Multicolor Flow Cytometry-basierte Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen in T-Zellen

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung von Mitochondrien oder Lysosomen in lebenden Zellen. Die Kombination aus Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe mit Gewebekulturen konjugierten Antikörpern gegen Oberflächenmarker ermöglicht die Quantifizierung dieser Organellen in gemischten Zell-Populationen, wie primäre Zellen mithilfe von Gewebeproben, geerntet Multicolor Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

T-Zellen nutzen verschiedene metabolische Programme mit ihren funktionalen Bedürfnissen während der Differenzierung und Proliferation. Mitochondrien sind wichtige zelluläre Komponenten verantwortlich für die Energieversorgung der Zelle; überschüssige Mitochondrien produzieren jedoch auch reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die Zelle Tod verursachen könnte. Daher muss die Anzahl der Mitochondrien ständig angepasst werden die Bedürfnisse der Zellen. Diese dynamischen Regelung erreichen teilweise durch die Funktion der Lysosomen, die Überschuß/beschädigtes Organellen und Makromoleküle zu entfernen. Zellulären Mitochondrien und lysosomale Inhalte sind daher wichtige Indikatoren zur Bewertung der metabolische Anpassung der Zellen. Mit der Entwicklung von Sonden für Organellen sind gut charakterisierten Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe in verschiedenen Formaten zu zellulären Lysosomen und Mitochondrien label geworden. Multicolor Durchflusszytometrie wird sehr häufig verwendet, Profil Zelle Phänotypen und hat die Fähigkeit, mit anderen Tests integriert werden. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll wie Organell-spezifische Farbstoffe mit Oberflächenmarker Färbung um den Lysosomen und Mitochondrien in verschiedenen T-Zell-Populationen auf einem Durchflusszytometer messen zu kombinieren.

Einleitung

Die Aktivierung und Proliferation von T-Zellen sind wichtige Schritte für erfolgreiches Immunantworten Montage. Die jüngsten Fortschritte legen nahe, dass der Zellstoffwechsel eng verknüpft mit der Entwicklung und Funktionen des T-Zellen ist. Beispielsweise greifen naive T-Zellen weitgehend auf Oxidative Phosphorylierung (OXPHOS), während die Rückführung unter sekundären lymphatischen Organe den Energiebedarf zu decken. Nach der Aktivierung unterziehen naive T-Zellen, drastische metabolische Neuprogrammierung, einschließlich die Induktion der aeroben Glykolyse, ATP-Produktion zu erhöhen und die enormen metabolische Anforderungen während der Zelldifferenzierung und Verbreitung zu erfüllen. Die Zellen, die nicht durch die metabolischen Bedürfnisse Folgen sterben durch Apoptose^1,2. Während die metabolische Neuprogrammierung Mitochondrien eine wichtige Rolle da sie weitgehend verantwortlich für die Produktion von ATP zur Energieversorgung für die Zelle Organellen, und der zellulären Mitochondrien Inhalt während metabolische Schalter schwankt in der gesamten T Zelle Entwicklung und Aktivierung³. Allerdings kann die Ansammlung von überflüssigen oder beschädigte Mitochondrien überschüssige ROS führen, die Lipiden, Proteinen und DNA-Schäden, und kann schließlich zu Tod⁴ Zelle führen

Stoffwechselveränderungen infolge übermäßigen oder beschädigten Mitochondrien werden durch eine spezielle Form der Autophagie⁵, bekannt als Mitophagy entfernt. Mitochondrien sind durch Autophagosom gewickelt und dann mit Lysosomen zum Abbau verschmolzen. Diese schließen Kommunikation zwischen Mitochondrien und Lysosomen haben großes Interesse^6,7erzeugt. Zum Beispiel oxidativer Stress stimuliert Mitochondrien Mitochondrien stammenden Vesikeln (MDVs) zu bilden, die auf Lysosomen zum Abbau in einer Phosphatase und tensin Homolog (PTEN) ausgerichtet sind-induzierte vermeintliche Kinase 1 (PINK1) und Parkin (eine E3-Ubiquitin-Ligase) abhängig von Art und Weise⁸. Ferner wurde festgestellt, dass diese Mitophagy für wichtig Beige-weiß Adipocyte Übergang^9,10. Lysosomen sind noch wichtiger ist, nicht nur ein Abbau-Fach, sondern auch ein Regulator der zellulären Signalisierung. Übermäßige Substrat Akkumulation durch Enzymmangel führt zu lysosomalen Dysfunktion durch Unterbrechung lysosomale Membranpermeabilität und Ca^{2 +} Homöostase¹¹betrifft. Die T-Zell-Funktionsstörungen lysosomale saure Lipase (LAL)¹² oder lysosomalen Metabolit Transporter Knockout Maus Modell¹³ ergab ferner die Bedeutung der Lysosomen in T-Zell-Homöostase. Mitochondrien und Lysosomen sind untrennbare Bestandteile des zellulären Stoffwechselregulation. Daher wurde die Messung des zellulären Mitochondrien ein entscheidender Indikator, der T-Zell-metabolische und funktionellen Status zu bewerten.

Assays, die häufig verwendet, um die zellulären Mitochondrien oder lysosomalen Inhalt zu quantifizieren sind Immunoblot, Elektronenmikroskopie, immunofluorescent (IF) Färbung und PCR-Analyse der mitochondrialen DNA Kopie Zahlen^{14,15, 16}. während Immunoblot quantitativ vergleichen kann Proteingehalte in verschiedenen Proben und Elektron oder Mikroskopie morphologischen Kennzeichen dieser Organellen¹⁷visualisieren kann, tragen diese Tests bestimmte technische Nachteile. Zum Beispiel ist es zeitaufwendig, ausreichende Anzahl von Zelle Bilder mit hoher Vergrößerung und Auflösung zu erwerben oder um den Ausdruck eines Proteins über Dutzende von Proben, machen diese Tests als niedriger Durchsatz Methoden vergleichen. Darüber hinaus können diese Tests nur angewendet werden, nicht homogene Zellpopulation, wie Zell-Linien, aber Gewebeproben, die aus gemischten Populationen bestehen.

Es ist auch schwierig, diese Assays für seltene Populationen gelten für die Anforderung des minimalen Zelle von 10 Zahlen⁶ bis 10⁸ ist unmöglich zu erfüllen. Zu guter Letzt sind Zellen in der Regel lysiert oder festen während des Prozesses, so dass sie nicht kompatibel mit anderen Methoden, um weitere Informationen zu extrahieren. Im Vergleich mit den traditionellen Methoden, fluoreszierend-basierte Durchflusszytometrie hat einen relativ hohen Durchsatz - Informationen aller Zellen innerhalb einer Stichprobe bestehend aus gemischten Zellpopulationen analysiert und gleichzeitig gesammelt werden kann. Darüber hinaus kann eine mehr als 10 Parameter auf dieselbe Zelle erkennen und sortieren die Zellen basierend auf gewünschte Phänotypen für weitere Tests. Reaktive fluoreszierende Sonden wurden verwendet, um Lysosomen und Mitochondrien in lebenden Zellen zu kennzeichnen und durch Flow Cytometry^18,19detektiert werden. Diese Organellen-spezifischen Sonden sind Zelle durchlässig und physikalisch-chemischen Eigenschaften, die ihnen ermöglichen, in bestimmten subzellulären Orten oder Organellen konzentriert werden. Praktischerweise sind diese Sonden in verschiedenen fluoreszierenden Formaten, so dass ihre Anwendung für die mehrfarbigen Analyse.

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, Surface Marker Färbung mit Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Farbstoffe zu Label Lysosomen zu kombinieren oder Mitochondrien in lebende Zellen. Dies ist besonders nützlich für Proben aus primären Gewebe und Organe, die oft heterogenen Zellpopulationen bestehen generiert. Forscher identifizieren Zell-Populationen von Interesse durch ihre Oberfläche Marker Ausdruck und speziell den lysosomalen oder mitochondriale Inhalt durch Organell-spezifische Farbstoffe in diesen Zellen zu messen. Hier zeigen wir die Einzelheiten des Verfahrens der durchflusszytometrischen Analyse, die die lysosomale oder mitochondriale Masse in den großen Milz T-Zell-Subpopulationen auswertet.

Protokoll

Das hier beschriebene Maus Gewebe Ernte Verfahren wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der National Yang-Ming University genehmigt.

1. Vorbereitung der Lymphozyten Aussetzung aus lymphatischen Organen

1. Einschläfern der Maus von einer anerkannten Methode wie CO₂ Inhalation in einer transparenten Acryl Kammer gefolgt von zervikale Dislokation Tod sicherzustellen.
   Hinweis: Halten Sie die Durchflussmenge des CO₂ für eine Verschiebung der 20 % pro Minute der Kammer, und nicht höher als 5 Psi (Pfund pro Quadratzoll). Es dauert ca. 2-3 min für eine Maus, um das Bewusstsein verlieren. Pflegen Sie den CO₂ -Fluss mindestens für 1 min, nachdem das Tier aufgehört hat zu atmen (insgesamt ca. 5-7 min).
2. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken auf einem sauberen Brett (z.B. Polystyrol Kunststoffplatte) und befestigen Sie der Gliedmaßen mit Klebeband. Spülen Sie mit 70 % Ethanol.
3. Milz zu ernten, schneiden und die Bauchhöhle mit 11 cm sezierenden Schere (die Milz ist unterhalb des Magens und oberhalb der linken Niere) zu öffnen. Die Milz mit einer Pinzette entfernen und reinigen von Bindegewebe (Schere verwenden, falls erforderlich).
4. Um die Thymusdrüse zu ernten, schneiden Sie das Zwerchfell und den Brustkorb von beiden Seiten mit Präparierscheren. Verwenden Sie Zange zum Anheben des Brustbeins, der gesamte Brusthöhle zu offenbaren. Trennen Sie der Thymus sorgfältig aus den umliegenden Geweben mit einer Schere zu, und entfernen Sie alle verbleibenden Bindegewebe auf ein Papiertuch mit PBS benetzt.
5. Distanzieren Sie das Gewebe mechanisch mit Spritzenkolben in eine 6-cm-Schüssel mit 5 mL eiskaltes FACS Puffer (PBS ergänzt mit 2 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 mM EDTA). Übertragen Sie die Single-Zellsuspension auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen; Waschen Sie die 6-cm-Schüssel mit zusätzlichen 2 mL FACS-Puffer und kombinieren Sie die Wäsche mit Zellsuspension sowie.
6. Zentrifugieren der Zellsuspension (300 X g, für 5 min bei 4 ° C) und den Überstand verwerfen. Wieder aussetzen Sie das Pellet mit 2 mL des Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lyse Puffer (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃ und 0,1 mM Na₂EDTA) für 1 min bei Raumtemperatur (RT), die roten Blutkörperchen lysiert. Den ACK-Puffer zu neutralisieren, indem die Zellsuspension 10 mL FACS Puffer hinzugefügt.
7. Zentrifugieren der Zellsuspension (300 X g, für 5 min bei 4 ° C) und den Überstand verwerfen. Zellen in 5 mL des kompletten RPMI Medium erneut aussetzen (RPMI 1640 Medium, ergänzt mit 10 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES), 100 U/mL Penicillin, 100 mg/mL Streptomycin, 2 mM L-Glutamin, 44 mM Nahco3₃, 1 mM Natrium Pyruvat, 1 % MEM nicht-essentiellen Aminosäuren und 10 % FBS).
8. Filter-Zellsuspension durch eine Zelle Sieb (Pore Größe 70 µm), Zelle Klumpen zu entfernen. Anzahl Zellen mit einem Hemocytometer oder einem automatisierten Zelle Zähler.

2. Quantifizierung der Mitochondrien, Lysosomen

Hinweis: Führen Sie den Organell-spezifische Farbstoff Färbung zuerst, denn die optimale Färbung Voraussetzung für diese Farbstoffe Inkubation bei 37 ° C. Die Färbung der Oberfläche Marker kann wegen Antikörper capping und Verinnerlichung bei dieser Temperatur deutlich reduziert werden.

1. Fügen Sie 1 x 10⁶ Zellen um Rundboden FACS Röhren, Zentrifugieren Zellen (300 X g, für 5 min bei 4 ° C) und überstand verwerfen hinzu.
2. Verdünnen Sie die Sonde auf lagerlösungen auf Arbeit Endkonzentration (100 nM MitoTracker Green oder LysoTracker Green; fortan Mitochondrien oder Lysosomen-spezifische färben, bzw.) in serumfreien Kulturmedium vorgewärmten 37 ° C. Dies ist die funktionierende Lösung für Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische Färbung.
   Hinweis: Testen Sie mehrere Konzentrationen einschließlich arbeiten Konzentrationen von Hersteller (20-200 nM für die Mitochondrien-spezifischen Farbstoff) und 50-75 nM für den Lysosomen-spezifischen Farbstoff verwendet hier vorgeschlagen um die beste Effizienz Färbung zu erhalten. Wählen eine Zellpopulation, die bekannt ist, guten Ausdruck der Färbung Ziel (z. B. Lysosomen) als Positivkontrolle haben (z.B. menschliche CD14⁺ Monozyten). Wählen Sie die Arbeiten Konzentration auf gute Trennung zwischen negativen und positiven Färbung sowie gute Zellviabilität basiert.
3. Aufschwemmen der Zellen in 100 µL der Lysosomen oder Mitochondrien-spezifische funktionierende Lösung zu färben und in 5 % CO₂ Inkubator bei 37 ° C inkubieren für 15 min oder 30 min, beziehungsweise.
4. Fügen Sie 1 mL eiskaltes FACS-Puffer, um die Reaktion zu stoppen. Pellet-Zellen durch Zentrifugation (300 X g, für 5 min bei 4 ° C) und überstand verwerfen. Zellen sind nun bereit für Surface Marker zu beflecken.

3. Oberfläche Marker Färbung

1. Block-Fc-Rezeptoren mit 100 µL vor betitelten 2.4G2 Hybridom Überstand auf Eis für 10 min. Waschen Zellen mit 1 mL FACS-Puffer und Zentrifuge (300 X g, für 5 min bei 4 ° C). Verwerfen Sie überstand.
2. Inkubation der Zellen mit 50 µL vor betitelten Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern Kombination in FACS-Puffer auf dem Eis für 20 min. leicht vermeiden.
   Hinweis: Bereiten Sie Farbe gebeizt Einzelzellen, die enthalten alle die fluoreszierende Antikörper in der Antikörper Kombination und Zellen behandelt nur mit Organell-spezifischen Farbstoff für Einstellung Spannungen jeder Fluoreszenz-Detektor und Entschädigung Korrektur am Fluss CYTOMETER. Ebenso bereiten Sie die Fluoreszenz Minus eins (FMO) als Hintergrund-Kontrollen mithilfe von Zellen mit den Antikörpern, aber ohne Färbung mit Organell-spezifischen Farbstoffen gefärbt.
3. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 mL der FACS-Puffer und Pellet durch Zentrifugieren (300 X g, für 5 min bei 4 ° C). Verwerfen Sie überstand.
4. Aufschwemmen der Zellen in 300 µL der FACS-Puffer mit 1 µg/mL Propidium Jodid (PI) und sofort analysieren die Proben am Durchflusszytometer.

(4) Probenentnahme am Durchflusszytometer

1. Schalten Sie den Computer, Durchflusszytometer, FACS-Datenerfassungs-Software und andere Zusatzgeräte je nach Maschinenplattform. Führen Sie PBS für etwa 1 min Sicherstellung der Flusslinie mit PBS und Mantel Puffer gefüllt ist. Stellen Sie sicher, dass der Durchfluss reibungslos abläuft.
2. Öffnen Sie neues Experiment zu und wählen Sie Cytometer Parameter (fluoreszierende Detektoren) nach Anleitung des Herstellers. Filtern Sie Zellen bis 70 µm Zelle Sieb und Wirbel vor der Übernahme von jeder Probe, Klumpen und Wams-Bildung zu vermeiden.
3. Stellen Sie Punkt plottet der forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC), die Zellengröße und Granularität, bzw. darstellen. Optimieren Sie die Spannungen der FSC und SSC um sicherzustellen, dass die Zellen von Interesse in den Parzellen erscheinen. Machen Sie Punkt plottet der FSC-A vs. FSC-W (oder FSC-H) und zeichnen Sie ein Tor für die Einzelzellen zu.
4. Stellen Sie Punkt plottet der einzelnen fluoreszierende Parameter. Verwenden Sie ungefärbte Zellen zu bestimmen Hintergrundsignal und einzelne Farbe gebeizt Steuerelemente verwenden, um die Spannungen der einzelnen fluoreszierende Parameter anpassen, so dass positive und negative Zellpopulationen klar unterscheidbar sind und innerhalb des dynamischen Bereichs des Erwerbs.
5. Nachdem alle Spannungen eingestellt sind, verwenden Sie Auto-Entschädigung, falls vorhanden, oder manuell passen Sie an, die Entschädigung mit ungefärbten und einzelne Farbe gebeizt Kontrollen, das spektrale übergreifen zu korrigieren. Gelten Sie die Entschädigung für Proben.
6. Machen Sie einen Dot-Plot der einzelnen Parameter und aufzustellen Sie Tore nach Ihren experimentellen Satz. Zum Beispiel FSC-A vs. FSC-H (oder FSC-W) auszuschließende Dubletten, gefolgt von FSC-A vs. SSC-A für die Lymphozyten Anspritzung; SSC-A vs. PI (lebende Zellen) und CD4 und CD8 (Abbildung 1).
7. Sammeln Sie genug Veranstaltungen (insgesamt Handynummer) für einen aussagekräftigen Vergleich zwischen Populationen. In der Regel müssen mindestens 1.000 Ereignisse in der Bevölkerung von Interesse²⁰bezogen werden.
8. Nachdem alle Proben erworben werden, exportieren Sie Bewegungsdaten von Flow Cytometry Analysesoftware ausgewertet werden. Speichern Sie das Experiment als Vorlage zur Erhaltung der Cytometer Einstellung und Parameter für die Anwendung auf ähnliche Experimente in der Zukunft.

(5) Datenanalyse

Hinweis: Es gibt viele Tools, durchflusszytometrischen Bewegungsdaten, kommerzieller und freier Software zu analysieren. Die Software zur Datenerfassung von fließen Cytometers kann auch für die Datenanalyse arbeiten. Hier haben wir FlowJo als Beispiel verwendet.

1. Starten Sie die Software und ziehen Sie die FCS-Dateien in den Arbeitsbereich. Klicken Sie auf eine Probe, ein Grafik-Fenster zu öffnen. Wählen Sie die Parameter am vorgelegt werden X und Y Achse durch Klicken auf die X- und y-Achsen. Mithilfe der Symbolleiste Tore nach differentiell exprimierten Marker oder definierten Phänotypen Zellpopulationen zu zeichnen.
2. Fügen Sie Tore der einzelnen Parameter hinzu, wie in Abbildung 1dargestellt. Tore für alle Proben in den Arbeitsbereich ziehen, so dass sie identisch gating.
3. Ziehen Sie die Grundstücke in Layout-Editor zum Erstellen von grafischen Berichten.
4. Anzeigen der mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jede Bevölkerung von Interesse durch Klicken auf die Schaltfläche Statistik (Σ) in einem grafischen Fenster und wählen Sie "Bedeuten" und den entsprechenden Parameter, z. B. Kanal Organell-spezifische Färbung zu erkennen. Klicken Sie dann auf "Hinzufügen".
5. Klicken Sie auf die Tabelle Editor-Symbol und ziehen Sie MFI in Tabellen-Editor zum Erstellen von statistischen Berichten. Speichern Sie als Excel, Text oder CSV-Datei, Delta MFI (ΔMFI) als MFI (Organell-spezifische Farbstoffe) - MFI (FMO) zu berechnen.
   Hinweis: Berechnen nicht MFI zwischen Proben mit verschiedenen Cytometer erworbenen Einstellungen (Spannungen, fluoreszierende Kanäle oder Entschädigung). Vergleiche von Werten abgeleitet aus Experimenten mit unterschiedlichen Einstellungen sind bedeutungslos und voreingenommen.
6. Exportieren Sie alle Werte aus dem Arbeitsbereich und Grundstücke aus Layout-Editor für die Herstellung von Tabellen und Abbildungen.

Ergebnisse

Identifikation der großen T Zelle Teilmengen in Milz und thymus

Kurz gesagt, wurden einzelne Zellsuspensionen von Milz und Thymus der Erythrozyten lysiert, mit 2.4G2 überstand inkubiert, gefolgt von Organell-spezifische Farbe und Oberfläche Marker Färbung mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern (Tabelle 1). Die Entwicklung Fortschreiten der Thymozyten kann mithilfe von Antikörpern gegen d...

Diskussion

Dieses Protokoll verbindet Organell-spezifische Farbstoffe und Oberfläche Marker Färbung um die Menge der Mitochondrien oder Lysosomen in verschiedenen T-Zell-Populationen zu quantifizieren. Diese Methode wurde entwickelt, um die Beschränkung der Zelle Nummer und Homogenität zum traditionellen Methoden, z. B. Elektronenmikroskopie und Immunoblot Analyse zu überwinden. Es ist besonders nützlich in seltenen Zellpopulationen zu analysieren und gleichzeitig mehrere Zelltypen gleichzeitig untersuchen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated)	Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)	Dimeda
15 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL syringe	TERUMO
6 cm Petri dish	α-plus
70 µm nylon cell strainer	SPL Lifesciences	93070
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-mouse CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-mouse CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)	BD Biosciences	352052
FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)	ATCC	HB-197
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Non-essential amino acids (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidium iodide solution	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder)	Gibco	31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070