זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

Summary

זיהוי של endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים מייצג אחד האתגרים הגדול ביותר בתחום של ננו-רפואה. כאן, אנו מציגים חקר מקרה המתארת את המסגרת המורכבת LAL שלושה פורמטים שונים כדי להעריך את פוטנציאל זיהום אנדוטוקסין בחלקיקים.

Abstract

כאשר נוכח מוצרים פרמצבטיים, אנדוטוקסין רכיב הקיר תא החיידק גראם שליליים (הנקרא לעתים קרובות גם ליפופוליסכריד) יכול לגרום דלקת, חום, היפו - או יתר לחץ דם, במקרים קיצוניים, יכול לגרום נזק לרקמות ו עוגב זה ייתכן להיות קטלני. כמויות אנדוטוקסין במוצרי תרופות, לכן, הם מווסתים. בין השיטות הזמינות אנדוטוקסין זיהוי, כימות, וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) הוא נפוץ ברחבי העולם. בעוד כל מוצר התרופות עלולות להפריע וזמינותו לל, ננו-ניסוחים מייצגים אתגר מסוים עקב המורכבות שלהם. מטרת מאמר זה היא לספק מדריך מעשי חוקרים מנוסים באומדן endotoxins של ננו-חומרים מהונדסים וסמים ניסח ננו-חלקיק. במסמך זה, המלצות מעשיות לביצוע שלוש תבניות LAL כולל עכירות, הדפסות כסף, ג'ל-קריש מבחני נידונות. מבחני אלה יכול לשמש כדי לקבוע אנדוטוקסין זיהום מוצרים מבוססי ננו-טכנולוגיה תרופות, חיסונים, adjuvants.

Introduction

אנדוטוקסין היא אבן בניין של הקיר תא החיידק גראם שליליים^1,2. זה יכול להפעיל את התאים החיסוניים ב מאוד נמוכה (picogram) ריכוזים^1,2. המתווכים proinflammatory (ציטוקינים, לאוקוטריאנים, eicosanoids, וכו ') המיוצר על ידי תאי בתגובה אנדוטוקסין אחראים קדחת, תת לחץ דם, יתר לחץ דם, בעיות בריאות חמורות יותר, כולל אי ספיקת איברים מרובים ^{1 , 2 , 3}. חומרת בתיווך החיסון תופעות המופעלות על-ידי אנדוטוקסין תלוי מחריפותו נקבעים על-ידי אנדוטוקסין הרכב ואת מבנה ומדד אנדוטוקסין הבינלאומי יחידות (IUs או EUs)³. המספר של יחידות אלה לכל קילוגרם של משקל גוף משמשת להגדרת מנה פירוגני הסף של אנדוטוקסין. מינון זה הוא ש-5 האיחוד האירופי לק"ג למוצרים סמים מנוהל באמצעות כל נתיבי אבל המסלול במחלה. סמים עצומות למטר מרובע של פני השטח של הגוף, נוזלים תוך-עיני, radiopharmaceuticals מוצרים מנוהל באמצעות מסלול במחלה יש מנה פירוגני סף שונות, אשר הוא 100 האיחוד האירופי/m², האיחוד האירופי 0.2/mL, האיחוד האירופי 175/V (איפה V נפח של המוצר מיועד עבור ניהול), ו- 0.2 האיחוד האירופי לק"ג, בהתאמה⁴. פרטים נוספים אודות המנה פירוגני מסף סמים מוצרים והתקנים שונים הינם מסופקים, נדון במקום אחר^4,5,6.

