Autores
Contáctenos

Iniciar sesión

Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Detección de endotoxinas en nanomateriales modificados representa uno de los grandes retos en el campo de la nanomedicina. Aquí, presentamos un estudio de caso que describe el marco compuesto por tres formatos diferentes de LAL para estimar la potencial contaminación de endotoxina en nanopartículas.

Resumen

Cuando están presentes en productos farmacéuticos, una endotoxina de componentes de pared celular bacteriana Gram-negativas (a menudo también llamada lipopolisacárido) puede causar inflamación, fiebre, hipo o hipertensión y, en casos extremos, puede conducir a daño de órganos y tejidos que pueden se convierten en fatales. Las cantidades de endotoxinas en productos farmacéuticos, por lo tanto, están estrictamente reguladas. Entre los métodos disponibles para detección de endotoxinas y cuantificación, el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) es de uso general en todo el mundo. Mientras que cualquier producto farmacéutico puede interferir con el ensayo LAL, nano-formulaciones representan un desafío particular debido a su complejidad. El objetivo de este trabajo es proporcionar a una guía práctica a los investigadores sin experiencia en la estimación de endotoxinas en la ingeniería de nanomateriales y nanopartículas formulado drogas. En este documento, se discuten recomendaciones prácticas para llevar a cabo análisis de gel-clot y tres formatos LAL como turbidez, cromogénico. Estos ensayos pueden utilizarse para determinar contaminación por endotoxinas en productos basados en nanotecnología, vacunas y adyuvantes.

Introducción

Una endotoxina es un componente de la pared celular bacteriana Gram-negativos1,2. Puede activar las células inmunes en muy bajas concentraciones de (picogramo)1,2. Los mediadores proinflamatorios (citoquinas, leucotrienos, eicosanoides, etc.) producidos por las células en respuesta a una endotoxina son responsables de la fiebre, hipotensión, hipertensión y problemas de salud más severos incluyendo falta múltiple del órgano 1 , 2 , 3. la severidad de las mediada inmune efectos secundarios provocados por la endotoxina depende de su potencia determinada por la composición de la endotoxina y estructura y medida en unidades de endotoxina Internacional (IUs o EUs)3. El número de estas unidades por kilogramo de peso corporal se utiliza para establecer una dosis de umbral pirogénico de la endotoxina. Esta dosis es de que 5 EU/kg para productos farmacéuticos administrados vía todas las rutas pero la ruta intratecal. Medicamentos dosis por metro cuadrado de superficie del cuerpo, líquidos intraoculares, radiofármacos y productos administrados vía intratecal ruta tienen una dosis de pirógenos diferente umbral, que es de 100 EU/m2, 0.2 EU/mL, 175 EU/V (donde V es la volumen del producto destinado a la administración) y 0,2 EU/kg, respectivamente4. Más detalles sobre la dosis pirogénica de umbral para varios medicamentos y dispositivos se proporcionan y discuten en otra parte4,5,6.

Animales varían ampliamente en su sensibilidad a las reacciones mediadas por endotoxinas. Los seres humanos, primates no humanos y conejos están entre las especies más extremadamente sensibles a endotoxinas3. Para evitar mediada por endotoxinas efectos secundarios en los pacientes y evitar conclusiones inexactas de toxicidad preclínica y estudios de eficacia, es esencial para detectar y cuantificar endotoxinas en ambas formulaciones de grado clínico y preclínico exactamente. Varios métodos disponibles en la actualidad pueden lograr esta tarea. Uno de ellos es el ensayo de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), que se utiliza comúnmente en todo el mundo para productos biomédicos de la pantalla de la posible contaminación de endotoxina, así como para detectar infecciones bacterianas7,8,9. El lisado se prepara de amoebocytes, las células presentan en la sangre de los cangrejos de herradura Limulus polyphemus que residen en la costa este del continente de América del norte7. Interesante, hay algunas especies de cangrejos herradura (Tachypleus gigas y Tachypleus tridentatus) en Asia10. El lisado de Amoebocyte lysate (TAL) se utiliza en varios países asiáticos para la detección de endotoxina similar a cómo la LAL se utiliza en otros libres10. Los lisados (LAL y TAL) contienen un grupo de proteínas que al activarse le confieren actividad proteasa. Una de estas proteínas, el denominado Factor C se activa al contacto con la endotoxina. C Factor activado hiende Factor B, que a su vez también se convierte en una proteasa y hiende una enzima de coagulación pro para producir una coagulación enzimática. El resultado de esta cadena de reacciones es la formación de un gel, un aumento en la turbidez de la muestra y, en presencia de un sustrato cromogénico, la aparición de un producto coloreado, que sirven como base para gel-clot, turbiedad y ensayos cromogénicos, respectivamente. Aunque no existe ningún formato obligatorio de LAL, la US Food y Drug Administration (FDA) explica en la guía para documento de industria, que en caso de discrepancia en los resultados entre distintos formatos LAL, se tomó la decisión basado en el ensayo de gel-clot5 .

