Multicolor Flow Cytometry-basé Quantification des mitochondries et des Lysosomes dans les cellules T

Résumé

Cet article illustre une méthode puissante pour quantifier les mitochondries ou lysosomes dans les cellules vivantes. La combinaison de colorants spécifiques lysosome ou mitochondries avec des anticorps fluorescent conjugués contre marqueurs de surface permet la quantification de ces organites chez les populations de cellules mixtes, comme les cellules primaires récoltées dans des échantillons de tissus, en utilisant cytométrie en flux multicolore.

Résumé

Les cellules T utilisent différents programmes métaboliques pour correspondre à leurs besoins fonctionnels au cours de la différenciation et la prolifération. Les mitochondries sont des éléments cellulaires essentiels chargés de fournir l’énergie cellulaire ; Cependant, excès mitochondries produisent également des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui pourraient provoquer la mort cellulaire. Par conséquent, le nombre de mitochondries doit sans cesse être ajusté pour répondre aux besoins des cellules. Présent règlement dynamique est obtenue en partie grâce à la fonction de lysosomes qui éliminent les macromolécules et les organites excédent/endommagé. Cellulaire mitochondrial et lysosomal du contenu est donc des indicateurs clés pour évaluer l’adaptation métabolique des cellules. Avec le développement de sondes d’organites, lysosome bien caractérisé ou colorants spécifiques mitochondries sont devenues disponibles en divers formats d’étiqueter les mitochondries et les lysosomes cellulaires. Multicolor cytométrie en flux est un outil commun aux phénotypes cellulaires profil et a la capacité d’être intégrée aux autres épreuves. Nous présentons ici un protocole détaillé de comment combiner des colorants d’organite spécifique avec des marqueurs de surface souillure pour mesurer la quantité des lysosomes et des mitochondries dans les populations de différentes cellules de T sur un cytomètre en flux.

Introduction

L’activation et la prolifération des lymphocytes T sont des étapes cruciales pour le montage des réponses immunitaires réussies. Les progrès récents suggèrent que le métabolisme cellulaire est étroitement liée à la fois le développement et les fonctions des cellules T. Par exemple, les cellules naïves T s’appuient en grande partie sur la phosphorylation oxydative (OXPHOS) pour répondre à la demande d’énergie au cours de la recirculation parmi les organes lymphoïdes secondaires. Lors de l’activation, naïve T cellules subissent une reprogrammation métaboliques drastiques, y compris l’induction de la glycolyse aérobie pour augmenter la production d’ATP et de remplir les énormes besoins métaboliques au cours de la prolifération et la différenciation cellulaire. Les cellules qui ne parviennent pas à suivre à travers les besoins métaboliques meurent par apoptose^1,2. Au cours de la reprogrammation métabolique, mitochondries jouent un rôle important car ils sont les organites en grande partie responsables de la production d’ATP à fournir de l’énergie pour la cellule, et le contenu des mitochondries cellulaires fluctue au cours de commutateurs métaboliques tout au long de la cellule T développement et activation³. Cependant, l’accumulation des mitochondries superflus ou endommagés peut produire des excès ROS qui endommagent les lipides, les protéines et l’ADN et peut éventuellement conduire à la mort⁴ de cellules

