de una estimación conservadora de la incidencia de GRG 1 en 1.000 las células (o 0.1%). Esta estimación muestra la utilidad de nuestro protocolo de aislamiento celular destino eventos raros. La precisión de la selección de la célula a través de nuestro protocolo y la amplia gama de diámetros capilares que puede sugerir que este protocolo puede utilizarse para aislar bacterias intracelulares de otros modelos in vivo e in vitro de infección. De hecho, hemos utilizado con éxito esta técnica para aislar las células epiteliales de vejiga cultivadas infectados (datos no mostrados).

Uno de los más técnicamente difícil pasos en el protocolo es invertir la vejiga para exponer las células epiteliales de raspado. Hemos encontrado que también es posible hacer una incisión en la vejiga para splay hacia fuera para raspar. Sin embargo debido cuidado para reducir el daño a las células epiteliales de la vejiga durante el proceso de corte abierto; Idealmente debería utilizarse un solo corte para splay la vejiga abierta. Además, el corte debe hacerse en PBS frío, para evitar la pérdida accidental de células o tejido de la vejiga durante el proceso.

Boca el pipeteo de la IBC en este protocolo proporciona un mayor control sobre el proceso de selección de celda, así como limitar el volumen final de solución transferido junto con la célula. El control fino y gran separación de la solución de boca de los investigadores también maximiza la seguridad del investigador, como los volúmenes transferidos dentro el nanoliter a gama de microlitro. Por el contrario, nuestra experiencia con la micropipeta moderno es que tiende a transferir más células con el IBC, llevando potencialmente a la contaminación con bacterias luminales extracelulares y líquido circundante. Nuestro hallazgo de que boca pipeteo proporciona un rendimiento superior sobre otra célula solo métodos de aislamiento también se ha divulgado por otros laboratorios^22,23,24. Aparte de aislamiento de células individuales, boca pipeteo ha incluso utilizado en unicelulares electroporación de neuronas²⁵, que demuestra la utilidad y el control de minutos que un investigador entrenado puede lograr con la técnica. Sin embargo, la seguridad es primordial, y sugerimos posibles medidas adicionales que se pueden tomar dependiendo de los patógenos se utiliza: (i) la extensión de la memoria intermedia de aire entre el investigador y el material biológico, por ejemplo mediante una aspiración pipeta con un volumen más grande (por ejemplo, 5 mL), o (ii) adición de un filtro físico como algodón en la pipeta de aspiración para actuar como una barrera adicional.

En casos donde una evaluación del riesgo lleva a la conclusión de que boca pipeteo es todavía demasiado arriesgado, pueden combinarse con las otras secciones de nuestra técnica para proporcionar un método más seguro para configuraciones robóticas disponibles comercialmente (tales como ésos usados para nanoinjections) aislamiento de las células infectadas de poblaciones mixtas. Cabe señalar que nuestra experiencia con el uso de un micromanipulador robótica ha demostrado una disminución de la tasa de aislamiento de IBC en comparación con el pipeteo de la boca, como la gran variación intra experimental en tamaño de la célula epitelial de la vejiga hace que sea difícil para el usuario de un brazo robótico para determinar la fuerza requerida para recoger solo GRG. Sin embargo, sigue siendo una opción viable, aunque más costoso, para aquellos que trabajan con agentes altamente infecciosos de la enfermedad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf tube			For static bacterial culture and OD measurement
100% ethanol			For Alcohol Burner
15 mL conical tube			For static bacterial culture and OD measurement
1 mL Tuberculin Syringe	BD Biosciences	302100
3% Bacterial Agar			For static bacterial culture and OD measurement
70% ethanol			For static bacterial culture and OD measurement
Aesculap anatomic forceps	Braun/Kruuse	BD222R	For initial dissection of mouse (skin, fascia)
Alcohol Burner	Wheaton	237070
Aspirating pipette	BD Biosciences	357558
Aspirator tube	Sigma-Aldrich	A5177
Bacterial loops			For static bacterial culture and OD measurement
Benchtop centrifuge	Eppendorf	5424	Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes
Conical flasks			For static bacterial culture and OD measurement
Digital camera for microscope	Olympus	DP71	For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Glass Capillaries	Kimax	6148K07
Iris Scissors STR SS 110MM	Braun	BC110R
Isoflurane (Isothesia)	Henry Schein Animal Health	29405
Kanamycin Sulfate	Calbiochem	420311	For static bacterial culture and OD measurement
LB broth (Miller)	Thermo/Gibco	10855021	For static bacterial culture and OD measurement
Light source unit for microscope	Olympus	LG-PS2	For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Lubricant	KY		Any similar commercial medical lubricant will suffice
Macro fluorescence microscope	Olympus	MVX10	For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice
Micropipette + micropipette tips			For static bacterial culture and OD measurement
PBS 1x			For static bacterial culture and OD measurement
Pipette controller + Pipettes			For static bacterial culture and OD measurement
Polyethylene Tubing	BD Intramedic	427401
Precision Glide needle 30 G	BD Biosciences	305107	Possibly under new catalogue number (305106)
Splinter forceps curved	Braun	BD312R
Spray bottle (for ethanol)			For static bacterial culture and OD measurement
Square cuvettes	Elkay	127-1010-400	For static bacterial culture and OD measurement
Sterilgard III Advance Safety Cabinet	Baker	SG403	Any biosafety cabinet with a UV irridiator
Sterilin 90mm Standard Petri Dish	Thermo	101VR20	Any sterile petri dish
Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm	Braun	OK366R	Recommended for harvesting of bladder
Surgical Scissors STR S/B 105MM	Braun	BC320R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	5810R	Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals
WPA C08000 cell density meter	Biowave (Biochrom)	80-3000-45	For static bacterial culture and OD measurement