Muchos productos químicos de laboratorio de uso general (por ej., EDTA) y ensayos de drogas conocidos productos (p. ej., penicilina) interfieran con LAL11. La interferencia se suele identificar mediante la evaluación de la recuperación de la endotoxina estándar con una concentración conocida en una solución que contiene el material de prueba. Si la recuperación del punto es inferior al 50% o más del 200%, entonces el resultado de la LAL Ensayo para el material de prueba dada no es válido debido a la inhibición o aumento, respectivamente4. Formulaciones en base a nanotecnología son a menudo complejas e interfieren con la LAL a través de una variedad de mecanismos12,13,14. Se han descrito muchos enfoques para superar la interferencia: reconstitución de la muestra en los amortiguadores específicos y los tensioactivos, inactivación de la proteína por calefacción, destrucción de materiales huecos de lípidos por calentamiento y que complementa la muestra con exceso cationes divalentes5,12,13,14,15. También se han descrito métodos alternativos para situaciones cuando interferencia de LAL no puede superarse: ELISA, una célula de HEK-TLR4 reportero línea de ensayo y espectrometría de masas16,17,18, 19.

En este documento, se describen procedimientos experimentales para la realización de gel-clot, turbiedad y ensayos LAL cromogénicos. Estos ensayos también están disponibles en el laboratorio de caracterización de nanotecnología (NCL) Página Web20 en protocolos STE1.2 (turbidez LAL), STE1.3 (LAL gel-clot) y STE1.4 (LAL cromogénico). Se recomienda realizar al menos dos formatos diferentes para caracterizar la misma formulación de nano. Cuando no está de acuerdo resultados de la turbidez y el LAL cromogénico, los resultados de gel-clot se consideran5. Cuando no está de acuerdo resultados de los dos formatos LAL, adicional los resultados de estudios mediante test de activación de monocitos (MAT) o prueba de pirógenos de conejo (RPT) para verificar LAL son llevado a cabo21. Es importante tener en cuenta que cada método utilizado para la detección de endotoxina y evaluación pirógenos tiene ventajas y limitaciones21,22,23,24. Reconociendo las limitaciones del procedimiento utilizado para caracterizar una formulación determinada nanotecnología es esencial para obtener la justificación científica para el uso del procedimiento óptimo para nano-formulación.

En este estudio, doxorrubicina liposomal pegilada se utilizó como una formulación de nanopartículas de modelo. Esta formulación ha sido aprobada por la FDA en 1995 y utilizado para el tratamiento de pacientes de cáncer en todo el mundo25.

Protocolo

1. preparación de muestras de nanopartículas

  1. Preparar la muestra de estudio en LAL agua de calidad.
  2. Si el pH de la muestra está fuera del rango de 6-8, ajustar el pH con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio libre de pirógenos.
  3. LAL agua grado preparar varias diluciones de la muestra de estudio. Asegúrese de que la dilución más alta no supera la máxima dilución válida (MVD). Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la estimación del Ministerio del interior.

2. preparación de reactivos comunes entre formatos LAL

  1. Diluir la acción concentrada de hidróxido sódico con pirógenos LAL reactivo agua para preparar una solución de trabajo a una concentración de 0.1 N.
  2. Diluir la acción del ácido clorhídrico concentrado utilizando agua de reactivo LAL pirógenos y preparar una solución de trabajo a una concentración final de 0.1 N.
  3. Preparación de la endotoxina estándar de Control (CSE)
    1. Reconstituir el CSE según el certificado de análisis suministrado por el fabricante.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para notas importantes con respecto a la información proporcionada en el certificado. Consulte la Tabla de materiales para los detalles en cuanto a número de catálogo y la aplicación de una determinada formulación de CSE en diferentes formatos LAL.
  4. Preparación del reactivo LAL
    1. Reconstituir el reactivo LAL según el certificado de análisis suministrado por el fabricante.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para detalles importantes con respecto a la preparación del reactivo LAL. Consulte la Tabla de materiales para los detalles en cuanto a número de catálogo y la aplicación de una determinada formulación de reactivo LAL en diferente formato LAL.

