Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

Riepilogo

Rilevamento di endotossine in nanomateriali ingegnerizzati rappresenta una delle grandi sfide nel campo della nanomedicina. Qui, presentiamo un caso di studio che descrive il quadro composto da tre diversi formati LAL per stimare il potenziale contaminazione di endotossina in nanoparticelle.

Abstract

Quando sono presenti in prodotti farmaceutici, un'endotossina di componente la parete cellulare batterica gram-negativi (spesso anche chiamato lipopolisaccaride) può causare infiammazione, febbre, IPO - o ipertensione e, in casi estremi, può portare a danni del tessuto e dell'organo che può diventare fatale. Gli importi dell'endotossina in prodotti farmaceutici, pertanto, sono strettamente regolamentati. Tra i metodi disponibili per il rilevamento di endotossina e quantificazione, il dosaggio di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) è comunemente usato in tutto il mondo. Mentre qualsiasi prodotto farmaceutico può interferire con il dosaggio LAL, nano-formulazioni rappresentano una sfida particolare per la loro complessità. Lo scopo di questa carta è quello di fornire una guida pratica ai ricercatori inesperti nella stima endotossine nei nanomateriali ingegnerizzati e formulato in nanoparticelle di farmaci. Nel presente documento, consigli pratici per l'esecuzione di tre formati LAL tra cui torbidità, cromogenico e gel-clot saggi sono discussi. Queste analisi possono essere utilizzate per determinare la contaminazione da endotossine adiuvanti, vaccini e farmaci basati sulle nanotecnologie.

Introduzione

Un'endotossina è un blocco di costruzione della parete cellulare batterica gram-negativi^1,2. Può attivare le cellule immunitarie a molto bassa (picogrammo) concentrazioni^1,2. I mediatori proinfiammatori (eicosanoidi, leucotrieni, citochine, ecc.) prodotti dalle cellule in risposta a un'endotossina sono responsabili di febbre, ipotensione, ipertensione e problemi di salute più gravi tra cui guasto multiplo dell'organo ^{1 , 2 , 3}. la gravità di immune-mediata effetti collaterali innescati l'endotossina dipende dalla sua potenza determinata dalla struttura e composizione dell'endotossina e misurato in unità internazionali dell'endotossina (IUs o EUs)³. Il numero di queste unità per chilogrammo di peso corporeo viene utilizzato per impostare una soglia dose pirogeno dell'endotossina. Questa dose è di che 5 EU/kg per i prodotti di farmaco somministrato per via tutte le rotte ma la via intratecale. Farmaci dosati per metro quadrato di superficie corporea, liquidi intraoculari, radiofarmaci e prodotti amministrato via intratecale hanno una dose di pirogeno soglia diversa, ovvero 100 EU/m², 0,2 EU/mL, 175 EU/V (dove V è la volume del prodotto destinato alla somministrazione) e 0,2 EU/kg, rispettivamente⁴. Più particolari circa la dose soglia pirogeno per vari prodotti farmaceutici e dispositivi sono forniti e discussi altrove^4,5,6.

Animali variano ampiamente nella loro sensibilità alle reazioni dell'endotossina-mediata. Gli esseri umani, primati non umani e i conigli sono tra le specie più estremamente sensibili alle endotossine³. Per evitare l'endotossina-mediata effetti collaterali nei pazienti ed evitare conclusioni inesatte di tossicità preclinica e studi di efficacia, è essenziale rilevare e quantificare le endotossine in entrambe le formulazioni grado clinico e preclinico accuratamente. Diversi metodi attualmente disponibili possono realizzare questo compito. Uno di loro è il dosaggio di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL), che è comunemente usato in tutto il mondo a schermo prodotti biomedicali per la potenziale contaminazione di endotossina pure per rilevare infezioni batteriche^7,8,9. Il lisato viene preparato da amoebocytes, le cellule presenti nel sangue dei granchi a ferro di cavallo del Limulus polyphemus che risiedono nella sponda orientale del continente Nord America⁷. Interessante, ci sono alcune specie di granchi a ferro di cavallo (Tachypleus gigas e Tachypleus tridentatus) in Asia¹⁰. Tachypleus Amoebocyte Lysate (TAL) è utilizzato in diversi paesi asiatici per la rilevazione dell'endotossina simile a come il Leone è usato in altri Pinti¹⁰. I lisati (LAL e TAL) contengono un gruppo di proteine che, al momento dell'attivazione, conferiscono l'attività della proteasi. Una di queste proteine, il cosiddetto fattore C viene attivata in caso di contatto con l'endotossina. C attivata fattore fende il fattore B, che a sua volta anche diventa una proteasi e si unirà un enzima pro-coagulazione per la produzione di un enzima coagulazione. Il risultato di questa catena di reazioni è la formazione di un gel, un aumento della torbidità del campione e, in presenza di un substrato cromogenico, l'aspetto di un prodotto colorato, che servono come base per gel-clot, torbidità e le analisi cromogeniche, rispettivamente. Mentre non esiste un formato obbligatorio di LAL, la US Food and Drug Administration (FDA) spiega la guida per a documento di industria, che in caso di discrepanza nei risultati del test tra diversi formati LAL, la decisione è presa basato sul dosaggio di gel-clot⁵ .

