Una técnica de oclusión de la arteria cerebral media para inducir la depresión post-accidente cerebrovascular en ratas

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para inducir la depresión post-accidente cerebrovascular en ratas, ocluendo la arteria cerebral media a través de la arteria carótida interna. Usamos la prueba de natación forzada de Porsolt y la prueba de preferencia de sacarosa para confirmar y evaluar Estados de ánimo depresivos inducidos.

Resumen

La depresión posterior al accidente cerebrovascular (PSD) es la más recurrente de todas las complicaciones psiquiátricas resultantes de un accidente cerebrovascular isquémico. Una mayoría mayor (alrededor del 60%) de todos los pacientes con accidente cerebrovascular isquémico sufren de PSD, un trastorno considerado como un precursor isquémico relacionado con el accidente cerebrovascular para aumentar la muerte y la degradación de la salud. La fisiopatología del PSD sigue siendo oscura. Para estudiar el mecanismo de desarrollo y la ocurrencia de PSD más, y para encontrar una terapia, intentamos desarrollar un nuevo protocolo que requiera ocluir la arteria cerebral media (MCA) a través de la arteria carótida interna (ICA) en ratas. Este protocolo describe un modelo de PSD inducido en ratas a través de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). También se utilizan en el experimento son la prueba de natación forzada Porsolt y la prueba de preferencia de sacarosa para confirmar y evaluar el estado de ánimo depresivo de las ratas bajo investigación. En lugar de insertar el catéter a través de la arteria carótida externa (ECA), según lo estipulado para el procedimiento original, esta técnica de MCAO tiene el monofilamento que pasa directamente a través de la ICA. Esta técnica de MCAO se desarrolló hace unos años y conduce a una reducción de la mortalidad y la variabilidad. Generalmente se acepta que los criterios utilizados son preferidos en la selección de modelos biológicos. Los datos obtenidos con este protocolo muestran que este modelo de MCAO podría ser una forma de inducir el PSD en ratas y podría potencialmente conducir a la comprensión de la fisiopatología y el desarrollo futuro de nuevos fármacos y otros agentes neuroprotectores.

Introducción

El accidente cerebrovascular es cuarto en la lista de enfermedades perpetrantes de muerte en los Estados Unidos^1,2,3, mientras que causa la mayoría de las discapacidades en adultos en los países desarrollados⁴; Esto hace que el accidente cerebrovascular sea un contendiente líder entre los problemas de salud más importantes del mundo. La normalidad en los pacientes sobrevivientes de un accidente cerebrovascular es poco frecuente, con alrededor del 15%-40% de las víctimas de supervivencia que sufren incapacidad permanente, 20% que requieren atención institucional 3 meses después del inicio del accidente cerebrovascular⁵, y alrededor de un tercio de los sobrevivientes de 6 meses que necesitan a otros para ayudarles a vivir a través de cada día⁶. Al parecer, el accidente cerebrovascular también representa el aumento del gasto sanitario nacional⁷. Las estimaciones de la Asociación Americana del corazón tienen costos relacionados con los accidentes cerebrovasculares en los Estados Unidos en más de $50 mil millones en 2010⁸.

El accidente cerebrovascular no solo causa daños a largo plazo a los individuos, pero algunos sobrevivientes tienden a sufrir trastornos emocionales y conductuales, como demencia, fatiga, ansiedad, depresión, delirio y agresión^{9,10,11 ,12,13,14}. La secuela psicológica más recurrente después de un accidente cerebrovascular es la depresión posterior al accidente cerebrovascular (PSD), diagnosticada en alrededor del 40%-50% de las supervivientes^15,16,17. La depresión inducida por el accidente cerebrovascular provoca una mayor morbilidad y mortalidad^{18,19,20,21,22}. La fisiopatología del PSD no se conoce por completo, pero aparentemente es causada por múltiples factores y está relacionada con la discapacidad, el deterioro cognitivo y el sitio de la lesión²³.

El modelo de rata de la isquemia del cerebro focal, creado por Mcao, es el modelo animal más extendido del accidente cerebrovascular^24,25,26,27. Al demostrar la inducción de PSD en ratas mediante la oclución del MCA a través de la ICA, se emplean técnicas que minimizan la mortalidad y la variabilidad en el modelo MCAO²⁸.

El objetivo principal de este protocolo es delinear los pasos para inducir el PSD en ratas por ocluir el MCA a través de la ICA, un modelo modificado de MCAO, que reduce la mortalidad y el resultado de la variabilidad²⁸. Los objetivos específicos incluyen realizar exámenes neurológicos e histológicos (determinar la puntuación de severidad neurológica [NSS], el volumen de la zona de infarto, y edema cerebral) para verificar la eficacia de MCAO y el uso de pruebas de comportamiento para examinar la influencia de este procedimiento de la MCAO en el desarrollo de trastornos emocionales, principalmente PSD.