3. turbidez ensayo LAL

  1. Preparación de los estándares de calibración
    1. 900 μl de agua grado LAL y 100 μl de CSE, preparar tantas diluciones intermedias según sea necesario para permitir la preparación de una calibración estándar con un rango de concentración de 0,001 a 1 UE/mL.
    2. Primero Etiquete tubos y agregar 900 μL de LAL-grade del agua en cada tubo. Luego agregar 100 μL de 10 UE/mL solutionn para preparar el estándar de calibración con la concentración de 1EU/mL.
    3. Repetir la dilución seriada 10 veces como se describió anteriormente para preparar tres estándares de calibración baja. Verificar que se han preparado cuatro estándares de calibración que van desde 0.001 a 1 UE/mL.
  2. Preparación de los controles de calidad
    1. Preparar un control de calidad UE/mL 0.05 combinando 50 μl de la 1 solución de la UE/mL CSE con 950 μl de LAL-grade del agua.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la preparación del control.
  3. Preparación de controles de inhibición/realce (IEC)
    1. Preparar IEC con concentración de 0.05 UE/mL mediante la combinación de 25 μl de la 1 solución de CSE UE/mL y 475 μl de los nanomateriales de prueba en una dilución dada.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles.
  4. Procedimiento experimental
    1. Que el instrumento caliente girando en aproximadamente 30 minutos de antelación. Ajuste la longitud de onda de detección a 660 nm ya que esto es apropiado para la turbiedad LAL.
    2. Identifícate escribiendo el nombre de usuario y contraseña.
    3. Abra el software (Tabla de materiales) haciendo clic en el icono correspondiente en una pantalla de ordenador.
    4. Seleccionar datos en la pantalla principal del software. Introduce la información del grupo de identificación y datos de prueba en el espacio correspondiente en la ficha General en la pantalla de inicio.
    5. Haga clic en la ficha Hardware Seleccione el tipo de instrumento en un menú desplegable.
    6. Ajuste la longitud de onda de detección a 660 nm ya que es apropiado para la turbiedad LAL por elegir el método de turbidez LAL.
    7. Verificar que un número de serie, ID de sistema e información de puerto serie aparecen en la pantalla. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Aceptar una vez más para confirmar.
    8. Introduzca el ID de la muestra en el mismo orden de que la muestra es probada. Use botones por defecto para introducir el control negativo, las muestras estándar de la curva y de la prueba.
    9. Preparar los tubos duplicados de cada muestra y agregar 200 μl (prueba de proporción 4:1) o 100 μl (prueba de relación 1:1) de control negativo (agua), estándares de calibración, control de calidad, IEC y prueba de nanopartículas en tubos de vidrio previamente etiquetados.
    10. Añadir 50 μl (prueba de proporción 4:1) o (prueba de relación 1:1) de 100 μl de reactivo LAL a primera prueba vial, vortex brevemente e insertar en la prueba de la ranura en el carrusel de instrumento. Si se usa la proporción 1:1, el volumen del reactivo LAL es 100 μl.
    11. Repita el procedimiento descrito anteriormente para otras muestras. Proceso de muestras de uno en uno.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles.