Les mitochondries excessives ou endommagés résultant de modifications métaboliques sont éliminés par une forme spécialisée de l’autophagie⁵, appelée mitophagy. Les mitochondries sont encapsulés par autophagosomes et ensuite fusionnées avec les lysosomes pour dégradation. Ces fermer communications entre les mitochondries et les lysosomes ont généré beaucoup d’intérêt^6,7. Par exemple, le stress oxydant stimule les mitochondries pour former des vésicules dérivés de mitochondries (FDM) qui sont ciblés vers les lysosomes pour dégradation dans une phosphatase et tensine homologue (PTEN)-induite par la kinase putative 1 (PINK1) et parkin (une E3 ubiquitine ligase) ⁸de façon dépendante. On a également constaté que mitophagy est essentiel pour l’adipocyte beige et blanc transition^9,10. Plus important encore, les lysosomes sont pas simplement un compartiment de dégradation, mais aussi un organisme de réglementation de la signalisation cellulaire. L’accumulation excessive de substrat en raison de déficiences enzymatiques entraîne un dysfonctionnement lysosomal en perturbant la perméabilité de la membrane lysosomale et touche Ca^{2 +} l’homéostasie du¹¹. Plus loin, les défauts fonctionnels des lymphocytes T en lipase acide lysosomale (LAL)¹² ou métabolite lysosomal transporteur knockout souris modèle¹³ ont montré l’importance des lysosomes dans le maintien de l’homéostasie des lymphocytes T. Les mitochondries et les lysosomes sont des parties inséparables de la régulation du métabolisme cellulaire. Mesurer le contenu cellulaire mitochondrial a donc été un indicateur crucial pour évaluer l’état de métaboliques et fonctionnel des cellules T.

Tests couramment utilisées pour quantifier cellulaires mitochondriales ou lysosomales des matières incluent immunoblot, microscopie électronique, immunofluorescence (IF) et l’analyse PCR de l’ADN mitochondrial de^14,en numéros de la copie^{15, 16}. immunoblot pouvez comparer quantitativement les taux de protéines à travers différents échantillons et électron ou si la microscopie permet de visualiser les caractéristiques morphologiques de ces organites¹⁷, ces analyses portent certains inconvénients techniques. Par exemple, c’est beaucoup de temps pour acquérir un nombre suffisant d’images de cellule avec fort grossissement et résolution ou pour comparer les niveaux d’expression d’une protéine dans des dizaines d’échantillons, rendant ces dosages considérés comme méthodes de débit faible. En outre, ces tests ne peuvent être appliqués à une population homogène de cellules, telles que des lignées de cellules, mais pas à des échantillons de tissus qui sont composées de peuplements mixtes.

Il est également difficile d’appliquer ces tests auprès de populations rares, pour lesquelles l’exigence d’une cellule minimale des numéros de 10⁶ 10⁸ est impossible à satisfaire. Enfin, les cellules sont habituellement lysés ou fixés au cours du processus, ce qui les rend incompatibles avec d’autres méthodes pour extraire davantage d’informations. Comparaison avec les méthodes traditionnelles, cytométrie en flux axées sur la fluorescence a un débit relativement élevé - l’information de toutes les cellules d’un échantillon composés de populations cellulaires mixtes peut être analysée et recueillie en même temps. En outre, on peut détecter plus de 10 paramètres sur la même cellule et trier les cellules issus des phénotypes désirées pour plus amples essais. Des sondes fluorescentes réactifs ont été utilisés pour étiqueter des lysosomes et des mitochondries dans les cellules vivantes et peuvent être détectées par l’écoulement cytometry^18,19. Ces sondes organite spécifique sont cellulaires perméables et ont des caractéristiques physico-chimiques qui leur permettent d’être concentrée dans des emplacements spécifiques subcellulaires ou organites. Idéalement, ces sondes sont disponibles dans différents formats fluorescents, permettant ainsi à leur demande d’analyse multicolore.

Ce protocole décrit en détail comment combiner le marqueur de surface coloration avec des colorants spécifiques lysosome ou mitochondries lysosomes étiquette ou vivent de mitochondries dans les cellules. Ceci est particulièrement utile pour les échantillons produits des principaux tissus et organes, qui sont souvent composés de populations de cellules hétérogènes. Les chercheurs peuvent identifier des populations de cellules d’intérêt par leur expression du marqueur de surface et mesurer plus précisément le contenu lysosomal ou mitochondrial par l’intermédiaire de colorants organite spécifique dans ces cellules. Ici, nous démontrons la procédure détaillée de cytométrie qui évalue la masse lysosomale ou mitochondriale dans les sous-populations importante des lymphocytes T spléniques.

Protocole

La procédure de récolte de tissus de souris décrite ici a été approuvée par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université nationale Yang-Ming.

1. préparation des lymphocytes Suspension des organes lymphoïdes

1. Euthanasier la souris par une méthode approuvée telles que l’inhalation de la CO₂ dans un compartiment transparent acrylique, suivie d’une dislocation cervicale pour s’assurer de la mort.
   NOTE : Conserver le débit de CO₂ pendant un déplacement de 20 % par minute de la chambre et ne dépassant pas 5 psi (livres par pouce carré). Il faut 2-3 min pour une souris de perdre conscience. Maintenir l’écoulement de₂ CO au moins pendant 1 min après que l’animal a cessé de respirer (5-7 min globale).
2. Placez la souris sur le dos sur une planche propre (par exemple un panneau de plastique polystyrène) et fixer les branches avec du ruban. Rincer avec de l’éthanol à 70 %.
3. De récolter rate, couper et ouvrir la cavité abdominale avec 11 cm ciseaux de dissection (la rate est au-dessous de l’estomac et surtout le rein gauche). Retirer la rate avec une pince et nettoyer des tissus conjonctifs (utiliser des ciseaux si nécessaire).
4. Pour récolter le thymus, couper la membrane et la cage thoracique, des deux côtés avec ciseaux de dissection. Forceps permet de soulever le sternum pour révéler toute la cavité thoracique. Séparer le thymus avec soin des tissus environnants avec des ciseaux et supprimer n’importe quel tissu conjonctif résiduel sur un essuie-tout humidifié avec du PBS.
5. Désolidariser mécaniquement les tissus avec un piston de la seringue dans un plat de 6 cm contenant 5 mL tampon de FACS glacé (PBS complété avec 2 % sérum fœtal (SVF) et EDTA 1 mM). Transférer la suspension de cellules individuelles dans un tube à centrifuger de 15 mL ; laver le plat de 6 cm avec un tampon supplémentaire 2 mL FACS et combiner le lavage avec suspension de cellules aussi bien.
6. Centrifuger la suspension cellulaire (300 x g, pendant 5 min à 4 ° C) et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot avec 2 mL de chlorure d’Ammonium-Potassium (ACK), lyse tampon (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ et 0,1 mM Na₂EDTA) pendant 1 min à température ambiante (RT) à lyser les globules rouges. Neutraliser le tampon ACK en ajoutant 10 mL de tampon FACS à la suspension cellulaire.
7. Centrifuger la suspension cellulaire (300 x g, pendant 5 min à 4 ° C) et éliminer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de milieu RPMI complet (milieu RPMI 1640, additionné de 44 mM NaHCO₃, l’acide-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 10 mM 4 (HEPES), 100 U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine, 2 mM de L-glutamine, pyruvate de sodium 1 mM, 1 % MEM non essentiels des acides aminés et 10 % FBS).
8. Suspension de cellules de filtre à travers un tamis de cellule (pore taille 70 µm) pour enlever les amas de cellules. Compter les cellules avec un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisées.

2. quantification des mitochondries et des Lysosomes

Remarque : Effectuez l’organite spécifique teinture coloration tout d’abord parce que la condition de coloration optimale de ces colorants est une incubation à 37 ° C. La coloration de surface marqueur peut être significativement réduite à cause des anticorps capsulage et internalisation à cette température.

1. Ajouter 1 x 10⁶ cellules pour fond rond FACS tubes, centrifuger des cellules (300 x g, pendant 5 min à 4 ° C) et jeter le surnageant.
2. Diluer la solution mère de sonde à concentration finale de travail (100 nM MitoTracker vert ou LysoTracker Green ; désormais teindre les mitochondries ou lysosome spécifiques, respectivement) dans un milieu de culture sans sérum préchauffé 37 ° C. Il s’agit de la solution de travail pour colorant lysosome ou mitochondries spécifiques.
   NOTE : Tester plusieurs concentrations notamment la gamme des concentrations de travail suggérés par le fabricant (20-200 nM pour la teinture de mitochondries spécifiques) et 50 à 75 nM pour la teinture de lysosome spécifique utilisée ici afin d’obtenir la meilleure efficacité de la coloration. Choisir une population cellulaire qui est connue pour avoir la bonne expression de coloration cible (par exemple les lysosomes) comme témoin positif (p. ex. CD14 humain⁺ monocytes). Choisir la concentration de travail basée sur la bonne séparation entre coloration négative et positive, mais aussi la viabilité cellulaire bonne.
3. Remettre les cellules dans 100 µL de lysosome ou mitochondries particulier travail solution de colorant et incuber dans 5 % CO₂ incubateur à 37 ° C pendant 15 min ou 30 min, respectivement.
4. Ajouter 1 mL de tampon de FACS glacé pour arrêter la réaction. Cellules de granule par centrifugation (300 x g, pendant 5 min à 4 ° C) et jeter le surnageant. Les cellules sont maintenant prêts pour la coloration de surface marqueur.

3. surface marqueur coloration

1. Récepteurs Fc bloc 100 µL d’hybridome 2.4G2 préalable titré surnageant sur glace pour les cellules de lavage de 10 min. avec 1 mL de tampon de FACS et centrifuger (300 x g, pendant 5 min à 4 ° C). Jeter le surnageant.
2. Incuber les cellules avec 50 µL préalable titré anticorps conjugué fluorescence combinaison dans le tampon de FACS sur la glace pendant 20 min. Evitez de lumière.
   NOTE : Préparez monocellules teinté couleur qui incluent tous les anticorps fluorescents présent dans l’anticorps combinaison et les cellules traitement seulement avec de la teinture d’organite spécifique permettant le réglage des tensions de chaque ajustement de détecteur et compensation de fluorescence de flux cytomètre. De même, préparer la Fluorescence Minus One (FMO) sous forme de contrôles de fond à l’aide de cellules colorées avec tous les anticorps, mais sans coloration avec des teintures organite spécifique.
3. Laver les cellules en ajoutant 1 mL de tampon de FACS et pellet par centrifugation (300 x g, pendant 5 min à 4 ° C). Jeter le surnageant.
4. Remettre en suspension les cellules dans 300 µL de tampon de FACS contenant de l’iodure de propidium 1 µg/mL (PI) et d’analyser immédiatement les échantillons sur cytomètre en flux.

4. PRELEVEMENT sur cytomètre en flux

1. Allumez l’ordinateur, cytomètre en flux, logiciel d’acquisition de FACS et autres appareils accessoires selon la plate-forme de la machine. Exécutez le PBS pendant environ 1 min pour assurer la conduite de collecte est rempli avec le tampon PBS et gaine. Assurez-vous que le flux de circulation tout en douceur.
2. Ouvrir de nouvelle expérience et sélectionnez paramètres de cytomètre (détecteurs de fluorescence) conformément aux instructions du fabricant. Filtrer les cellules à 70 µm cellule crépine et vortex avant l’acquisition de chaque échantillon pour éviter les amas et formation de doublet.
3. Rendre les parcelles de dot de forward scatter (FSC) et de la diffusion latérale (SSC), qui représentent la taille des cellules et la granularité, respectivement. Optimiser les tensions du FSC et SSC pour s’assurer que les cellules d’intérêt apparaissent dans les parcelles. Faire des parcelles de la dot de FSC-A vs FSC-W (ou FSC-H) et tracez une barrière pour les cellules individuelles.
4. Faire des parcelles de la dot de chaque paramètre fluorescent. Cellules non colorées permet de déterminer le signal de fond et utiliser des contrôles de teinté couleur unique pour régler les tensions de chaque paramètre fluorescent, afin que les populations de cellules positives et négatives sont distingue clairement et au sein de la gamme dynamique d’acquisition.
5. Une fois toutes les tensions définies, utilisez la correction automatique si possible, ou manuellement ajuster la compensation avec des contrôles simples et colorées ou non teinté couleur pour corriger l’effet d’entraînement spectrale. Appliquer la compensation aux échantillons.
6. Faire un terrain de dot de chaque paramètre et établit les portes selon votre jeu expérimental. Par exemple, FSC-A vs FSC-H (ou FSC-W) pour exclure les doublets, suivi de FSC-A vs SSC-A pour les lymphocytes gating ; SSC-A vs PI (cellules vivantes) et CD4 et CD8 (Figure 1).
7. Recueillir suffisamment événements (nombre total de cellules) pour comparaison significative entre les populations. En règle générale, au moins 1 000 événements dans la population d’intérêt doivent être obtenu²⁰.
8. Après que tous les échantillons sont acquis, exporter des données de débit à être analysé par le logiciel d’analyse de cytométrie en flux. Sauver l’expérience en tant que modèle pour préserver le cytomètre réglage et les paramètres d’application à des expériences similaires à l’avenir.