חיות להשתנות באופן נרחב את רגישותם בתיווך אנדוטוקסין תגובות. בני אדם, קופים, ארנבים הם בין המינים רגישים ביותר ביותר endotoxins³. כדי למנוע תופעות לוואי בתיווך אנדוטוקסין בחולים ולמנוע המסקנות לא מדויק של רעילות פרה ולימודי היעילות, זה חיוני כדי לזהות ולכמת endotoxins ניסוחים כיתה-קליניים ומחקרים קליניים מראש שני במדויק. מספר שיטות זמין כרגע ניתן להשיג משימה זו. אחד מהם הוא וזמינותו Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), אשר נמצא בשימוש נפוץ ברחבי העולם מוצרים ביו מסך עבור פוטנציאל אנדוטוקסין לזיהום גם באשר לזהות זיהומים חיידקיים^7,8,9. Lysate הוא מוכן מן amoebocytes, התאים הנוכחי בדם של הפרסה סרטנים Limulus פוליפמוס המתגוררים לחוף המזרחי של יבשת צפון אמריקה⁷. מעניין, יש כמה מינים שונים של סרטנים פרסה (Tachypleus גיגס , Tachypleus tridentatus) ב אסיה¹⁰. Tachypleus Amoebocyte Lysate (טל) משמש במספר מדינות אסיה איתור אנדוטוקסין הדומה איך LAL משמש cuntries¹⁰. Lysates (LAL וטל) מכילים קבוצה של חלבונים המקנים בעת הפעלת פרוטאז פעילות. אחד החלבונים האלה, הגורם כביכול C מופעל בעת מגע עם אנדוטוקסין. C גורם שהופעל cleaves Factor B, אשר בתורו גם הופך פרוטאז ודבק אנזים קרישת pro כדי לייצר אנזים קרישת דם. התוצאה של תגובות שרשרת הזאת היא היווצרות של ג'ל, עלייה של עכירות מדגם ו, בנוכחות מצע הדפסות כסף, המראה של מוצר צבעוניים, אשר לשמש בסיס ג'ל-קריש דם, עכירות, מבחני הדפסות כסף, בהתאמה. אמנם יש תבנית LAL אין חובה, של מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) מסביר ההדרכה עבור תעשיית המסמך, כי במקרה של אי-התאמה בתוצאות הבדיקה בין פורמטים שונים לל, ההחלטה בהתבסס על וזמינותו ג'ל-קריש⁵ .

רבים נפוץ כימיקלים המעבדה (למשל., EDTA), סמים ידוע מוצרים (לדוגמה פניצילין) להפריע LAL מבחני¹¹. ההפרעות מזוהה בדרך כלל על-ידי הערכת ההתאוששות של אנדוטוקסין תקן עלה בריכוז ידוע לתוך פתרון המכיל את החומר. אם השחזור ספייק הוא פחות מ- 50% או יותר מאשר 200%, אז התוצאה של LAL assay עבור החומר מבחן נתון אינו חוקי עקב עיכוב או שיפור, בהתאמה⁴. ניסוחים המבוסס על ננו-טכנולוגיה מורכבים לעיתים קרובות ומשבשים LAL באמצעות מגוון רחב של מנגנונים^12,13,14. גישות רבות תוארו להתגבר על ההפרעות: שיחזור מדגם מאגרים ספציפיים, פיתחה, חלבון איון על ידי חימום, הרס של חומרי חלול מבוססי השומנים על ידי חימום ומשלימות את הדגימה. עם עודף קטיונים דו ערכיים^{5,12,13,14,15}. שיטות אלטרנטיביות במצבים כאשר לא ניתן להתגבר על הפרעות LAL גם תוארו: אליסה, תא כתב HEK-TLR4 קו assay, ספקטרומטר מסה^{16,17,18, 19}.

במסמך זה, מתוארים הליכים ניסיוני לעריכת ג'ל-קריש דם, עכירות, מבחני LAL הדפסות כסף. מבחני אלה הינם גם זמינים על אתר ננוטכנולוגיה אפיון מעבדה (NCL)²⁰ בפרוטוקולים STE1.2 (עכירות LAL), STE1.3 (LAL ג'ל-clot) ו STE1.4 (LAL הדפסות כסף). מומלץ לבצע לפחות שתי תבניות שונות לאפיון הננו-ניסוח זהה. כאשר תוצאות של עכירות, הדפסות כסף LAL מסכימים, התוצאות ג'ל-קריש דם נחשבים⁵. כאשר התוצאות של שתי תבניות LAL מסכימים, נוספים הם ממצאי מחקרים באמצעות מונוציט הפעלת מבחן (MAT) או ארנב pyrogen מבחן (RPT) כדי לוודא LAL ערכו²¹. חשוב לציין כי כל שיטה המשמש לצורך זיהוי אנדוטוקסין לפירוגניות הערכה יש יתרונות ומגבלות^21,22,23,24. הכרה במגבלות של ההליך שימוש כדי לאפיין את ניסוח ננוטכנולוגיה נתון חיוני להשגת הצדקה מדעית לשימוש של האופטימלית עבור הננו-ניסוח זה ההליך.

במחקר זה, שימש PEGylated liposomal דוקסורוביצין ניסוח nanoparticle מודל. ניסוח זה אושר על ידי FDA בארה ב בשנת 1995 ומשמשת לטיפול סרטן מטופלים ברחבי העולם²⁵.