4. cromogénico LAL

  1. Preparación de estándares de calibración
    1. 900 μl de agua grado LAL y 100 μl de CSE, preparar tantas diluciones intermedias según sea necesario para permitir la preparación de una calibración estándar con una concentración de 1 UE/mL.
    2. 900 μl de agua de LAL-grado y 100 μl de la calibración EU/mL 1 estándar, preparar un segundo estándar de calibración a una concentración de 0.1 UE/mL.
    3. Repetir la dilución seriada 10 veces como se describió anteriormente para preparar estándares de calibración bajos dos. Verificar que se han preparado cuatro estándares de calibración que van desde 0.001 a 1 UE/mL.
  2. Preparación de controles de calidad.
    1. Preparar un control de calidad UE/mL 0.05 combinando 50 μl de la 1 solución de la UE/mL CSE con 950 μl de LAL-grade del agua.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles sobre la preparación del control.
  3. Preparación de controles de inhibición/realce (IEC)
    1. Preparar 0.05 UE/mL mediante la combinación de 25 μL de la 1 solución de la UE/mL CSE con 475 μL de nanomateriales de prueba.
      Nota: Refiérase a la sección de discusión para más detalles.
  4. Procedimiento experimental
    1. Que el instrumento caliente girando en aproximadamente 30 minutos de antelación. Ajuste la longitud de onda de detección a 405 nm ya que esto es apropiado para la turbiedad LAL.
    2. Abra el software haciendo clic en el icono correspondiente en una pantalla de ordenador. Identifícate escribiendo el nombre de usuario y contraseña.
    3. Seleccionar datos en la pantalla principal del software. Escriba prueba de identificación y datos de información del grupo en el espacio correspondiente en la ficha General en la pantalla de inicio.
    4. Haga clic en la ficha Hardware Seleccione el tipo de instrumento en un menú desplegable. Elegir el instrumento.
    5. Verificar que un número de serie, ID de sistema e información de puerto serie aparecen en la pantalla. Haga clic en Aceptar. Haga clic en Aceptar una vez más para confirmar.
    6. Introduzca el ID de la muestra en el mismo orden de que la muestra es probada. Use botones por defecto para introducir control negativo, las muestras estándar de la curva y de la prueba.
    7. Preparar los tubos duplicados de cada muestra y agregar 200 μl (prueba de proporción 4:1) o 100 μl (prueba de relación 1:1) de control negativo (agua), estándares de calibración, control de calidad, IEC y prueba de nanopartículas en tubos de vidrio previamente etiquetados.
    8. Añadir 50 μl (prueba de proporción 4:1) o (prueba de relación 1:1) de 100 μl de reactivo LAL a primera prueba vial, vortex brevemente e insertar en la prueba de la ranura en el carrusel de instrumento. Si se usa la proporción 1:1, el volumen del reactivo LAL es 100 μl.
    9. Repita el procedimiento descrito anteriormente para otras muestras. Proceso de muestras de uno en uno.

5. gel-Clot LAL

Nota: Este análisis identifican la presencia de endotoxinas en la muestra basada en la observación visual y la detección de un coágulo en el tubo de reacción. A continuación se describen los pasos experimentales. Utilizar una hoja de banco para registrar los resultados. Esta hoja de banco no es obligatoria, y otras maneras de registrar los resultados del ensayo son también aceptables. Un ejemplo de una hoja de banco se encuentra en materiales suplementarios para la conveniencia del lector. Lambda (l) es la sensibilidad del ensayo de gel-clot y 0,03 UE/mL.

  1. Etiqueta de tantos tubos de reacción según sea necesario para acomodar al número de muestras analizadas de la prueba. Consulte la hoja de banco para obtener más información sobre el número de réplicas utilizados en el paso 1, paso 2 y paso 3 del ensayo.
  2. Alícuota 100 μL de agua, controles o prueba de muestra por tubo.
  3. Preparar CSE tal que la concentración final es igual a 4λ.
  4. Mezclar 100 μL de la norma mencionada con 100 μL de muestra de agua o prueba para alcanzar la concentración final de CSE de 2λ. Repetir tres veces más para lograr la lambda y lambda mitad y un cuarto lambda.
  5. Asegúrese de que la temperatura en el baño de agua es de 37 ° C.
  6. Añada 100 μL de lisado por el tubo de ensayo, vortex brevemente y colocar la gradilla con los tubos en baño María durante 1 hora.
  7. Invertir el tubo con un movimiento suave.
  8. Resultados registros manualmente mediante "+" (coágulo firme) o "-" (no coágulo o coágulo flojo) en la ficha del Banco.
  9. Proceder con el análisis según la USP apuesta 854; utilice la hoja de banco como material de apoyo

Resultados

El ejemplo de los datos generados después de probar esta formulación en ensayos LAL se muestra en la tabla 1. Doxorrubicina liposomal pegilada interfirió con LAL cromogénico en dilución 5. Sin embargo, esta interferencia fue superada por diluciones mayores. Recuperación de pico fue entre 50 y 200% cuando esta fórmula fue probada en diluciones 50 y 500 en turbidez y LAL cromogénico, así como en la dilución 5 en turbidez LAL. Ajustado por el factor de dilución, l...

