Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T

Riepilogo

Questo articolo viene illustrato un metodo potente per quantificare i mitocondri o i lisosomi delle cellule viventi. La combinazione di coloranti specifici lisosoma o mitocondri con anticorpi fluorescente coniugati contro marcatori di superficie permette la quantificazione di questi organelli in popolazioni di cellule miste, come primario cellule ottenute da campioni di tessuto, utilizzando citometria a flusso multicolor.

Abstract

Le cellule T utilizzano programmi metabolici differenti per soddisfare le loro esigenze funzionale durante il differenziamento e la proliferazione. I mitocondri sono componenti cruciali cellulare responsabile della fornitura di energia delle cellule; Tuttavia, i mitocondri in eccesso producono anche le specie reattive dell'ossigeno (ROS) che potrebbero causare la morte delle cellule. Di conseguenza, il numero dei mitocondri costantemente deve essere regolato per soddisfare le esigenze delle cellule. Questa regolazione dinamica avviene in parte attraverso la funzione dei lisosomi che rimuovere macromolecole e organelli avanzo/danneggiato. Quindi, il contenuto cellulare di lisosomiale e mitocondriale è indicatori chiave per valutare la regolazione metabolica delle cellule. Con lo sviluppo di sonde per organelli, lisosoma ben caratterizzato o mitocondri specifici coloranti sono diventati disponibili in vari formati per etichettare i mitocondri e lisosomi cellulari. Citometria a flusso multicolor è uno strumento comune per fenotipi cellulari di profilo e ha la capacità di essere integrato con altri dosaggi. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato di come combinare organello specifici coloranti con marcatori di superficie macchiatura per misurare la quantità dei lisosomi e dei mitocondri in popolazioni differenti delle cellule T su un citometro a flusso.

Introduzione

L'attivazione e la proliferazione delle cellule di T sono passaggi critici per il successo delle risposte immunitarie di montaggio. Gli avanzamenti recenti suggeriscono che il metabolismo cellulare è strettamente associato con lo sviluppo e la funzioni delle cellule T. Ad esempio, le cellule T naive si basano in gran parte su fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per soddisfare la domanda di energia durante il ricircolo tra organi linfoidi secondari. Al momento dell'attivazione, le cellule T naive subiscono drastica metabolica riprogrammazione, compresa l'induzione di glicolisi aerobica per aumentare la produzione di ATP e per soddisfare l'enorme richiesta metabolica durante la proliferazione e differenziazione cellulare. Le cellule che non riescono a seguire attraverso il fabbisogno metabolico die da apoptosi^1,2. Durante la riprogrammazione metabolico, i mitocondri svolgono un ruolo importante poiché essi sono gli organelli in gran parte responsabili per la produzione di ATP per la fornitura di energia per la cellula, e il contenuto di mitocondri cellulari fluttua durante il metabolici interruttori in tutto cellula T sviluppo e attivazione³. Tuttavia, l'accumulo di mitocondri superflui o danneggiati possa produrre ROS in eccesso che danneggiare lipidi, proteine e DNA e può finalmente condurre a cellule morte⁴

I mitocondri danneggiati o eccessivi derivanti da alterazioni metaboliche vengono rimossi da una forma specializzata di autofagia⁵, noto come mitophagy. I mitocondri sono avvolto da autofagosomi e quindi fusi con i lisosomi per la degradazione. Questi vicino comunicazioni tra mitocondri e lisosomi hanno generato grande interesse^6,7. Ad esempio, lo sforzo ossidativo stimola i mitocondri per formare vescicole mitocondri-derivato (MDVs) che sono mirate al lisosomi per la degradazione in un omologo fosfatasi e tensin (PTEN)-indotto putativa chinasi 1 (PINK1) e parkin (una E3 ubiquitina ligasi) modo dipendente⁸. È emerso inoltre che mitophagy è essenziale per la transizione dell'adipocita bianco-beige^9,10. Ancora più importante, i lisosomi non sono semplicemente un vano di degrado, ma anche un regolatore di segnalazione cellulare. Accumulo eccessivo di substrato a causa di carenze di enzima provoca la disfunzione lysosomal interrompendo la permeabilità della membrana lisosomiale e colpisce il Ca^{2 +} omeostasi¹¹. Difetti funzionali delle cellule T in lipasi acida lysosomal (LAL)¹² o metabolita lysosomal transporter knockout mouse modello¹³ ha mostrato ulteriormente l'importanza dei lisosomi nel mantenimento dell'omeostasi delle cellule T. Sia i mitocondri ed i lisosomi sono parti inseparabili di regolazione metabolica cellulare. Misura del contenuto cellulare mitocondriale è stato quindi un indicatore fondamentale per valutare lo stato metabolico e funzionale di cellule T.