Protocol

1. הכנת דוגמאות ננו-חלקיק

1. הכנת המדגם במחקר ב- LAL כיתה מים.
2. אם ה-pH הדגימה מחוץ לטווח 6-8, להתאים את ה-pH באמצעות pyrogen ללא סודה קאוסטית או חומצה הידרוכלורית.
3. באמצעות LAL כיתה מים להכין מספר דילולים המדגם במחקר. ודא כי דילול הגבוה ביותר לא יעלה על דילול מרבי חוקי (MVD). עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת פרטים אודות MVD שערוך.

2. הכנת ריאגנטים משותף בין תבניות לל

1. לדלל נתרן הידרוקסידי מרוכז מניות באמצעות מים ריאגנט LAL ללא pyrogen להכין את הפתרון עובד-ריכוז של 0.1 ש
2. לדלל מלאי חומצה הידרוכלורית מרוכזת באמצעות ללא pyrogen לל ריאגנט מים ולהכין הפתרון עובד-ריכוז סופי של 0.1 ש
3. הכנת אנדוטוקסין סטנדרטי שליטה (ס)
   1. לשקם ס להנדסה ולמדעיי המחשב על פי האישור של ניתוח המסופקים על ידי היצרן.
      הערה: עיין בסעיף הדיון עבור הערות חשובות בנוגע למידע הכלול באישור. עיין בטבלה של חומרים עבור הפרטים לגבי מספר קטלוג ויישום של ניסוח של ביה ס נתון בתבניות LAL שונות.
4. הכנת הכימית לל
   1. לשקם הכימית לאל על פי האישור של ניתוח המסופקים על ידי היצרן.
      הערה: עיין בסעיף הדיון פרטים חשובים לגבי הכנה ריאגנט לל. עיין בטבלה של חומרים עבור הפרטים לגבי מספר קטלוג ויישום של ניסוח ריאגנט LAL נתון בתבנית LAL שונים.

3. עכירות LAL Assay

1. הכנת הסטנדרטים כיול
   1. שימוש µL 900 LAL כיתה מים 100 µL של ביה ס, להכין כמה שיותר דילולים ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת כיול סטנדרטי עם טווח הריכוז מ 0.001 האיחוד האירופי 1/mL.
   2. תחילה תווית צינורות ולהוסיף μL 900 LAL-כיתה מים לתוך כל שפופרת. לאחר מכן להוסיף 100 μL של solutionn של האיחוד האירופי/mL 10 להכין כיול סטנדרטי עם ריכוז של 1EU/mL.
   3. חזור על דילול 10-fold טורי כמתואר לעיל כדי להכין שלושה סטנדרטים כיול נמוכה יותר. ודא כי היה מוכן ארבעה סטנדרטים כיול ועד 0.001 האיחוד האירופי 1/mL.
2. הכנה של פקדים איכות
   1. להכין בקרת איכות של האיחוד האירופי/mL 0.05 על ידי שילוב µL 50 של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם µL 950 מים LAL-כיתה.
      הערה: עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת פרטים לגבי הכנה שליטה.
3. הכנה של פקדים עיכוב/שיפור (חברת החשמל)
   1. להכין IEC עם ריכוז של האיחוד האירופי 0.05/mL על-ידי שילוב µL 25 של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 µL 475 של nanomaterial הבדיקה לדילול נתון.
      הערה: עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.
4. ניתוח ניסיוני
   1. לאפשר את המכשיר להתחמם על-ידי הפעלת הוא כ 30 דקות מראש. הגדרת אורך הגל זיהוי כדי 660 ננומטר כמו זה מתאים עכירות לל.
   2. היכנס על-ידי הקלדת את שם המשתמש והסיסמה.
   3. פתח את התוכנה (טבלה של חומרים) על-ידי לחיצה על הסמל המתאים על מסך המחשב.
   4. בחר לאסוף נתונים במסך הבית של התוכנה. הזן את המידע קבוצת הבדיקה מזהה ונתונים לחלל המתאים בכרטיסייה ' כללי ' במסך הבית.
   5. לחץ על הכרטיסיה חומרה לבחור את סוג מכשיר מתוך התפריט הנפתח.
   6. הגדרת אורך הגל זיהוי כדי 660 ננומטר כפי שהוא מתאים עכירות לאל על-ידי בחירת השיטה עכירות לל.
   7. ודא כי המספר הסידורי, מזהה המערכת ומידע יציאה טורית מופיעים על המסך. לחץ על אישור. לחץ על אישור שוב כדי לאשר.
   8. הזן את מזהה מדגם באותו סדר שהמדגם נבדק. השתמש ללחצני ברירת מחדל כדי להזין את שליטה שלילי, דגימות עיקול ו מבחן סטנדרטי.
   9. להכין צינורות כפולים עבור כל דגימה ולהוסיף 200 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של שליטה שלילי (מים), סטנדרטים כיול, בקרת איכות, חברת החשמל ו מבחן חלקיקים לתוך צינורות זכוכית שכותרתו מראש.
   10. להוסיף 50 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של ריאגנט LAL הראשון הבקבוקון הבדיקה, מערבולת זה בקצרה, והוספה לתוך מבחן חריץ של הקרוסלה כלי. אם היחס 1:1, הנפח של הכימית LAL לא 100 µL.
   11. חזור על הפעולות המתוארות לעיל לקבלת דוגמאות אחרות. תהליך דוגם אחד בכל פעם.
       הערה: עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.