Discusión

La información proporcionada en este protocolo se ha descrito antes15,26 y se basa en varios documentos normativos publicados por el US Food y Drug Administration (FDA o FDA) y farmacopea de Estados Unidos (USP)4 , 5 , 6 , 27y también está disponible en el sitio web NCL20 en protocolos STE1.2 (turbidez LAL), S...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El estudio fue apoyado por fondos federales del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud, bajo contrato HHSN261200800001E. El contenido de esta publicación no reflejan necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de salud y servicios humanos, ni mención de nombres comerciales, productos comerciales, o las organizaciones implican la aprobación por el gobierno de Estados Unidos.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Turbidity LAL Assay
Sodium HydroxideSigmaS2770When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acidSigmaH9892When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL ReagentAssociates of Cape CodT0051This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin StandardAssociates of Cape CodE0005This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade waterAssociates of Cape CodWP0501This reagent can be used with any LAL format
Glucashield BufferAssociates of Cape CodGB051-25Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mLRAININPPT25, PPT10Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mLEppendorf22600044Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mLEppendorf30089669Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettorEppendorf4982000020Other equivalent supplies can be used
Microcetrifugeany brandAny brand can be used
Refrigerator, 2-8 Cany brandAny brand can be used
Vortexany brandAny brand can be used
Freezer, -20 Cany brandAny brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex readerAssociates of Cape CodPKF96Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL ReagentAssociates of Cape CodCG1500-5This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin StandardAssociates of Cape CodEC010This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium HydroxideSigmaS2770When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acidSigmaH9892When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade waterAssociates of Cape CodWP0501This reagent can be used with any LAL format
Glucashield BufferAssociates of Cape CodGB051-25Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mmAssociates of Cape CodTK100These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mlRAININPPT25, PPT10Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mLEppendorf22600044Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mLEppendorf30089669Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettorEppendorf4982000020Other equivalent supplies can be used
Microcetrifugeany brandAny brand can be used
Refrigerator, 2-8 Cany brandAny brand can be used
Vortexany brandAny brand can be used
Freezer, -20 Cany brandAny brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex readerAssociates of Cape CodPKF96Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL ReagentAssociates of Cape CodG5003This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin StandardAssociates of Cape CodE0005This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium HydroxideSigmaS2770When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acidSigmaH9892When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade waterAssociates of Cape CodWP0501This reagent can be used with any LAL format
Glucashield BufferAssociates of Cape CodGB051-25Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mmAssociates of Cape CodTB240These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mmAssociates of Cape CodTS050These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mLRAININPPT25, PPT10Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mLEppendorf22600044Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mLEppendorf30089669Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettorEppendorf4982000020Other equivalent supplies can be used
Microcetrifugeany brandAny brand can be used
Refrigerator, 2-8 Cany brandAny brand can be used
Vortexany brandAny brand can be used
Freezer, -20 Cany brandAny brand can be used
Water bath, 37 Cany brandAny brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results