5. analyse

Remarque : Il y a beaucoup d’outils pour analyser les données de flux par cytométrie en flux, les logiciels commerciaux et gratuits. Le logiciel d’acquisition de la cytomètres peut également fonctionner pour l’analyse des données. Ici, nous avons utilisé FlowJo comme un exemple.

1. Lancez le logiciel et faites glisser les fichiers FCS en l’espace de travail. Cliquez sur un échantillon d’ouvrir une fenêtre graphique. Sélectionnez les paramètres pour être présenté sur les axes X et Y en cliquant sur les axes X et Y. Utilisez la barre d’outils pour dessiner les portes selon les phénotypes définis de populations cellulaires ou de marqueurs exprimés différemment.
2. Ajouter des portes de chaque paramètre comme indiqué dans la Figure 1. Faites glisser les portes à tous les échantillons dans l’espace de travail, afin qu’ils obtiennent identiques Gate.
3. Faites glisser les parcelles à l’éditeur de mise en page pour créer des rapports graphiques.
4. Afficher l’intensité de fluorescence moyenne (MFI) pour chaque population d’intérêt en cliquant sur le bouton statistiques (Σ) dans une fenêtre graphique et en choisissant « Signifie » et le paramètre approprié, par exemple, le canal utilisé pour détecter des organites spécifiques colorant. Puis cliquez sur « Ajouter ».
5. Cliquez sur l’icône de l’éditeur de table et faites glisser IFM éditeur de tableaux pour créer des rapports statistiques. Enregistrer un fichier Excel, texte ou CSV pour calculer delta MFI (ΔMFI) comme MFI (organite spécifique colorants) - MFI (FMO).
   NOTE : Ne pas calculer IFM entre échantillons acquis avec cytomètre différent paramètres (tensions, canaux fluorescent ou compensation). Comparaisons de valeurs dérivées des expériences avec des paramètres différents sont vides de sens et partiaux.
6. Exporter toutes les valeurs de l’espace de travail et les parcelles de l’éditeur de mise en page pour faire des tableaux et des figures.

Résultats

Identification de sous-ensembles majeurs des lymphocytes T dans la rate et le thymus

En bref, des suspensions de cellules simples de la rate et le thymus ont été lysées de globules rouges, incubées avec 2.4G2 surnageant, suivies d’organite spécifique colorant et marqueur de surface coloration avec l’anticorps conjugué à fluorescence (tableau 1). La progression du développement des th...

Discussion

Ce protocole combine organite spécifique colorants et marqueur de surface coloration afin de quantifier la quantité de mitochondries ou lysosomes dans les populations de différentes cellules de T. Cette méthode a été développée pour contourner la limitation de cellule nombre et homogénéité les exigences pour les méthodes traditionnelles, telles que la microscopie électronique et l’analyse par immunotransfert. Il est particulièrement utile dans l’analyse de populations cellulaires rares et examiner simul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated)	Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)	Dimeda
15 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL syringe	TERUMO
6 cm Petri dish	α-plus
70 µm nylon cell strainer	SPL Lifesciences	93070
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-mouse CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-mouse CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)	BD Biosciences	352052
FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)	ATCC	HB-197
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Non-essential amino acids (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidium iodide solution	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder)	Gibco	31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070