4. הדפסות כסף לל

1. הכנת סטנדרטים כיול
   1. שימוש µL 900 LAL כיתה מים 100 µL של ביה ס, להכין כמה שיותר דילולים ביניים לפי הצורך, כדי לאפשר הכנת כיול סטנדרטי עם ריכוז של האיחוד האירופי 1/mL.
   2. באמצעות מים כיתה LAL µL 900 ו 100 µL של הכיול האירופי/mL 1 רגיל, להכין תקן כיול השני-ריכוז של האיחוד האירופי 0.1/mL.
   3. חזור על דילול 10-fold טורי כמתואר לעיל כדי להכין שני סטנדרטים כיול נמוכה יותר. ודא כי היה מוכן ארבעה סטנדרטים כיול ועד 0.001 האיחוד האירופי 1/mL.
2. הכנת פקדים איכות.
   1. להכין בקרת איכות של האיחוד האירופי/mL 0.05 על ידי שילוב µL 50 של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם µL 950 מים LAL-כיתה.
      הערה: עיין בסעיף ' דיון ' לקבלת פרטים לגבי הכנה שליטה.
3. הכנה של פקדים עיכוב/שיפור (חברת החשמל)
   1. הכן האיחוד האירופי 0.05/mL על ידי שילוב של 25 μL של הפתרון של האיחוד האירופי/mL ביה ס 1 עם μL 475 של מבחן nanomaterial.
      הערה: עיין בסעיף הדיון לפרטים נוספים.
4. ניתוח ניסיוני
   1. לאפשר את המכשיר להתחמם על-ידי הפעלת הוא כ 30 דקות מראש. הגדרת אורך הגל זיהוי כדי 405 ננומטר כמו זה מתאים עכירות לל.
   2. פתח את התוכנה על ידי לחיצה על הסמל המתאים על מסך המחשב. היכנס על-ידי הקלדת את שם המשתמש והסיסמה.
   3. בחר לאסוף נתונים במסך הבית של התוכנה. הזן מידע קבוצת זהות ונתונים מבחן לחלל המתאים בכרטיסייה ' כללי ' במסך הבית.
   4. לחץ על הכרטיסיה חומרה לבחור את סוג מכשיר מתוך התפריט הנפתח. לבחור את המכשיר.
   5. ודא כי המספר הסידורי, מזהה המערכת ומידע יציאה טורית מופיעים על המסך. לחץ על אישור. לחץ על אישור שוב כדי לאשר.
   6. הזן את מזהה מדגם באותו סדר שהמדגם נבדק. השתמש בלחצני ברירת המחדל כדי להזין בקרה שלילית, דגימות עיקול ו מבחן סטנדרטי.
   7. להכין צינורות כפולים עבור כל דגימה ולהוסיף 200 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של שליטה שלילי (מים), סטנדרטים כיול, בקרת איכות, חברת החשמל ו מבחן חלקיקים לתוך צינורות זכוכית שכותרתו מראש.
   8. להוסיף 50 µL (מבחן היחס 4:1) או 100 µL (מבחן יחס 1:1) של ריאגנט LAL הראשון הבקבוקון הבדיקה, מערבולת זה בקצרה, והוספה לתוך מבחן חריץ של הקרוסלה כלי. אם היחס 1:1, הנפח של הכימית LAL לא 100 µL.
   9. חזור על הפעולות המתוארות לעיל לקבלת דוגמאות אחרות. תהליך דוגם אחד בכל פעם.