Molti prodotti chimici di laboratorio comunemente usati (ad es., EDTA) e farmaci noti prodotti (ad es., penicillina) interferire con LAL test¹¹. L'interferenza viene di solito identificato valutando il recupero dell'endotossina standard a spillo a una concentrazione nota in una soluzione contenente il materiale di prova. Se il recupero dei picchi è inferiore al 50% o più del 200%, quindi il risultato del LAL test per il materiale di prova specificato non è valido a causa della inibizione o miglioramento, rispettivamente⁴. Formulazioni a base di nanotecnologia sono spesso complesse e interferiscano con la LAL attraverso una varietà di meccanismi^12,13,14. Sono stati descritti molti approcci per superare l'interferenza: ricostituzione di campione in buffer specifici e tensioattivi, inattivazione della proteina da riscaldamento, distruzione di materiali cavi basata sui lipidi riscaldamento e integrando il campione con eccesso cationi bivalenti^{5,12,13,14,15}. Inoltre sono stati descritti metodi alternativi per situazioni in cui l'interferenza di LAL non può essere superato: ELISA, una cella di reporter HEK-TLR4 linea dosaggio e spettrometria di massa^{16,17,18, 19}.

Vengono descritte procedure sperimentali per lo svolgimento di gel-clot, torbidità e cromogenico LAL saggi. Queste analisi sono anche disponibili sul sito Web laboratorio di caratterizzazione di nanotecnologia (NCL)²⁰ nei protocolli STE1.2 (torbidità LAL), STE1.3 (gel-clot LAL) e STE1.4 (cromogenico LAL). Si consiglia di effettuare almeno due diversi formati per caratterizzare la stessa formulazione di nano. Quando risultati della torbidità e cromogenico LAL in disaccordo, i risultati di gel-coagulo sono considerati⁵. Quando in disaccordo risultati due formati di LAL, ulteriori studi utilizzando prova di attivazione di monociti (MAT) o test di coniglio pirogeni (RPT) per verificare LAL risultati sono condotti²¹. È importante notare che ogni metodo utilizzato per il rilevamento di endotossina e valutazione pirogenicità ha vantaggi e limitazioni^21,22,23,24. Riconoscere i limiti della procedura utilizzata per caratterizzare una formulazione di nanotecnologia dato è essenziale per ottenere la giustificazione scientifica per l'uso della procedura ottima per quel nano-formulazione.

In questo studio, doxorubicina liposomiale pegilata è stato usato come una formulazione di nanoparticelle di modello. Questa formulazione è stata approvata dalla FDA nel 1995 e utilizzata per il trattamento di pazienti di cancro in tutto il mondo²⁵.

Protocollo

1. preparazione dei campioni di nanoparticelle

1. Preparare il campione di studio in LAL acqua di grado.
2. Se il pH del campione è fuori dell'intervallo di 6-8, regolare il pH utilizzando apirogena di idrossido di sodio o acido cloridrico.
3. LAL l'utilizzo di acqua di qualità per preparare diverse diluizioni del campione di studio. Assicurarsi che la diluizione più alta non superi la massima diluizione valida (MVD). Fare riferimento alla sezione "discussione" per informazioni dettagliate sulla stima di MVD.

2. preparazione dei reagenti comuni tra formati di LAL

1. Stock di idrossido di sodio concentrato diluito con acqua di reagente LAL apirogena per preparare una soluzione di lavoro ad una concentrazione di 0,1 N.
2. Diluire l'acido cloridrico concentrato stock utilizzando acqua di reagente LAL apirogena e preparare una soluzione di lavoro ad una concentrazione finale di 0,1 N.
3. Preparazione dell'endotossina Standard di controllo (CSE)
   1. Ricostituire il CSE in base al certificato di analisi fornito dal produttore.
      Nota: Fare riferimento alla sezione discussione per note importanti per quanto riguarda le informazioni contenute nel certificato. Fare riferimento alla Tabella materiali per i dettagli per quanto riguarda il numero di catalogo e l'applicazione di una determinata formulazione CSE in diversi formati LAL.
4. Preparazione del reagente LAL
   1. Ricostituire il reagente LAL secondo il certificato di analisi fornito dal produttore.
      Nota: Fare riferimento alla sezione "discussione" per dettagli importanti per quanto riguarda la preparazione del reagente LAL. Fare riferimento alla Tabella materiali per i dettagli per quanto riguarda il numero di catalogo e l'applicazione di una formulazione di reagente LAL data in formato diverso di LAL.