Referencias

  1. Perkins, D. J., Patel, M. C., Blanco, J. C., Vogel, S. N. Epigenetic Mechanisms Governing Innate Inflammatory Responses. Journal of Interferon & Cytokine Research. 36 (7), 454-461 (2016).
  2. Vogel, S. N., Awomoyi, A. A., Rallabhandi, P., Medvedev, A. E. Mutations in TLR4 signaling that lead to increased susceptibility to infection in humans: an overview. Journal of Endotoxin Research. 11 (6), 333-339 (2005).
  3. Dobrovolskaia, M. A., Vogel, S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and deactivation by LPS. Microbes and Infection. 4 (9), 903-914 (2002).
  4. US Pharmacopeia. . Bacterial Endotoxins Test. , (2011).
  5. FDA, U. . Guidance for Industry: Pyrogen and Endotoxins Testing: Questions and Answers. , (2012).
  6. FDA, U. . Endotoxin Testing Recommendations for Single-Use Intraocular Ophthalmic Devices. , (2015).
  7. Fennrich, S., et al. More than 70 years of pyrogen detection: Current state and future perspectives. Alternatives to Laboratory Animals. 44 (3), 239-253 (2016).
  8. Kumar, M. S., Ghosh, S., Nayak, S., Das, A. P. Recent advances in biosensor based diagnosis of urinary tract infection. Biosensors and Bioelectronics. 80, 497-510 (2016).
  9. Solano, G., Gomez, A., Leon, G. Assessing endotoxins in equine-derived snake antivenoms: Comparison of the USP pyrogen test and the Limulus Amoebocyte Lysate assay (LAL). Toxicon. , 13-18 (2015).
  10. Akbar John, B., Kamaruzzaman, B. Y., Jalal, K. C. A., Zaleha, K. TAL - a source of bacterial endotoxin detector in liquid biological samples. International Food Research Journal. 19 (2), 423-425 (2012).
  11. Fujita, Y., Tokunaga, T., Kataoka, H. Saline and buffers minimize the action of interfering factors in the bacterial endotoxins test. Analytical Biochemistry. 409 (1), 46-53 (2011).
  12. Dobrovolskaia, M. A. Pre-clinical immunotoxicity studies of nanotechnology-formulated drugs: Challenges, considerations and strategy. Journal of Controlled Release. 220 (Pt B), 571-583 (2015).
  13. Dobrovolskaia, M. A., et al. Ambiguities in applying traditional Limulus amebocyte lysate tests to quantify endotoxin in nanoparticle formulations. Nanomedicine (London). 5 (4), 555-562 (2010).
  14. Dobrovolskaia, M. A., Neun, B. W., Clogston, J. D., Grossman, J. H., McNeil, S. E. Choice of method for endotoxin detection depends on nanoformulation. Nanomedicine (London). 9 (12), 1847-1856 (2014).
  15. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Considerations and Some Practical Solutions to Overcome Nanoparticle Interference with LAL Assays and to Avoid Endotoxin Contamination in Nanoformulations. Methods in Molecular Biology. 1682, 23-33 (2018).
  16. Boratynski, J., Szermer-Olearnik, B. Endotoxin Removal from Escherichia coli Bacterial Lysate Using a Biphasic Liquid System. Methods in Molecular Biology. 1600, 107-112 (2017).
  17. Li, H., Hitchins, V. M., Wickramasekara, S. Rapid detection of bacterial endotoxins in ophthalmic viscosurgical device materials by direct analysis in real time mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 943, 98-105 (2016).
  18. Uhlig, S., et al. Profiling of 3-hydroxy fatty acids as environmental markers of endotoxin using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1434, 119-126 (2016).
  19. Smulders, S., et al. Contamination of nanoparticles by endotoxin: evaluation of different test methods. Particle and Fibre Toxicology. 9, 41 (2012).
  20. . NCL assay cascade Available from: https://ncl.cancer.gov/resources/assay-cascade-protocols (2015)
  21. Dobrovolskaia, M. A., Germolec, D. R., Weaver, J. L. Evaluation of nanoparticle immunotoxicity. Nature Nanotechnology. 4 (7), 411-414 (2009).
  22. Borton, L. K., Coleman, K. P. Material-mediated pyrogens in medical devices: Applicability of the in vitro Monocyte Activation Test. Altex. , (2018).
  23. Stoppelkamp, S., et al. Speeding up pyrogenicity testing: Identification of suitable cell components and readout parameters for an accelerated monocyte activation test (MAT). Drug Testing and Analysis. 9 (2), 260-273 (2017).
  24. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I., Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. Altex. 33 (1), 47-53 (2016).
  25. Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. Journal of Controlled Release. 160 (2), 117-134 (2012).
  26. Neun, B. W., Dobrovolskaia, M. A. Detection and quantitative evaluation of endotoxin contamination in nanoparticle formulations by LAL-based assays. Methods in Molecular Biology. 697, 121-130 (2011).
  27. FDA, U. . Guidance for Industry: Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. , (2005).
  28. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a molecular nanotheranostic agent: effect of doxorubicin encapsulation in micelles or nanoemulsions on the ultrasound-mediated intracellular delivery and nuclear trafficking. Molecular Pharmaceutics. 7 (6), 1959-1973 (2010).
  29. Dabbagh, A., et al. Low-melting-point polymeric nanoshells for thermal-triggered drug release under hyperthermia condition. International Journal of Hyperthermia. 31 (8), 920-929 (2015).
  30. Li, Y., et al. Optimising the use of commercial LAL assays for the analysis of endotoxin contamination in metal colloids and metal oxide nanoparticles. Nanotoxicology. 9 (4), 462-473 (2015).
  31. Li, Y., et al. Bacterial endotoxin (lipopolysaccharide) binds to the surface of gold nanoparticles, interferes with biocorona formation and induces human monocyte inflammatory activation. Nanotoxicology. 11 (9-10), 1157-1175 (2017).

Reimpresiones y Permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos

Solicitar permiso

Explorar más artículos

Bioingenier an mero 143endotoxinananopart culasensayo LALinterferenciarecuperaci n de spikepir genoscontaminaci n

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Contáctenos

RECOMIENDE A LA BIBLIOTECA

BOLETINES de JoVE

Investigación

Educación

Autores

Bibliotecarios

ACERCA DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados