Cuantificación de basados en citometría de flujo multicolor de las mitocondrias y los lisosomas en las células T

Resumen

Este artículo ilustra un método eficaz para cuantificar las mitocondrias o lisosomas en las células vivas. La combinación de tintes específicos lisosomas o las mitocondrias con fluorescente conjugados anticuerpos contra marcadores de superficie permite la cuantificación de estos orgánulos en poblaciones de mezclado de la célula, como células primarias extraídas muestras de tejido, mediante el uso de Citometría de flujo multicolor.

Resumen

Las células de T utilizan diferentes programas metabólicos para que coincida con sus necesidades funcionales durante la diferenciación y proliferación. Las mitocondrias son componentes celulares cruciales responsables de suministro de energía de la célula; sin embargo, las mitocondrias exceso también producen especies reactivas de oxígeno (ROS) que podrían causar la muerte celular. Por lo tanto, el número de mitocondrias debe ajustarse constantemente para satisfacer las necesidades de las células. Esta regulación dinámica se consigue en parte mediante la función de los lisosomas que eliminar macromoléculas y organelos superávit o dañado. Por lo tanto, contenido lisosomal y mitocondrial celular es indicadores clave para evaluar la regulación metabólica de las células. Con el desarrollo de sondas para organelos, bien caracterizado lisosoma o tintes específicos de las mitocondrias se han convertido en disponibles en varios formatos para etiquetar las mitocondrias y los lisosomas celulares. Citometría de flujo multicolor es una herramienta común a fenotipos de células de perfil y tiene la capacidad de integrarse con otros ensayos. Aquí, presentamos un protocolo detallado de cómo combinar tintes organelas específicas con marcadores de superficie de tinción para medir la cantidad de lisosomas y mitocondrias en la célula de T de diferentes poblaciones en un citómetro de flujo.

Introducción

La activación y proliferación de células T son pasos críticos para montar respuesta inmune exitosa. Los avances recientes sugieren que el metabolismo celular está estrechamente asociado con el desarrollo y funciones de las células. Por ejemplo, las células Naive T dependen en gran medida fosforilación oxidativa (OXPHOS) para satisfacer la demanda de energía durante la recirculación entre los órganos linfoides secundarios. Tras la activación, ingenuo T células sufren drásticas reprogramación metabólica, incluyendo la inducción de la glucólisis aeróbica para aumentar la producción de ATP y para satisfacer las demandas metabólicas tremenda durante la proliferación y diferenciación celular. Las células que no siga a través de las necesidades metabólicas mueren por apoptosis^1,2. Durante la reprogramación metabólica, las mitocondrias tienen un papel importante ya que son los organelos en gran parte responsables de la producción de ATP para suministrar energía para la célula, y el contenido de la mitocondria celular fluctúa durante cambios metabólicos a lo largo del desarrollo y la activación de la célula de T³. Sin embargo, la acumulación de mitocondrias superfluas o dañadas puede producir exceso ROS que dañan los lípidos, proteínas y ADN y eventualmente puede conducir a la célula de la muerte⁴

La mitocondria excesiva o daña resultante de alteraciones del metabolismo es eliminada mediante una forma especializada de autofagia⁵, conocida como mitofagia. Las mitocondrias son envuelto por autophagosomes y luego se fusionan con lisosomas para su degradación. Estos cierran comunicaciones entre mitocondrias y lisosomas han generado gran interés^6,7. Por ejemplo, el estrés oxidativo estimula las mitocondrias para formar vesículas derivadas de las mitocondrias (MDVs) que se dirigen a los lisosomas para su degradación en un homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN)-inducida supuesta quinasa 1 (PINK1) y parkin (un E3 ubiquitina ligasa) manera dependiente⁸. Se encontró también que mitofagia es esencial para la transición de color beige con blanco adipocito^9,10. Lisosomas son lo más importante, no sólo un compartimiento de degradación, pero también un regulador de la señalización celular. Acumulación de sustrato excesiva debido a las deficiencias de la enzima resulta en disfunción lisosomal alteran la permeabilidad de la membrana lisosomal y afecta a Ca^{2 +} homeostasis¹¹. Los defectos funcionales de la célula de T en la lipasa ácida lysosomal (LAL)¹² o lysosomal metabolito transportador knockout mouse modelo¹³ adicional demostraron la importancia de los lisosomas en el mantenimiento de la homeostasis de la célula de T. Lisosomas y las mitocondrias son partes inseparables de regulación metabólica celular. Por lo tanto, la medición del contenido mitocondrial celular ha sido un indicador fundamental para evaluar el estado metabólico y funcional de la célula de T.