3. torbidità LAL test

1. Preparazione di standard di calibrazione
   1. Con 900 µ l di acqua di grado LAL e 100 µ l di CSE, preparare diluizioni intermedie come molti come necessario per consentire la preparazione di una calibrazione standard con una gamma di concentrazione da 0.001 a 1 EU/mL.
   2. In primo luogo Etichettare provette e aggiungere 900 μL di acqua LAL-grado in ciascuna provetta. Quindi aggiungere 100 μL di 10 EU/mL solutionn a preparare standard di calibrazione con concentrazione di 1EU/mL.
   3. Ripetere la diluizione seriale 10 volte come descritto in precedenza per preparare tre standard di calibrazione più basso. Verificare che gli standard di calibrazione quattro che vanno da 0.001 a 1 EU/mL sono stati preparati.
2. Preparazione dei controlli qualità
   1. Preparare un controllo di qualità di EU/mL 0,05 unendo 50 µ l della 1 soluzione EU/mL CSE con 950 µ l di acqua di LAL-grado.
      Nota: Fare riferimento alla sezione "discussione" per i dettagli per quanto riguarda la preparazione dei controlli.
3. Preparazione dei controlli di inibizione/Enhancement (IEC)
   1. Preparare IEC con concentrazione di 0,05 EU/mL unendo 25 µ l della 1 soluzione EU/mL CSE e 475 µ l del nanomateriale prova un determinato fattore di diluizione.
      Nota: Fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori dettagli.
4. Procedura sperimentale
   1. Consentire allo strumento scaldare ruotando su circa 30 min di anticipo. Set-up della lunghezza d'onda di rilevamento a 660 nm come questo è appropriato per la torbidità LAL.
   2. Accedi digitando il nome utente e la password.
   3. Aprire il software (Tabella materiali) cliccando sull'icona corrispondente sullo schermo del computer.
   4. Selezionare raccogliere dati sulla schermata iniziale del software. Immettere le informazioni di gruppo ID e dati di prova nello spazio corrispondente nella scheda generale sulla schermata iniziale.
   5. Scegliere la scheda Hardware scegliere il tipo di strumento da un menu a discesa.
   6. Set-up della lunghezza d'onda di rilevamento a 660 nm come questo è appropriato per la torbidità LAL scegliendo il metodo di torbidità LAL.
   7. Verificare che un numero di serie, ID sistema e informazioni di porta seriale vengono visualizzati sullo schermo. Fare clic su OK. Fare clic su OK ancora una volta per confermare.
   8. Immettere l'ID campione nello stesso ordine che dell'esempio viene testato. Utilizzare i pulsanti predefiniti per inserire il controllo negativo, campioni di test e di curva standard.
   9. Preparare le provette duplicati per ogni campione e aggiungere 200 µ l (prova rapporto 4:1) o 100 µ l (1:1 di rapporto di prova) di controllo negativo (acqua), gli standard di calibrazione, controllo qualità, IEC e test di nanoparticelle in tubi di vetro pre-etichettata.
   10. Aggiungere 50 µ l (prova rapporto 4:1) o 100 µ l (1:1 di rapporto di prova) di reagente LAL prima fiala per test, vortice e brevemente e inserto in test slot nel carosello dello strumento. Se viene utilizzato il rapporto 1:1, il volume del reagente LAL è 100 µ l.
   11. Ripetere la procedura sopra descritta per altri campioni. Processo di campioni uno alla volta.
       Nota: Fare riferimento alla sezione di discussione per maggiori dettagli.

4. cromogenico LAL

1. Preparazione di standard di calibrazione
   1. Con 900 µ l di acqua di grado LAL e 100 µ l di CSE, preparare diluizioni intermedie come molti come necessario per consentire la preparazione di un standard di calibrazione con una concentrazione di 1 EU/mL.
   2. Utilizzando acqua di LAL-grado 900 µ l e 100 µ l 1 EU/mL standard di calibrazione, preparare un secondo standard di calibrazione ad una concentrazione di 0,1 EU/mL.
   3. Ripetere la diluizione seriale 10 volte come descritto in precedenza per preparare due inferiore standard di calibrazione. Verificare che gli standard di calibrazione quattro che vanno da 0.001 a 1 EU/mL sono stati preparati.
2. Preparazione dei controlli di qualità.
   1. Preparare un controllo di qualità di EU/mL 0,05 unendo 50 µ l della 1 soluzione EU/mL CSE con 950 µ l di acqua di LAL-grado.
      Nota: Fare riferimento alla sezione "discussione" per i dettagli per quanto riguarda la preparazione dei controlli.
3. Preparazione dei controlli di inibizione/Enhancement (IEC)
   1. Preparare 0,05 EU/mL unendo 25 μL della soluzione di CSE EU/mL 1 con 475 μL di nanomateriale prova.
      Nota: Fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori dettagli.
4. Procedura sperimentale
   1. Consentire allo strumento scaldare ruotando su circa 30 min di anticipo. Set-up della lunghezza d'onda di rilevamento a 405 nm come questo è appropriato per la torbidità LAL.
   2. Aprire il software cliccando sull'icona corrispondente sullo schermo del computer. Accedi digitando il nome utente e la password.
   3. Selezionare raccogliere dati sulla schermata iniziale del software. Immettere informazioni sul gruppo di test ID e i dati nello spazio corrispondente nella scheda generale sulla schermata iniziale.
   4. Scegliere la scheda Hardware scegliere il tipo di strumento da un menu a discesa. Scegli lo strumento.
   5. Verificare che un numero di serie, ID sistema e informazioni di porta seriale vengono visualizzati sullo schermo. Fare clic su OK. Fare clic su OK ancora una volta per confermare.
   6. Immettere l'ID campione nello stesso ordine che dell'esempio viene testato. Utilizzare i pulsanti predefiniti per immettere il controllo negativo, campioni di test e di curva standard.
   7. Preparare le provette duplicati per ogni campione e aggiungere 200 µ l (prova rapporto 4:1) o 100 µ l (1:1 di rapporto di prova) di controllo negativo (acqua), gli standard di calibrazione, controllo qualità, IEC e test di nanoparticelle in tubi di vetro pre-etichettata.
   8. Aggiungere 50 µ l (prova rapporto 4:1) o 100 µ l (1:1 di rapporto di prova) di reagente LAL prima fiala per test, vortice e brevemente e inserto in test slot nel carosello dello strumento. Se viene utilizzato il rapporto 1:1, il volume del reagente LAL è 100 µ l.
   9. Ripetere la procedura sopra descritta per altri campioni. Processo di campioni uno alla volta.

5. gel-Clot LAL

Nota: Questo test identifica la presenza di endotossine nel campione basato sull'osservazione visiva e la rilevazione di un coagulo nel tubo di reazione. La procedura sperimentale è descritti di seguito. Utilizzare un foglio di panca per registrare i risultati. Questo foglio di panca non è obbligatorio, e altri modi di registrare i risultati del saggio sono anche accettabili. Un esempio di un foglio di panchina è fornito in materiali supplementari per la comodità di un lettore. Lambda (l) è la sensibilità del dosaggio gel-clot e 0,03 EU/mL.

1. Etichettare le provette di reazione come molti come necessario per contenere il numero di campioni analizzati. Consultare la scheda di banco per informazioni dettagliate sul numero di repliche utilizzato nel passaggio 1, fase 2 e fase 3 del dosaggio.
2. Aliquotare 100 μL di campione di acqua, controlli o test per tubo.
3. Tale che la concentrazione finale è uguale a 4 λ, preparare CSE.
4. Combinare 100 μL dello standard di cui sopra con 100 μL di campione di acqua o test per ottenere la concentrazione finale di CSE di 2λ. Ripetere tre volte per raggiungere lambda e metà-lambda e un quarto lambda.
5. Assicurarsi che la temperatura del bagnomaria è 37 ° C.
6. Aggiungere 100 μL di lisato per provetta, vortex brevemente e dispongono la cremagliera con tutti i tubi nel bagno di acqua per 1 h.
7. Capovolgere la provetta con un movimento regolare.
8. Manualmente per registrare risultati utilizzando "+" (ditta coagulo) o "-" (Nessun coagulo o coagulo sciolto) sul foglio panchina.
9. Procedere con l'analisi secondo l' USP puntata 85⁴; utilizzare il foglio di panchina come materiale di supporto

Risultati

L'esempio di dati generati dopo aver testato questa formulazione in LAL test è mostrato in tabella 1. Doxorubicina liposomiale pegilata interferito con LAL cromogenico alla diluizione 5. Tuttavia, questa interferenza è stata superata per diluizioni superiori. Recupero dei picchi è stato compreso tra 50 e 200% quando questa formulazione è stata provata a diluizioni 50 e 500 nella torbidità e cromogenico LAL, così come alla diluizione 5 torbidità LAL. Quando regolato...

Discussione

Le informazioni fornite in questo protocollo sono stato descritto prima^15,26 e si basa su diversi documenti normativi pubblicati da la US Food and Drug Administration (FDA o FDA) e farmacopea statunitense (USP)^{4 , 5 , 6 , 27}ed è anche disponibile sul sito Web NCL²⁰ nei protocolli STE1.2 (torbidità LAL), STE1.3 ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Turbidity LAL Assay
Sodium Hydroxide	Sigma	S2770	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid	Sigma	H9892	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL Reagent	Associates of Cape Cod	T0051	This reagent can be used with turbidity assay only
Control Endotoxin Standard	Associates of Cape Cod	E0005	This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
LAL grade water	Associates of Cape Cod	WP0501	This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer	Associates of Cape Cod	GB051-25	Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TK100	These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL	Eppendorf	22600044	Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor	Eppendorf	4982000020	Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge	any brand		Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C	any brand		Any brand can be used
Vortex	any brand		Any brand can be used
Freezer, -20 C	any brand		Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader	Associates of Cape Cod	PKF96	Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Chromogenic LAL Assay
Pyrochrome LAL Reagent	Associates of Cape Cod	CG1500-5	This reagent is specific to the Chromogenic Assay
Control Endotoxin Standard	Associates of Cape Cod	EC010	This standard is different than that used for turbidity and gel-clot LALs; it is optimized for optimal performance in the chromogenic assay
Sodium Hydroxide	Sigma	S2770	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid	Sigma	H9892	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water	Associates of Cape Cod	WP0501	This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer	Associates of Cape Cod	GB051-25	Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 8 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TK100	These tubes can be used with turbidity and chromogenic assays
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1.0 ml	RAININ	PPT25, PPT10	Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL	Eppendorf	22600044	Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor	Eppendorf	4982000020	Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge	any brand		Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C	any brand		Any brand can be used
Vortex	any brand		Any brand can be used
Freezer, -20 C	any brand		Any brand can be used
Pyros Kinetix or Pyros Kinetix Flex reader	Associates of Cape Cod	PKF96	Other instruments can be used. However, LAL reagents and endotoxin standards used in this assay may require optimization. When other instrumentation is used, please refer to the instrument and LAL kit manufacturers for instructions
Gel-Clot LAL Assay
LAL Reagent	Associates of Cape Cod	G5003	This reagent is specific to the gel-clot assay
Control Endotoxin Standard	Associates of Cape Cod	E0005	This reagent can be used with turbidity and gel-clot assays
Sodium Hydroxide	Sigma	S2770	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
Hydrochloric acid	Sigma	H9892	When needed, it is used to adjust sample pH to be between 6-8
LAL grade water	Associates of Cape Cod	WP0501	This reagent can be used with any LAL format
Glucashield Buffer	Associates of Cape Cod	GB051-25	Used to prevent false-positive response from beta-glucans
Disposable endotoxin-free glass dilution tubes 12 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TB240	These tubes can be used with all three assays
Disposable endotoxin-free glass reaction tubes 10 x 75 mm	Associates of Cape Cod	TS050	These tubes are for use with the gel-clot assay
Pyrogen-free tips with volumes 0.25 and 1 mL	RAININ	PPT25, PPT10	Tips and pipettes may adsorb endotoxin and release leachables which interfere with LAL assay. These RAININ tips are used because their optimal performance in the LAL assay was verified and confirmed
Pyrogen-free microcentrifuge tubes, 2.0 mL	Eppendorf	22600044	Other equivalent supplies can be used
Pyrogen-fee combitips, 5mL	Eppendorf	30089669	Other equivalent supplies can be used
Repeat pipettor	Eppendorf	4982000020	Other equivalent supplies can be used
Microcetrifuge	any brand		Any brand can be used
Refrigerator, 2-8 C	any brand		Any brand can be used
Vortex	any brand		Any brand can be used
Freezer, -20 C	any brand		Any brand can be used
Water bath, 37 C	any brand		Any brand can be used, however, it is important either to switch off water circulation or use non-circualting water bath because water flow will affect clot formation and lead to false-negative results