5. ג'ל-קריש לל

הערה: זו assay מזהה הנוכחות של endotoxins במדגם בהתבסס על התצפית הויזואלית גילוי של קריש דם בצינור התגובה. השלבים ניסיוני שיפורטו להלן. להשתמש סדין הספסל כדי לתעד את התוצאות. גיליון ספסל זה לא חובה, דרכים אחרות של הקלטה התוצאות assay מקובלים גם. דוגמה כזו גיליון ספסל מסופק בחומרים משלים לנוחיות הקורא. למבדה (l) היא הרגישות של ג'ל-קריש וזמינותו והיא האיחוד האירופי 0.03 נקודות/mL.

1. תווית צינורות התגובה רבים לפי הצורך כדי להתאים את מספר הבדיקה שנותחה דוגמאות. עיין בגיליון ספסל לקבלת פרטים אודות מספר משכפל בשימוש שלב 1, שלב 2, שלב 3 מתוך וזמינותו.
2. ΜL 100 aliquot דגימת מים, פקדים או מבחן למחזור.
3. הכן של ביה ס כך הריכוז הסופי שווה ל- 4λ.
4. לשלב 100 μL של תקן הנ עם μL 100 דגימת מים או מבחן כדי להשיג את הריכוז הסופי של ביה ס של 2λ. חזור עוד שלוש פעמים כדי להשיג למדא, חצי-למבדה, רבע למדא.
5. ודא כי הטמפרטורה באמבט מים היא 37 מעלות צלזיוס.
6. להוסיף 100 μL של lysate לכל מבחנה, מערבולת בקצרה ומניחים על האצטבה עם כל הקברים לאמבט מים לשעה.
7. היפוך ברכבת התחתית עם תנועה חלקה.
8. תוצאות לתעד באופן ידני באמצעות "+" (חברת קריש) או "–" (אין קריש דם או קריש דם חופשי) בגיליון ספסל.
9. להמשיך עם הניתוח על פי ה USP ההימור 85⁴; להשתמש בגליון ספסל תמיכה חומר

תוצאות

הדוגמה של נתונים שנוצרו לאחר בדיקות ניסוח זה מבחני LAL מוצג בטבלה 1. PEGylated liposomal דוקסורוביצין התערב עם הדפסות כסף LAL-דילול 5. עם זאת, הפרעה זו הוכרע על ידי דילולים רבתי. שחזור ספייק היה בין 50 ל- 200%, כאשר ניסוח זה נבחנה ב דילולים 50 ו-500 עכירות ו לל הדפסות כסף, כמו גם דילול 5 ...

Discussion

במידע הנמסר פרוטוקול זה תואר קודם^15,26 ומסתמך על מספר מסמכי רגולציה שפורסם על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA או ה-FDA) ואת ארצות הברית פרמקופיאה (USP)^{4 , 5 , 6 , 27}, והוא גם זמין באתר NCL

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide	Sigma	S2770	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid	Sigma	H9892	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent	Associates of Cape Cod	T0051	This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard	Associates of Cape Cod	E0005	This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water	Associates of Cape Cod	WP0501	This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer	Associates of Cape Cod	GB051-25	Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TK100	These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL	Eppendorf	22600044	Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor	Eppendorf	4982000020	Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge	any brand		Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C	any brand		Any brand can be used
Vortex	any brand		Any brand can be used
Freezer, -20 C	any brand		Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader	Associates of Cape Cod	PKF96	Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent	Associates of Cape Cod	CG1500-5	This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard	Associates of Cape Cod	EC010	This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide	Sigma	S2770	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid	Sigma	H9892	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water	Associates of Cape Cod	WP0501	This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer	Associates of Cape Cod	GB051-25	Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TK100	These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml	RAININ	PPT25, PPT10	Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL	Eppendorf	22600044	Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor	Eppendorf	4982000020	Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge	any brand		Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C	any brand		Any brand can be used
Vortex	any brand		Any brand can be used
Freezer, -20 C	any brand		Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader	Associates of Cape Cod	PKF96	Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent	Associates of Cape Cod	G5003	This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard	Associates of Cape Cod	E0005	This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide	Sigma	S2770	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid	Sigma	H9892	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water	Associates of Cape Cod	WP0501	This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer	Associates of Cape Cod	GB051-25	Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TS050	These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL	Eppendorf	22600044	Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor	Eppendorf	4982000020	Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge	any brand		Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C	any brand		Any brand can be used
Vortex	any brand		Any brand can be used
Freezer, -20 C	any brand		Any brand can be used
Water bath, 37 C	any brand		Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results