Protocolo

El Comité de cuidado de animales de la Universidad Ben-Gurion del Negev, Israel aprobó todos los procedimientos de tratamiento y prueba utilizados en este protocolo.

1. preparación de ratas para el procedimiento experimental

Nota: Seleccione ratas macho adultas Sprague-Dawley con un peso de 300-350 g.

1. Casa las ratas, cuatro por jaula, en un Vivarium a 22 ° c y 40% de humedad, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h invertido (se apaga a las 8:00 a.m.) y acceso ilimitado a alimentos y agua.
2. Asigne aleatoriamente las ratas a dos grupos, a saber, un grupo MCAO (n = 24) y un grupo Sham (n = 19).

2. preparación de ratas para la cirugía

1. Para preparar las ratas para el procedimiento MCAO modificado, anestesiar cada rata durante 30 min con una mezcla de isoflurano (4% para inducción, 2% para cirugía, y 1,3% para mantenimiento) en 24% de oxígeno (2 L/min) en una cámara de inducción y permitir que respire espontáneamente^{29 ,30}.
   Nota: Estimula el reflejo de abstinencia del pedal pellizcando la piel entre los dedos de los pies y/o las almohadillas de los pies usando fórceps Romo. Considere la profundidad de la anestesia adecuada cuando el reflejo desaparece.
2. Mantener la temperatura corporal central a 37 ° c con una placa calefactora.
3. Mida la temperatura corporal de todas las ratas a través de una sonda colocada en el recto de la rata antes de comenzar el procedimiento quirúrgico.
4. Mantenga la temperatura corporal constante (37 ° c) para que todas las ratas minimicen cualquier efecto hipotérmico sobre el resultado neurológico y cualquier lesión neurológica.
5. Aplica un ungüento de lágrimas artificiales a ambos ojos de cada animal mientras se encuentran en la mesa de preparación.
6. Afeitarse el cuello de cada rata y desinfectar la piel con un 70% de alcohol clorhexidina (70% de alcohol y 0,5% de gluconato de clorhexidina). Repite el paso de desinfección dos veces más.
7. Cubra las ratas con cortinas quirúrgicas esterilizadas.

3. cirugía (la técnica MCAO)

Nota: Realizar la cirugía según lo descrito por Boyko et al.²⁸ y utilizar los instrumentos suministrados por McGarry et al.²⁹ y uluç et al.³⁰.

1. Realizar una incisión ventral de la línea media y diseccionar la fascia superficial.
2. Realice cuidadosamente una disección aguda y contundente dentro de los tres músculos en forma de triángulo (el esternohioide, el digastrico y el músculo esternomastoideo) para identificar las arterias carótidas (el TCE, la ICA y la arteria carótida común [CCA]).
3. Diseccionar y exponer cuidadosamente la CCA derecha y la ICA.
4. Separe la CCA derecha y la ICA del nervio vago.
   Nota: Al identificar las arterias carótidas según lo estipulado en el paso 3,2, la ICA se reconocería como la mitad de las ramas de la CCA junto con el TCE.
5. Inserte una sonda (nailon-blunted o silicona-recubierto 4-0 nylon) monofilamento directamente a través de la ICA, ~ 18.5-19 mm desde el punto de bifurcación de la CCA derecha en el círculo de Willis hasta llegar a una resistencia leve, a ocluir MCA.
   Nota: El filamento de calor-blunted y el nylon recubierto de silicona 4-0 juegan el mismo papel y son los monofilamentos más preferidos en los últimos tiempos, dado que proporcionan una mejor oclusión que el hilo de nylon liso^28,30.
6. Atar una sutura de seda 4-0 alrededor de la ICA justo por encima de la derecha CCA (arteria pterygopalatina) bifurcación para bloquear la ICA proximal al punto de inserción del filamento permanentemente y distal a él temporalmente.
7. Atar la ICA alrededor del hilo intraluminal para sujetar la sutura de seda para prevenir el sangrado.
8. Someter las ratas que operan simuladas al mismo procedimiento quirúrgico que las ratas MCAO, pero Inserte un hilo de nylon en lugar de²⁸.
   Nota: El hilo de nylon, como el nylon recubierto de silicio, ocluye el ICA, pero no es tan eficaz como este último.
9. Cierre la herida en el cuello de la rata después de oclusionar el MCA, apague la anestesia y coloque la rata en una incubadora bajo observación hasta que se despierte.
   Nota: La necesidad de la ligadura proximal es ocluir la ICA, y la de la ligadura distal adicional es reducir el sangrado alrededor del filamento y asegurarlo en su lugar. Además, la rata debe despertar unos minutos después de que su herida haya sido cerrada.

4. recuperación post-quirúrgica

1. Administrar 5 mL de solución salina al 0,9% a cada rata intraperitonealmente, inmediatamente después de la cirugía, para prevenir la deshidratación.
2. Administrar la analgesia incondicionalmente en el primer día después de la operación; usar meloxicam 1 mg/kg SQ q24 h. dar dipirona diluida (0,5 g disuelto en 400 mL de agua potable) a las ratas que muestran síntomas de dolor durante los primeros 3 días.
3. Sacrificar cualquier rata con convulsiones (las convulsiones son causadas por el aumento de la presión intracraneal de edema cerebral o hemorragia cerebral²⁸).

5. puntuación de severidad neurológica³¹

Nota: Este procedimiento lo realizan dos observadores que no participan en el procedimiento quirúrgico; prueban los déficits neurológicos y nivelan los déficits motores en una puntuación acumulada de 0-4³². La evaluación de esta puntuación puede realizarse en diferentes intervalos de tiempo; en esta investigación, se realizó 50 min, 24 h, 7, 15, y 30 días después de la cirugía. A continuación, encontrará los pasos para evaluar el sen. Aunque no es una necesidad en esta situación, esta puntuación es necesaria para determinar el derrame cerebral en roedores con el fin de administrar el tratamiento.

1. Coloca la rata en un piso de cerámica y deja que se mueva libremente durante 1 min.
2. Tire suavemente de la rata hacia atrás por la cola y calificar de la siguiente manera.
   1. Calificar la rata con puntuación 0 para ningún déficit neurológico.
   2. Calificar la rata con la puntuación 1 para la flexión del extremidad anterior.
   3. Calificar la rata con la puntuación 2 para el agarre extremidad anterior débil contralateral.
   4. Calificar la rata con la puntuación 3 para dar vueltas al lado parético cuando se tira por la cola.
   5. Calificar la rata con la puntuación 4 para el círculo espontáneo³².
      Nota: Si se observan más de una de las reacciones, se da preferencia a la acción con una puntuación más alta.

6. determinación del volumen del infarto (examen Hhistológico)

1. Medición del volumen del infarto
   Nota: Realice este procedimiento según lo descrito previamente^33,34. Mida el volumen del infarto cerebral utilizando 2, 3, 5-cloruro de Trifeniltetrazolio (TTC) tinción 24 h después de la reperfusión.
   1. Eutanasia cinco ratas de cada grupo, 24 h después de la última NSS, exponiendo a una sobredosis de isoflurano en una cámara de inducción.
   2. Decapitar a las ratas y aislar rápidamente sus cerebros usando pequeñas tijeras y fórceps.
   3. Lave el cerebro aislado en un 0,9% de solución salina.
   4. Examine los puntos de sangrado en el cerebro para excluir los ratones que sufrieron una hemorragia subaracnoidea en el círculo de Willis.
   5. Coloque cada cerebro en un portaobjetos de vidrio limpio en una compresa de hielo de-20 ° c y luego colóquelo en una nevera de-20 ° c durante 5 minutos para que el cerebro sea más fácil de rebanar.
   6. Tome el tobogán de cristal con el cerebro en él fuera de la nevera-20 ° c, ponerlo de nuevo en la bolsa de hielo-20 ° c, y diseccionar el polo frontal y el cerebelo con cuchilla y fórceps.
   7. Corte las secciones cerebrales horizontalmente en 2 mm de espesor con una cuchilla para producir seis rebanadas.
   8. Prepare una solución 0,05% TTC añadiendo 1,25 g de polvo TTC a 500 mL de solución salina normal antes del sacrificio, transfiera la solución a una placa de 24-Well (1 mL por pozo) cubierta en papel de aluminio y almacénala a 4 ° c.
      Nota: El TTC y el tejido teñido con TTC son sensibles a la luz.
   9. Con fórceps, transfiera las rebanadas cerebrales a la placa de 24-Well que contiene la solución TTC (una rebanada por pozo) y extienda las rodajas en la solución.
   10. Incubar el contenido de la placa a 37 ° c en un baño de agua superficial durante 30 min.
   11. Aspirar la solución TTC de la placa con una pija, lavarla con un fluido de lavado de cerebro e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
   12. Colocar los trozos en el orden en el que fueron cortados en un cristal de laboratorio y examinar los segmentos con un escáner.
   13. Analice el tamaño del infarto como un porcentaje de toda la porción del cerebro, utilizando el software de análisis ImageJ, basado en la identificación visual.
2. Análisis del volumen de infarto³⁵
   1. Cuantificar el volumen de infarto mediante el uso de un software de análisis de imagen estándar (ImageJ) y analizar el volumen cerebral de infarto como un porcentaje de todo el tamaño del cerebro³³.
   2. Coloque las rodajas de cerebro en diapositivas de microscopio de vidrio y escanéelos con un escáner óptico a una alta resolución (1.600 x 1.600 dpi) para un análisis adecuado.
   3. Recorte las imágenes y estandarice la escala para todas las imágenes, utilizando la regla métrica incluida en la imagen escaneada.
   4. Mida el área de la Palio marcada en seis secciones coronales consecutivas de 2 mm utilizando una herramienta de varilla (rastreo) y una selección a mano alzada en el software ImageJ 1.37 v³⁶.
   5. Calcule el volumen de infarto indirecto utilizando la siguiente fórmula³⁷.

