Quantificação de baseados em citometria de fluxo multicolor de mitocôndrias e lisossomos em células T

Resumo

Este artigo ilustra um poderoso método para quantificar as mitocôndrias ou lisossomos em células vivas. A combinação de corantes lisossomo mitocôndria-específico ou com conjugado fluorescente anticorpos marcadores de superfície permite a quantificação dessas organelas em populações de células mistas, como as células primárias de amostras de tecido, colhidas por meio de citometria de fluxo multicolor.

Resumo

Células T utilizam diferentes programas metabólicos para combinar com suas necessidades funcionais durante a proliferação e diferenciação. As mitocôndrias são componentes celulares cruciais responsáveis pelo fornecimento de energia da célula; no entanto, as mitocôndrias em excesso também produzem espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem causar morte celular. Portanto, o número de mitocôndrias constantemente deve ser ajustado para atender às necessidades das células. Este regulamento dinâmico é alcançado em parte através da função de lisossomos que removem macromoléculas e organelas excedente/danificado. Portanto, o conteúdo mitocondrial e dos lisossomos celular é indicadores-chave para avaliar a adaptação metabólica das células. Com o desenvolvimento de sondas para organelas, bem caracterizada lisossoma ou corantes específicos de mitocôndrias tornaram-se disponíveis em vários formatos para rotular as mitocôndrias e lisossomos celulares. Citometria de fluxo multicolor é uma ferramenta comum de fenótipos de célula de perfil e tem a capacidade de ser integrado com outros ensaios. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado de como combinar os corantes específicos organela com marcadores de superfície coloração para medir a quantidade de lisossomos e mitocôndrias em populações diferentes de células T em um citômetro de fluxo.

Introdução

A ativação e proliferação de células T são passos críticos para a montagem de sucesso respostas imunes. Avanços recentes sugerem que o metabolismo celular é fortemente associado com o desenvolvimento e as funções das células T. Por exemplo, ingênuo T células dependem em grande parte a fosforilação oxidativa (OXPHOS) para atender a demanda de energia durante a recirculação entre os órgãos linfoides secundários. Após a ativação, ingênuo T células passam por drásticas reprogramação metabólica, incluindo a indução da glicólise aeróbica para aumentar a produção de ATP e para atender as demandas metabólicas tremenda durante a proliferação e diferenciação celular. As células que não conseguem cumprir as necessidades metabólicas morrem por apoptose^1,2. Durante a reprogramação metabólica, mitocôndrias desempenham papéis importantes, uma vez que eles são as organelas em grande parte responsáveis pela produção de ATP para fornecer energia para a célula, e o conteúdo de mitocôndrias celulares flutua durante switches metabólicas em toda a célula T desenvolvimento e ativação³. No entanto, o acúmulo de mitocôndrias supérfluos ou danificadas pode produzir excesso ROS que danificam lipídeos, proteínas e DNA e pode eventualmente levar a célula a morte⁴

As mitocôndrias excessivas ou danos resultantes de alterações metabólicas são removidas por uma forma especializada de autofagia⁵, conhecido como mitophagy. Mitocôndrias são delimitadas por autophagosomes e então fundidas com lisossomos para degradação. Estas fechem as comunicações entre mitocôndrias e lisossomos têm gerado grande interesse^6,7. Por exemplo, o estresse oxidativo estimula mitocôndrias para formar vesículas mitocôndrias-derivado (MDVs) que são alvo de lisossomos para degradação em um homólogo fosfatase e tensin (PTEN)-induzido putativa quinase 1 (PINK1) e Pereira Barbosa (um E3 ubiquitina ligase) dependente da forma⁸. Verificou-se também que mitophagy é essencial para a transição de adipócito branco bege-para^9,10. Mais importante, lisossomos não são meramente um compartimento de degradação, mas também um regulador de sinalização celular. Acumulação excessiva de substrato devido a deficiência enzimática resulta em disfunção dos lisossomos por perturbar a permeabilidade da membrana dos lisossomos e afeta Ca^{2 +} homeostase¹¹. Os defeitos funcionais de células T em lipase ácida lisossômica (LAL)¹² ou metabólito lisossomal transportador nocaute do mouse modelo¹³ revelou ainda a importância de lisossomos na manutenção da homeostase de células T. Tanto as mitocôndrias e lisossomos são partes inseparáveis da regulação metabólica celular. Portanto, a medição de conteúdo mitocondrial celular tem sido um indicador fundamental para avaliar o status de metabólica e funcional de células T.

Ensaios comumente usados para quantificar o conteúdo mitocondrial ou dos lisossomos celular incluem immunoblot, microscopia eletrônica, imunofluorescência (IF) coloração e análise PCR de mitochondrial DNA copiar números^{14,15, 16}. enquanto immunoblot quantitativamente pode comparar níveis de proteína em diferentes amostras e elétron ou se microscopia pode visualizar as características morfológicas destas organelas¹⁷, estes ensaios suportar certas desvantagens técnicas. Por exemplo, é demorado para adquirir um número suficiente de imagens de células com alta ampliação e resolução ou para comparar os níveis de expressão de uma proteína em dezenas de amostras, tornando estes ensaios considerados métodos de baixa taxa de transferência. Além disso, estes ensaios só podem ser aplicados à população da pilha homogénea, tais como linhas de celular, mas não para amostras de tecido que são compostas de populações mistas.

Também é difícil de aplicar estes ensaios para populações raras, para as quais a exigência de mínima célula números de 10⁶ 10⁸ é impossível de encontrar. Finalmente, as células são geralmente lysed ou fixo durante o processo, tornando-os incompatíveis com outros métodos para extrair mais informações. Comparado com os métodos tradicionais, citometria de fluxo fluorescente-based tem um relativamente alto throughput - as informações de todas as células dentro de uma amostra compostas de populações de células mistas podem ser analisadas e coletadas simultaneamente. Além disso, um pode detectar mais de 10 parâmetros na mesma célula e classificar as células com base em fenótipos desejados para mais ensaios. Sondas fluorescentes reativas tem sido usadas para rotular lisossomos e mitocôndrias em células vivas e podem ser detectadas por citometria de fluxo^18,19. Estas sondas específicas das organelas são célula permeável e têm características físico-químicas que lhes permitam concentrar-se em locais específicos subcellular ou organelas. Convenientemente, estes testes estão disponíveis em vários formatos fluorescentes, permitindo assim a sua aplicação para análise multicolor.

Este protocolo descreve em detalhes como combinar o marcador de superfície a coloração com corantes lisossomo mitocôndria-específico ou de lisossomos rótulo ou as mitocôndrias em células vivem. Isso é especialmente útil para amostras geradas a partir de tecidos primários e órgãos, que muitas vezes são compostos de populações de células heterogêneas. Pesquisadores podem identificar populações de células de interesse pela sua expressão do marcador de superfície e medir especificamente o conteúdo dos lisossomos ou mitocondrial através de corantes específicos organela nestas células. Aqui, demonstramos o procedimento detalhado de análise de fluxo cytometric que avalia a massa dos lisossomos ou mitocondrial em subpopulações o major esplênica T cell.

Protocolo

O procedimento de colheita de tecidos rato descrito aqui foi aprovado pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade Nacional de Yang-Ming e institucional Cuidado Animal.

1. preparação da suspensão de linfócitos de órgãos linfoides

1. Eutanásia o mouse por um método aprovado como inalação de CO₂ em uma câmara de acrílico transparente, seguida por deslocamento cervical para garantir a morte.
   Nota: Manter a taxa de fluxo de CO₂ para um deslocamento de 20% por minuto da câmara e não superior a 5 libras por polegada quadrada (libra por polegada quadrada). Demora 2-3 min para um mouse para perder a consciência. Manter o fluxo de₂ CO pelo menos por 1 min após o animal parou de respirar (total de 5-7 min).
2. Coloque o mouse em sua parte traseira em uma placa limpa (por exemplo, uma placa de plástico poliestireno) e corrigir os membros com fita adesiva. Enxágue com etanol a 70%.
3. Para colher o baço, cortar e abrir a cavidade abdominal com uma tesoura de dissecação de 11 cm (o baço está abaixo do estômago e acima do rim esquerdo). Remover o baço com fórceps e limpeza de tecidos conjuntivos (se necessário, use tesoura).
4. Para colher o timo, corte o diafragma e a caixa torácica de ambos os lados com tesoura de dissecação. Use fórceps para levantar o esterno para revelar toda a cavidade torácica. Separar o Timo cuidadosamente dos tecidos circundantes, com uma tesoura e remover qualquer tecido conjuntivo residual em uma toalha de papel humedecido com PBS.
5. Mecanicamente, dissocia os tecidos com um êmbolo da seringa em um prato de 6 cm, contendo 5 mL gelada FACS buffer (PBS suplementado com 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM EDTA). Transferir a suspensão de célula única para um tubo de centrífuga de 15 mL; lavar o prato de 6 cm com adicional de 2 mL FACS e combinar a lavagem com suspensão de células também.
6. Centrifugar a suspensão de eritrócitos (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento com 2 mL de amónio-cloreto de potássio (ACK) lise buffer (155 mM NH₄Cl, 10mm KHCO₃ e 0,1 mM Na₂EDTA) para 1 min à temperatura ambiente (RT) para lisar células vermelhas do sangue. Neutralize o buffer ACK, adicionando 10 mL de tampão de FACS à suspensão de células.
7. Centrifugar a suspensão de eritrócitos (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante. Ressuspender as células em 5 mL de meio RPMI completo (meio RPMI 1640, suplementado com NaHCO₃de 44 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES) 100 penicilina U/mL, estreptomicina 100 mg/mL, 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio de 1 mM, 1% MEM não aminoácidos essenciais e 10% FBS).
8. Suspensão de células de filtro através de um filtro de célula (poros tamanho 70 µm) para remover grupos de célula. Contar as células com um hemocytometer ou contador automatizado de células.

2. quantificação das mitocôndrias e lisossomos

Nota: Executar a organela específica tintura coloração primeiro porque a condição ideal de coloração para estes corantes é incubação a 37 ° C. A mancha de marcador de superfície pode ser significativamente reduzida por causa do anticorpo tampando e internalização a essa temperatura.

1. Adicione 1 x 10⁶ células para fundo redondo FACS tubos, centrifuga células (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante.
2. Diluir as soluções estoque de sonda para concentração final de trabalho (100 nM MitoTracker Green ou LysoTracker Green; doravante mitocôndrias lisossoma-específico ou tingir, respectivamente) em meio de cultura livre de soro previamente aquecido a 37 ° C. Esta é a solução para o lisossomo mitocôndria-específico ou tintura.
   Nota: Testar várias concentrações, incluindo o intervalo de concentrações de trabalho sugerida pelo fabricante (20-200 nM para a tintura de mitocôndrias específicas) e 50-75 nM para a tintura do lisossoma específico usada aqui para obter a melhor eficiência de coloração. Escolha uma população de células que é conhecida por ter boa expressão de coloração alvo (por exemplo, lisossomos) como controle positivo (por exemplo, CD14 humana⁺ monócitos). Escolha a concentração de trabalho baseada na boa separação entre coloração positiva e negativa, bem como viabilidade celular bom.
3. Ressuspender as células em 100 µ l do lisossoma-mitocôndrias-específico ou tingem a solução de trabalho e incubam em 5% CO₂ incubadora a 37 ° C por 15 min ou 30 min, respectivamente.
4. Adicione 1 mL de tampão de FACS gelada para parar a reação. Células de pelotas por centrifugação (300 x g, durante 5 min a 4 ° C) e descartar o sobrenadante. Células estão agora prontas para a mancha de marcador de superfície.

3. superfície marcador coloração

1. Receptores Fc de bloco com 100 µ l de pré-titulada 2.4G2 de hibridoma sobrenadante no gelo para células de lavagem de 10 min. com 1 mL de tampão de FACS e centrífuga (300 x g, durante 5 min a 4 ° C). Descarte o sobrenadante.
2. Incube as celulas com 50 µ l pré-titulada anticorpo conjugado fluorescência combinação no buffer de FACS no gelo por 20 min. Evite luz.
   Nota: Preparar células únicas manchas de cor que incluem todos os anticorpos fluorescentes presentes no anticorpo combinação e células tratadocom apenas com tintura de organela específica para a criação de tensões de cada ajuste de detector e compensação de fluorescência no fluxo citômetro. Da mesma forma, prepare a fluorescência menos um (FMO) como plano de fundo de controles usando células coradas com todos os anticorpos, mas sem a coloração com corantes específicos das organelas.
3. Lave as células, adicionando 1 mL de tampão de FACS e pelota por centrifugação (300 x g, durante 5 min a 4 ° C). Descarte o sobrenadante.
4. Ressuspender as células em 300 µ l de tampão de FACS contendo iodeto de propidium 1 µ g/mL (PI) e imediatamente analisar as amostras no citômetro de fluxo.

4. amostra coleção no citômetro de fluxo

1. Ligue o computador, citômetro de fluxo, software de aquisição de FACS e quaisquer outros dispositivos acessórios, dependendo da plataforma de máquina. Execute PBS durante cerca de 1 min para garantir a linha de fluxo é preenchido com tampão PBS e bainha. Certifique-se que o fluxo de fluxo é executado sem problemas.
2. Abra a nova experiência e selecione citômetro parâmetros (detectores fluorescentes) de acordo com as instruções do fabricante. Filtre as células através de filtro de célula de 70 µm e vórtice antes da aquisição de cada amostra para evitar aglomerações e formação de gibão.
3. Fazer lotes do ponto de dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC), que representam o tamanho da célula e granularidade, respectivamente. Otimize as tensões do FSC e SSC para certificar-se de que as células de interesse aparecem nas tramas. Faça lotes do ponto do FSC-A vs FSC-W (ou FSC-H) e desenhar um portão para as células únicas.
4. Fazer lotes do ponto de cada parâmetro fluorescente. Use células imaculadas para determinar o sinal de fundo e usar controles de manchas de cor única para ajustar tensões de cada parâmetro fluorescente, para que as populações de células positivas e negativas são claramente distinguíveis e o intervalo dinâmico de aquisição.
5. Depois de todas as tensões são definidas, use autocompensação se disponível, ou ajustar manualmente a compensação com controles de manchas de cor imaculados e único para corrigir as repercussões espectral. Aplica a compensação de amostras.
6. Fazer um gráfico de ponto de cada parâmetro e elabore portões de acordo com seu conjunto experimental. Por exemplo, FSC-A vs FSC-H (ou FSC-W) para excluir parelhas, seguido pelo FSC-A vs CCD-A para a retenção de linfócitos; SSC-A vs PI (células vivas) e CD4 vs CD8 (Figura 1).
7. Recolha o suficiente eventos (número total de células) para comparação significativa entre populações. Normalmente, pelo menos 1.000 eventos na população de interesse precisam ser obtidos²⁰.
8. Depois que todas as amostras são adquiridas, exporte dados do fluxo a ser analisados pelo software de análise de citometria de fluxo. Salve a experiência como modelo para preservar o citômetro configuração e parâmetros para a aplicação de experimentos semelhantes no futuro.

5. análise de dados

Nota: Existem muitas ferramentas para analisar os dados de fluxo cytometric, tanto comercial e software livre. O software de aquisição dos citômetros também pode funcionar para análise de dados. Aqui usamos o FlowJo como exemplo.

1. Inicie o software e arraste os arquivos FCS em espaço de trabalho. Clique em uma amostra para abrir uma janela gráfica. Selecione os parâmetros a serem apresentados no eixo X e Y, clicando sobre os eixos X e Y. Use a barra de ferramentas para desenhar portões de acordo com marcadores diferencialmente expressos ou fenótipos definidos de populações de células.
2. Adicione portas de cada parâmetro, conforme mostrado na Figura 1. Arraste os portões para todas as amostras na área de trabalho, para que eles fiquem idênticos gating.
3. Arraste as parcelas para o editor de layout para criar relatórios gráficos.
4. Exiba a intensidade média de fluorescência (IFM) para cada população de interesse clicando no botão de estatísticas (Σ) em uma janela gráfica e escolhendo "Quer dizer" e o parâmetro apropriado, por exemplo, o canal usado para detectar a tintura organela específica. Clique em "Adicionar".
5. Clique no ícone do editor de tabela e arraste IFM para editor de tabela para criar relatórios estatísticos. Salve como arquivo Excel, texto ou CSV, para calcular o delta IFM (ΔMFI) como IFM (corantes específicos organela) - IFM (FMO).
   Nota: Não calcular IFM entre amostras adquiridas com citômetro de diferente configurações (tensões, canais fluorescentes ou compensação). As comparações de valores derivados de experimentos com diferentes configurações são sem sentido e tendenciosa.
6. Exporte todos os valores do espaço de trabalho e parcelas do editor de layout para fazer tabelas e figuras.

Resultados

Identificação dos principais células T subconjuntos no baço e Timo

Em breve, suspensões de célula única do baço e Timo foram lysed das células vermelhas do sangue, incubadas com sobrenadante 2.4G2, seguidas por organela específica tintura e marcador de superfície a coloração com anticorpos conjugados de fluorescência (tabela 1). A progressão do desenvolvimento de timócitos pode s...

Discussão

Este protocolo combina corantes específicos organela e marcador de superfície coloração para quantificar a quantidade de mitocôndrias ou lisossomos em populações diferentes de células T. Este método foi desenvolvido para superar a limitação da cela número e homogeneidade requisitos para os métodos tradicionais, tais como a microscopia eletrônica e análise de immunoblot. É especialmente útil na análise de populações de células raras e examinando simultaneamente vários tipos de células ao mesmo tempo...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated)	Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)	Dimeda
15 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL syringe	TERUMO
6 cm Petri dish	α-plus
70 µm nylon cell strainer	SPL Lifesciences	93070
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-mouse CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-mouse CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)	BD Biosciences	352052
FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)	ATCC	HB-197
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Non-essential amino acids (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidium iodide solution	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder)	Gibco	31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070