Ensayos usados para cuantificar el contenido lisosomal o mitocondrial celular incluyen immunoblot, microscopía electrónica, tinción de inmunofluorescencia (IF) y análisis por PCR de mitocondrial ADN copia números^{14,15, 16}. mientras immunoblot puede comparar cuantitativamente los niveles de proteínas en diferentes muestras y electrón o si la microscopia puede visualizar las características morfológicas de estos organelos¹⁷, estos ensayos tienen ciertos inconvenientes técnicos. Por ejemplo, es mucho tiempo para adquirir un número suficiente de imágenes de células con alta magnificación y resolución o para comparar los niveles de expresión de una proteína a través de decenas de muestras, hacer estos ensayos considerados métodos de bajo rendimiento. Además, estos ensayos pueden aplicarse sólo a la población celular homogénea, como líneas celulares, pero no a las muestras de tejido que se componen de poblaciones mixtas.

También es difícil para estos ensayos se aplican a poblaciones raras, para que el requisito de la mínima célula números de 10⁶ a 10⁸ es imposible de cumplir. Finalmente, las células son generalmente lisis o fijo durante el proceso, lo que los hace incompatibles con otros métodos para extraer más información. En comparación con los métodos tradicionales, citometría de flujo fluorescente-basado tiene un relativamente alto rendimiento - la información de todas las células dentro de una muestra compuesta por poblaciones de mezclado de la célula puede ser analizada y recopilada simultáneamente. Además, uno puede detectar más de 10 parámetros en la misma celda y ordenar las células basadas en fenotipos deseados para otros ensayos. Sondas fluorescentes reactivas han sido usadas para etiqueta de lisosomas y mitocondrias en células vivas y pueden ser detectadas por el flujo cytometry^18,19. Estas sondas específicas de organelo celular permeable y tengan características fisico-químicas que permiten que se concentre en localizaciones subcelulares específicas u organelos. Convenientemente, estas sondas están disponibles en varios formatos fluorescentes, lo que permite su aplicación para el análisis multicolor.

Este protocolo describe en detalle cómo combinar marcador superficial de tinción con colorantes específicos lisosomas o las mitocondrias a los lisosomas de etiqueta o viven de las mitocondrias en las células. Esto es especialmente útil para muestras generadas de los principales tejidos y órganos, que a menudo se componen de poblaciones celulares heterogéneas. Los investigadores pueden identificar poblaciones celulares de interés por su expresión superficial del marcador y medir específicamente el contenido lisosomal o mitocondrial a través de tintes de organelas específicas en estas células. Aquí, demostramos el procedimiento detallado de análisis cytometric del flujo que evalúa la masa lisosomal o mitocondrial en las subpoblaciones principales esplénico T cell.

Protocolo

El procedimiento de cosecha de tejido de ratón descrito aquí ha sido aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Nacional de Yang Ming.

1. preparación de la suspensión de linfocitos de órganos linfoides

1. Eutanasia el ratón por un método aprobado como inhalación de CO₂ en una cámara de acrílico transparente seguida por dislocación cervical para asegurar la muerte.
   Nota: Mantener la tasa de flujo de CO₂ para un desplazamiento de 20% por minuto de la cámara y no superior a 5 psi (libra por pulgada cuadrada). Tarda 2-3 minutos para un ratón a perder el conocimiento. Mantener el flujo de CO₂ por lo menos durante 1 minuto después de que el animal ha dejado de respirar (5-7 min total).
2. Coloque el ratón en su parte posterior sobre un tablero limpio (por ejemplo, un tablero de plástico de poliestireno) y fijar las extremidades con cinta. Enjuagar con etanol al 70%.
3. Bazo de la cosecha, cortar y abrir la cavidad abdominal con tijeras de disección de 11 cm (el bazo está debajo del estómago y sobre el riñón izquierdo). Extirpar el bazo con pinzas y limpieza de los tejidos conectivos (utilizar tijeras si es necesario).
4. Para el timo de la cosecha, cortar el diafragma y las costillas de ambos lados con tijeras de disección. Utilice pinzas para levantar el esternón a la cavidad torácica completa. Separar cuidadosamente el timo de los tejidos circundantes con las tijeras y retirar cualquier tejido conectivo residual en una toalla de papel humedecida con PBS.
5. Disocian mecánicamente los tejidos con un émbolo de la jeringa en un recipiente de 6 cm que contiene 5 mL de tampón de FACS helada (PBS suplementadas con 2% de suero bovino fetal (FBS) y 1 mM EDTA). Transferir la suspensión unicelular a un tubo de centrífuga de 15 mL; lavar el plato de 6 cm con buffer adicional 2 mL FACS y combinar el lavado con suspensión de la célula.
6. Centrifugue la suspensión de células (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) y descarte el sobrenadante. Resuspender el sedimento con 2 mL de amonio cloruro de potasio (ACK), lisis (155 m m de NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ y 0,1 mM de Na₂EDTA) buffer durante 1 min a temperatura ambiente (RT) para lisar los glóbulos rojos. Neutralizar el búfer ACK añadiendo 10 mL de tampón de FACS para la suspensión de células.
7. Centrifugue la suspensión de células (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) y descarte el sobrenadante. Resuspenda las células en 5 mL de Medio RPMI completo (Medio RPMI 1640, suplementado con NaHCO₃de 44 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES), 100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 mg/mL, 2 mM L-glutamina, piruvato de sodio 1 mM, 1% MEM no esenciales aminoácidos y 10% FBS).
8. Suspensión de la célula del filtro a través de un colador celular (poro tamaño 70 μm) para eliminar grupos de células. Contar celdas con un hemocitómetro o contador de células automatizado.

2. cuantificación de las mitocondrias y lisosomas

Nota: Realizar el tinte de organelas específicas tinción primero porque la condición tinción óptima para estos tintes es incubación a 37 ° C. La coloración superficial del marcador puede reducirse significativamente debido a anticuerpos que capsula e internalización a esa temperatura.

1. Añadir 1 x 10⁶ células FACS tubos de fondo redondo, centrifugar las células (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) y deseche el sobrenadante.
2. Diluir las soluciones stock de sonda a concentración final de trabajo (100 nM MitoTracker Green o LysoTracker Green; en lo sucesivo mitocondria lisosoma-específicas o tinte, respectivamente) en medio de cultivo libre de suero con 37 ° C. Esta es la solución de tinte específico lisosomas o las mitocondrias.
   Nota: Para probar múltiples concentraciones incluyendo el rango de concentraciones de trabajo sugerido por el fabricante (20-200 nM para el colorante específico de las mitocondrias) y 50-75 nM para el tinte de lisosoma específico utilizado aquí para obtener la mejor eficiencia de coloración. Elegir una población celular que se sabe que tiene buena expresión de destino (por ejemplo, lisosomas) como control positivo de la tinción (por ejemplo humanos CD14⁺ monocitos). Elegir la concentración de trabajo basada en la buena separación entre negativo y positivo de tinción, así como viabilidad celular buena.
3. Resuspender las células en 100 μl de lisosoma mitocondria-específicas o solución de trabajo del tinte e incuban en 5% CO₂ incubadora a 37 ° C por 15 min o 30 min, respectivamente.
4. Añadir 1 mL de tampón de FACS helada para detener la reacción. Pellet de células por centrifugación (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) y descartar el sobrenadante. Las células están listas para la coloración superficial del marcador.

3. manchas de marcador superficial

1. Receptores de Fc de bloque con 100 μl de 2.4G2 previamente valorada hibridoma sobrenadante en el hielo para las celdas de lavado de 10 minutos con 1 mL de tampón FACS y centrífuga (300 x g, durante 5 min a 4 ° C). Deseche el sobrenadante.
2. Incubar las células con 50 μl combinación de anticuerpo conjugado con fluorescencia previamente valorada en tampón FACS en el hielo durante 20 min Evite luz.
   Nota: Preparar células teñidas de color que incluyen todos los anticuerpos fluorescentes presentan en el anticuerpo de combinación y las células trataron solamente con tinte de organelas específicas para ajustar los voltajes de cada ajuste de detector y compensación de fluorescencia en el flujo de citómetro. Asimismo, preparar la fluorescencia menos uno (FMO) como controles de fondo mediante el uso de células teñidas con los anticuerpos, pero sin tinción con tintes de organelas específicas.
3. Lavar las células añadiendo 1 mL de tampón FACS y pellets por centrifugación (300 x g, durante 5 min a 4 ° C). Deseche el sobrenadante.
4. Resuspender las células en 300 μL de tampón FACS que contiene yoduro de propidio de 1 μg/mL (PI) y analizar inmediatamente las muestras en citómetro de flujo.

4. muestra colección en citómetro de flujo

1. Encienda el ordenador, citómetro de flujo, software de adquisición de FACS y otros dispositivos de accesorio dependiendo de la plataforma de la máquina. Ejecutar PBS para alrededor de 1 minuto para asegurar la línea de flujo se llena con tampón PBS y la vaina. Asegúrese de que la corriente de flujo funciona sin problemas.
2. Abrir nuevo experimento y seleccionar los parámetros de la citometría (detectores fluorescentes) según instrucciones del fabricante. Filtro de las células a través de colador de celular de 70 μm y vortex antes de la adquisición de cada muestra para evitar grumos y formación de doblete.
3. Hacer punto parcelas forward scatter (FSC) y lado scatter (SSC), que representan el tamaño de la célula y granularidad, respectivamente. Optimizar los voltajes de FSC y SSC para asegurarse de que las células de interés aparecen en las parcelas. Hacer diagramas de punto de FSC y FSC-W (o FSC-H) y dibuja una puerta para las células.
4. Hacer diagramas de punto de cada parámetro fluorescente. Utilizar células sin manchas para determinar la señal de fondo y solo controles teñidos de color para ajustar los voltajes de cada parámetro fluorescente, para que poblaciones de células positivas y negativas son claramente distinguibles y dentro de la gama dinámica de la adquisición.
5. Después de ajustan todos los voltajes, utilice compensación automática si está disponible, o ajustar manualmente la compensación con controles teñidos de color sin manchas y solo para corregir el derrame espectral. La indemnización se aplica a las muestras.
6. Hacer un diagrama de punto de cada parámetro y elaboración de puertas según su sistema experimental. Por ejemplo, FSC y FSC-H (o FSC-W) excluir dobletes, seguido por la FSC-A vs SSC-A para bloquear linfocitos; SSC-A vs PI (células vivas) y CD4 y CD8 (figura 1).
7. Recoge suficientes eventos (número total de la célula) para la comparación significativa entre poblaciones. Por lo general, menos de 1.000 eventos en la población de interés necesitan obtener²⁰.
8. Después de todas las muestras son adquiridas, exportar los datos de flujo para ser analizadas por el software de análisis de citometría de flujo. Guardar el experimento como plantilla para conservar la configuración de citómetro y parámetros para aplicar a experimentos similares en el futuro.

5. Análisis de datos

Nota: Hay muchas herramientas para analizar datos de citometría de flujo, software libre y comercial. También puede trabajar el software de adquisición de los citómetros de flujo para análisis de datos. Aquí utilizamos FlowJo como ejemplo.

1. Inicie el software y arrastrar los archivos de la FCS en el espacio de trabajo. Haga clic en una muestra para abrir una ventana gráfica. Seleccionar los parámetros para ser presentado en el eje X e Y haciendo clic en los ejes X e Y. Utilice la barra de herramientas para dibujar puertas según marcadores diferencialmente expresados o fenotipos definidos de poblaciones celulares.
2. Añadir puertas de cada parámetro como se muestra en la figura 1. Arrastre puertas a todas las muestras en el espacio de trabajo, por lo que consiguen idénticos que bloquean.
3. Arrastre las parcelas a editor de layout para crear informes gráficos.
4. Mostrará la intensidad de fluorescencia media (IFM) para cada población de interés mediante clic en el botón estadísticas (Σ) en una ventana gráfica y elegir "Significa" y el parámetro, por ejemplo, el canal utilizado para detectar tinte orgánulo específico. Haga clic en "Agregar".
5. Haga clic en el icono de editor de tabla y arrastre MFI al editor de la tabla para crear informes estadísticos. Guardar como archivo de Excel, texto o CSV para calcular delta MFI (ΔMFI) como IMF (organelas específicas tintes) - MFI (FMO).
   Nota: No calcular la IMF entre muestras adquiridas con citómetro de diferentes parámetros (tensión, canales de fluorescentes o compensación). Las comparaciones de valores derivados de experimentos con diferentes ajustes son sin sentido y sesgada.
6. Exportar todos los valores desde el área de trabajo y de la parcelas desde el editor de diseño para la fabricación de tablas y figuras.

Resultados

Identificación de subconjuntos principales de la célula T en bazo y timo

En breve, suspensiones de la célula del bazo y el timo fueron lisis de glóbulos rojos, se incubaron con sobrenadante 2.4G2, seguidos por organelas específicas tinte y superficial del marcador tinción con anticuerpos conjugados con fluorescencia (tabla 1). La progresión en el desarrollo de los timocitos puede describi...

Discusión

Este protocolo combina tintes específicos de organelas y marcador superficial de coloración para cuantificar la cantidad de mitocondrias o lisosomas en poblaciones de células T diferentes. Este método fue desarrollado para superar la limitación de los requisitos de número y homogeneidad celular por métodos tradicionales, como la microscopia electrónica y el análisis de immunoblot. Es especialmente útil en el análisis de poblaciones celulares raros y examinar simultáneamente múltiples tipos de células al mis...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated)	Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)	Dimeda
15 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL syringe	TERUMO
6 cm Petri dish	α-plus
70 µm nylon cell strainer	SPL Lifesciences	93070
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-mouse CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-mouse CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)	BD Biosciences	352052
FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)	ATCC	HB-197
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Non-essential amino acids (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidium iodide solution	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder)	Gibco	31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070