7. medición del edema cerebral³⁸

Nota: El edema cerebral se midió 24 h después de la última MCAO.  Eutanasia animales con déficit neurológico severo interferir con la alimentación y/o beber durante al menos tres días, más de 20% pérdida de peso, hemiplejia o convulsiones.

1. Evaluar la magnitud del edema del hemisferio derecho mediante el uso de la suma de las áreas coronalmente cortadas para calcular los volúmenes de los hemisferios derecho e izquierdo en unidades arbitrarias (píxeles).
   Nota: Utilice el software ImageJ 1.37 v para este cálculo, después del escaneo óptico (resolución: 1.600 x 1.600 dpi). Seleccione el área de interés y utilice la función medir en el menú análisis . Se utilizaron macros en nuestra investigación.
2. Expresar el área del edema cerebral como un porcentaje de las áreas estándar en el hemisferio contralateral no afectado.
3. Calcule el grado de hinchazón usando la ecuación desarrollada anteriormente³⁹.

8. paradigmas de comportamiento

1. Realice pruebas conductuales entre los días 30 y 33 después de la cirugía en una habitación cerrada, silenciosa y con control de luz.
2. Asigne a los investigadores ciegos a todos los procedimientos experimentales para grabar en vídeo todas las pruebas de comportamiento con un programa comercialmente disponible.
3. Prueba de preferencia de sucrosa^40,41
   1. Coloque las ratas en jaulas individuales en la misma habitación donde se alojan durante el ciclo oscuro.
   2. Para las próximas 24 h, coloque una botella de 100 mL de solución de sacarosa al 1% (p/v) en cada jaula con la rata a probar y permita la adaptación de la rata.
   3. Después de 24 h, privar a las ratas de alimentos y agua durante 12 h quitando las botellas.
   4. Luego, después de las 12 h, colocar dos botellas en cada jaula durante 4 h, una conteniendo 100 mL de agua del grifo y otra conteniendo 100 mL de solución de sacarosa (1% [w/v]).
   5. Registre la cantidad de solución de sacarosa y el agua consumida por las ratas en mililitros. Calcule la afinidad a la preferencia de sucrosa como sigue.
4. Prueba de natación forzada porsolt⁴²
   Nota: La prueba de natación forzada Porsolt se llevó a cabo como se describe en un protocolo anterior publicado por Zeldetz et al.⁴⁰ y Boyko et al.⁴². El principio de esta prueba establece que, cuando las ratas se ven obligadas a nadar en un área restringida de donde, no pueden escapar, eventualmente se vuelven inmóviles, dejando de intentar escapar del agua^43,44. Esta prueba se llevó a cabo en una habitación diferente durante el ciclo oscuro.
   1. Colocar cada rata en un cilindro de plexiglás vertical (altura: 100 cm; diámetro: 40 cm) conteniendo 80 cm de agua a 25 ° c durante 15 min para habituación.
   2. Sacar la rata y dejar secar durante 15 min en un recinto calentado (32 ° c).
   3. Devuelva la rata a su jaula de inicio (original).
   4. Repita el paso 8.4.1 24 h más tarde, esta vez para la investigación, durante 5 min.
   5. Grabe en vídeo la prueba de 5 minutos y calcule la duración total de la inmovilidad durante ese período.

Resultados

Los hallazgos histológicos (tabla 1) revelaron un volumen de infarto estadísticamente significativo como porcentaje del cerebro total (p < 0,0001) post-Mcao en comparación con animales en el grupo de control de farsa. También se notificó un edema cerebral estadísticamente significativo cuando la evaluación del grupo experimental (p < 0,0003) se puso al lado del otro con la del grupo de control de farsa.

Discusión

Una de las formas en que la técnica MCAO presentada aquí podría considerarse más segura que el modelo original de MCAO se ilustra por el hecho de que el TCE y sus ramas, incluyendo la arteria occipital, la terminal lingual, y la arteria maxilar, no se ven comprometidas al oclusionar el MCA a través de la ICA. El desfase del modelo original de la MCAO del TCE (y sus ramas), al diseccionar distalmente y coagularlos en⁴⁶, causa un deterioro de la masticación, debido a un compromiso con el sumin...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test