Analisi comunemente usate per quantificare il contenuto cellulare mitocondriale o lysosomal includono immunoblot, microscopia elettronica, colorazione di immunofluorescenza (IF) e l'analisi PCR di mitocondriale del DNA copia numeri^{14,15, 16}. mentre immunoblot quantitativamente è in grado di confrontare i livelli della proteina attraverso diversi campioni ed elettrone o se microscopia può visualizzare le caratteristiche morfologiche di questi organelli¹⁷, questi saggi sopportano alcuni inconvenienti tecnici. Ad esempio, è molto tempo per acquisire sufficiente numero di cellulare immagini con alto ingrandimento e risoluzione o per confrontare i livelli di espressione di una proteina attraverso decine di campioni, rendendo questi saggi considerati metodi di basso rendimento. Inoltre, queste analisi possono essere applicate solo a popolazione omogenea delle cellule, ad esempio linee cellulari, ma non per i campioni di tessuto che sono composte da popolazioni miste.

È anche difficile applicare tali saggi a popolazioni rari, per cui il requisito di cellule minimal numeri da 10⁶ -10⁸ è impossibile da rispettare. Infine, le cellule sono solitamente lisate o fisso durante il processo, rendendoli incompatibili con altri metodi per estrarre ulteriori informazioni. Rispetto ai metodi tradizionali, basati su fluorescente flusso cytometry ha un relativamente alto throughput - le informazioni di tutte le celle all'interno di un campione composto da popolazioni miste di cellule possono essere analizzate e raccolti simultaneamente. In più, uno in grado di rilevare più di 10 parametri sulla stessa cellula e ordinare le celle basate sui fenotipi desiderati per ulteriori analisi. Sonde fluorescenti reattivi sono stati usati per etichettare i lisosomi e mitocondri in cellule vive e possono essere rilevati da flusso cytometry^18,19. Queste sonde di organelli specifici sono cellulare permeabile e hanno caratteristiche fisico-chimiche che permettono loro di essere concentrata in determinate località subcellulare o organelli. Convenientemente, queste sonde sono disponibili in vari formati fluorescenti, permettendo così la loro applicazione per l'analisi multicolor.

Questo protocollo viene descritto in dettaglio come combinare marcatore di superficie colorazione con coloranti specifici lisosoma o mitocondri lisosomi etichetta o mitocondri in cellule vivono. Ciò è particolarmente utile per campioni generati da tessuti primari e gli organi, che sono spesso composte da popolazioni eterogenee delle cellule. Ricercatori è in grado di identificare popolazioni cellulari di interesse dalla loro espressione di superficie dell'indicatore e misurare specificamente il contenuto lisosomiale o mitocondriale attraverso degli organelli specifici coloranti in queste cellule. Qui, dimostriamo la procedura dettagliata di analisi cytometric di flusso che valuta la massa lisosomiale o mitocondriale nelle sottopopolazioni principali splenico delle cellule T.

Protocollo

La procedura di raccolta del tessuto del mouse qui descritta è stata approvata dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della National Yang-Ming University.

1. preparazione della sospensione del linfocita da organi linfoidi

1. Eutanasia il mouse da un metodo approvato come l'inalazione di CO₂ in un alloggiamento acrilico trasparente seguito da dislocazione cervicale per assicurare la morte.
   Nota: Mantenere il tasso di flusso di CO₂ per uno spostamento di 20% al minuto della camera e non superiore a 5 psi (libbra per pollice quadrato). Ci vogliono 2-3 minuti per un mouse a perdere coscienza. Mantenere il flusso di CO₂ almeno per 1 min dopo che l'animale ha smesso di respirare (5-7 min complessiva).
2. Posizionare il mouse sul dorso su un bordo pulito (ad esempio un bordo di plastica polistirolo) e difficoltà degli arti con nastro adesivo. Sciacquare con etanolo al 70%.
3. Per raccogliere la milza, tagliare e aprire la cavità addominale con le forbici per dissezione 11 cm (la milza è sotto lo stomaco e sopra il rene di sinistra). Rimuovere la milza con le pinzette e pulire da tessuti connettivi (se necessario, usare le forbici).
4. Per raccogliere il timo, tagliare il diaframma e la gabbia toracica da entrambi i lati con le forbici di dissezione. Utilizzare pinze per sollevare lo sterno per rivelare tutta la cavità toracica. Separare con cura il timo dai tessuti circostanti con le forbici e rimuovere qualsiasi residuo tessuto connettivo su un tovagliolo di carta inumidito con PBS.
5. Meccanicamente dissociare i tessuti con un stantuffo della siringa in un piatto di 6 cm contenente 5 mL di tampone ghiacciata di FACS (PBS completato con 2% siero bovino fetale (FBS) e 1 mM EDTA). Trasferire la sospensione unicellulare in una provetta per centrifuga 15 mL; lavare il piatto di 6 cm con buffer di ulteriori 2 mL FACS e combinare il lavaggio con sospensione cellulare pure.
6. Centrifugare la sospensione cellulare (300 x g, per 5 min a 4 ° C) e scartare il surnatante. Risospendere il pellet con 2 mL di ammonio-cloruro-potassio (ACK) Lisi tampone (155 mM NH₄Cl, 10mm KHCO₃ e 0,1 mM Na₂EDTA) per 1 min a temperatura ambiente (TA) a lisare cellule rosse del sangue. Neutralizzare il buffer ACK aggiungendo 10 mL di tampone di FACS alla sospensione di cellule.
7. Centrifugare la sospensione cellulare (300 x g, per 5 min a 4 ° C) e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 5 mL di terreno RPMI completo (medium RPMI 1640, integrato con NaHCO₃di 44 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), 100 U/mL di penicillina, 100 mg/mL di streptomicina, 2 mM L-Glutammina, piruvato di sodio di 1 mM, 1% MEM non essenziali aminoacidi e 10% FBS).
8. Filtro sospensione cellulare attraverso un colino di cella (poro dimensioni 70 µm) per rimuovere gruppi di cellule. Contare le celle con un emocitometro o contatore di cellule automatizzato.

2. quantificazione dei mitocondri e lisosomi

Nota: Eseguire la tintura di organelli specifici macchiatura in primo luogo perché la condizione di colorazione ottima per questi coloranti è incubazione a 37 ° C. La macchiatura di superficie dell'indicatore può essere notevolmente ridotto a causa dell'anticorpo tappatura e interiorizzazione a quella temperatura.

1. Aggiungere 1 x 10⁶ cellule per turno-fondo FACS tubi, centrifugare le cellule (300 x g, per 5 min a 4 ° C) ed eliminare il surnatante.
2. Diluire le soluzioni stock sonda alla concentrazione finale di lavoro (100 nM MitoTracker Green o LysoTracker Green; d'ora in poi specifici mitocondri o lisosoma tingere, rispettivamente) nel mezzo di coltura privo di siero pre-riscaldato 37 ° C. Questa è la soluzione di lavoro per tintura lisosoma - o mitocondrio-specifica.
   Nota: Test concentrazioni multiple compreso l'intervallo di concentrazioni di lavoro suggerito dal produttore (20-200 nanometro per la tintura di mitocondrio-specifica) e 50-75 nM per la tintura di lisosoma-specifico usata qui per ottenere la migliore efficienza di colorazione. Scegliere una popolazione di cellule che è noto per avere buona espressione di macchiatura di destinazione (ad es. i lisosomi) come controllo positivo (ad esempio umano CD14⁺ monociti). Scegliere la concentrazione di lavoro basata sulla buona separazione tra la macchiatura negativa e positiva, come pure buona attuabilità.
3. Risospendere le cellule in 100 µ l del lisosoma-mitocondri-specifici o tingono la soluzione di lavoro ed incubare 5% CO₂ incubatore a 37 ° C per 15 min o 30 min, rispettivamente.
4. Aggiungere 1 mL di tampone di FACS ghiacciata per arrestare la reazione. Pellet di cellule mediante centrifugazione (300 x g, per 5 min a 4 ° C) ed eliminare il surnatante. Le cellule sono ora pronte per la colorazione di superficie dell'indicatore.

3. superficie dell'indicatore colorazione

1. Recettori Fc di blocco con 100 µ l di pretitolata ibridoma 2.4G2 surnatante sul ghiaccio per 10 min. celle di lavaggio con 1 mL di tampone di FACS e centrifugare (300 x g, per 5 min a 4 ° C). Gettare il surnatante.
2. Incubare le cellule con 50 µ l anticorpo coniugato fluorescenza pretitolata combinazione nel buffer di FACS in ghiaccio per 20 min. evitare luce.
   Nota: Preparare singole cellule colore tinto che includono tutti gli anticorpi fluorescenti presentano nell'anticorpo combinazione e cellule trattate solo con tintura di organelli specifici per impostare la tensione di ogni regolazione del rivelatore e compensazione di fluorescenza sul flusso citometro. Allo stesso modo, preparare la fluorescenza meno uno (FMO) come sfondo controlli utilizzando le cellule colorate con tutti gli anticorpi, ma senza colorazione con coloranti specifici organelli.
3. Lavare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone di FACS e pellet mediante centrifugazione (300 x g, per 5 min a 4 ° C). Gettare il surnatante.
4. Risospendere le cellule in 300 µ l di tampone di FACS contenente 1 µ g/mL di ioduro di propidio (PI) e analizzare immediatamente i campioni il citometro a flusso.

4. campionario il citometro a flusso

1. Accendere il computer, citometro a flusso, software di acquisizione di FACS e altri eventuali dispositivi accessori a seconda della piattaforma di macchina. Eseguire PBS per circa 1 min per garantire la linea di flusso è riempito con il tampone PBS e guaina. Assicurarsi che il flusso di flusso senza intoppi.
2. Aprire un nuovo esperimento e selezionare citometro parametri (fluorescente rivelatori) seguendo le istruzioni del produttore. Filtrare le cellule attraverso il filtro cella 70 µm e vortex prima dell'acquisizione di ciascun campione per evitare grumi e formazione doppietto.
3. Fare appezzamenti di puntino di forward scatter (FSC) e side scatter (SSC), che rappresentano la dimensione della cella e granularità, rispettivamente. Ottimizzare le tensioni del FSC e SSC per assicurarsi che le celle di interesse vengono visualizzati nelle trame. Fate appezzamenti di puntino di FSC-A vs FSC-W (o FSC-H) e disegnare un cancello per le singole celle.
4. Fare appezzamenti di puntino di ogni parametro fluorescente. Utilizzare cellule non macchiate per determinare il segnale di fondo e utilizzare singoli colore tinto controlli per regolare le tensioni di ogni parametro fluorescente, affinché le popolazioni delle cellule positive e negative sono chiaramente distinguibili e all'interno della gamma dinamica di acquisizione.
5. Una volta impostate tutte le tensioni, utilizzare auto-compensazione se disponibile, oppure regolate manualmente la compensazione con controlli non macchiate e singoli colore-tinto per correggere spillover spettrale. Applicare la compensazione ai campioni.
6. Fare una trama di punti di ogni parametro e redige cancelli secondo il tuo set sperimentali. Ad esempio, FSC-A vs FSC-H (o FSC-W) escludere doppietti, seguita da FSC-A vs SSC-A per gating dei linfociti; SSC-A vs PI (cellule vive) e CD4 e CD8 (Figura 1).
7. Raccogliere abbastanza eventi (numero totale delle cellule) per confronto significativo tra popolazioni. In genere, almeno 1.000 eventi nella popolazione di interesse devono essere ottenuti²⁰.
8. Dopo che tutti i campioni vengono acquisiti, esportare i dati di flusso per l'analisi mediante software di analisi di citometria a flusso. Salvare l'esperimento come modello per preservare il citometro impostazione e parametri per l'applicazione a esperimenti simili in futuro.

5. analisi dei dati

Nota: Ci sono molti strumenti per analizzare i dati di flusso cytometric, sia il software libero commerciale. Il software di acquisizione di citometri a flusso può funzionare anche per l'analisi dei dati. Qui abbiamo usato FlowJo come un esempio.

1. Avviare il software e trascinare i file FCS nell'area di lavoro. Fare clic su un campione di aprire una finestra grafica. Selezionare i parametri per essere presentato su assi X e Y facendo clic sugli assi X e Y. Utilizzare la barra degli strumenti per disegnare cancelli secondo differenzialmente espressi marcatori o definiti fenotipi di popolazioni cellulari.
2. Aggiungere porte di ogni parametro, come illustrato nella Figura 1. Trascinare cancelli a tutti i campioni nell'area di lavoro, in modo che ottengono identici gating.
3. Trascinare le trame di editor di layout per creare report grafici.
4. Visualizzare l'intensità media di fluorescenza (MFI) per ciascuna popolazione di interesse facendo clic sul pulsante Statistiche (Σ) in una finestra grafica e scegliendo "Significa" e il parametro appropriato, ad esempio, il canale utilizzato per rilevare specifiche organello tintura. Fare clic su "Aggiungi".
5. Fare clic sull'icona editor tabella e trascinare MFI tabella editor per creare report statistici. Salvare come file CSV, testo o Excel per calcolare il delta IFM (ΔMFI) come MFI (organelli specifici coloranti) - MFI (FMO).
   Nota: Non calcolare MFI tra campioni acquisiti con citometro a diversa impostazioni (tensioni, canali fluorescente o compensazione). I confronti di valori derivati da esperimenti con diverse impostazioni sono prive di significato e prevenuto.
6. Esportare tutti i valori dall'area di lavoro e grafici da editor di layout per la fabbricazione di tabelle e figure.

Risultati

Identificazione dei sottoinsiemi principali delle cellule di T in milza e timo

In breve, sospensioni di cellule singole da milza e timo sono state lisate di cellule rosse del sangue, incubate con 2.4G2 surnatante, seguite da colorante specifico organello e marcatore di superficie macchiando con gli anticorpi coniugati a fluorescenza (tabella 1). La progressione dello sviluppo dei timociti può e...

Discussione

Questo protocollo combina organello specifici coloranti e marcatore di superficie macchiatura per quantificare la quantità di mitocondri o lisosomi in popolazioni differenti delle cellule T. Questo metodo è stato sviluppato per superare le limitazioni dei requisiti di numero e omogeneità di cella per i metodi tradizionali, come la microscopia elettronica e l'analisi di immunoblot. È particolarmente utile nell'analisi di popolazioni di cellule rare ed esaminare contemporaneamente più tipi di cellule allo stesso tempo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Graefe forceps (straight and serrated)	Dimeda
11 cm Iris scissors (straight with sharp/sharp heads)	Dimeda
15 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	339650
5 mL syringe	TERUMO
6 cm Petri dish	α-plus
70 µm nylon cell strainer	SPL Lifesciences	93070
Ammonium chloride (NH4Cl)	Sigma	A9434
Anti-mouse CD25	Biolegend	102007	Clone:PC61
Anti-mouse CD4	Biolegend	100453	Clone:GK1.5
Anti-mouse CD44	Biolegend	103029	Clone:IM7
Anti-mouse CD62L	Biolegend	104407	Clone:MEL-14
Anti-mouse CD8	Biolegend	100713	Clone:53-6.7
Anti-mouse TCRβ	Biolegend	109233	Clone:H57-579
BD LSRFortessa	BD Biosciences
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio basic	6381-92-6
FALCON 5ml Polystyrene Round-Bottom Tube (FACS tube)	BD Biosciences	352052
FcRgamma II (CD32) Hybridoma (2.4G2)	ATCC	HB-197
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	ATD161145
Flowjo, LLC	BD Biosciences
Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma	H4034
L-glutamine (200 mM)	Gibco	A2916801
LysoTracker Green DND26	Thermo Fisher Scientific	L7526
MEM Non-essential amino acids (100X)	Gibco	11140050
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Potassium bicarbonate (KHCO3)	J.T.baker	298-14-6
Propidium iodide solution	Sigma	25535-16-4
RPMI 1640 medium (powder)	Gibco	31800089
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma	S5761
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070