Средней мозговой артерии окклюзии техника для стимулирования после инсульта депрессия у крыс

Резюме

Здесь мы представляем протокол, чтобы вызвать депрессию после инсульта у крыс путем окзакудинг средней мозговой артерии через внутреннюю сонную артерию. Мы используем Porsolt вынуждены плавать тест и тест сахарозы предпочтение для подтверждения и оценки индуцированных депрессивных настроений.

Аннотация

Послеинсультные депрессии (СДЧС) является наиболее повторяющимся из всех психиатрических осложнений в результате ишемического инсульта. Большее большинство (около 60%) всех ишемического инсульта пациенты страдают от ОСЧС, расстройство считается ишемический инсульт связанных прекурсоров для увеличения смертности и деградации здоровья. Патофизиология ОСЧС по-прежнему неясна. Для дальнейшего изучения механизма развития и возникновения ОСЧС, а также для того, чтобы выяснить терапию, мы попытались разработать новый протокол, который требует закуцания средней мозговой артерии (МСА) через внутреннюю сонную артерию (ICA) у крыс. Этот протокол описывает модель ОСЧС индуцированных крыс через середину церебральной артерии окклюзии (MЦАО). Также используется в эксперименте Porsolt принудительного плавать тест и тест сахарозы предпочтение, чтобы подтвердить и оценить депрессивное настроение крыс под следствием. Вместо вставки катетера через внешнюю сонную артерию (ЭКА), как это предусмотрено в первоначальной процедуре, эта методика MЦАО имеет мононити, проходящую непосредственно через ICA. Эта методика MЦАО была разработана несколько лет назад и приводит к снижению смертности и изменчивости. Общепризнано, что используемые критерии предпочтительны при отборе биологических моделей. Данные, полученные с помощью этого протокола, показывают, что эта модель МКАО может быть способом индуцирования ОСЧС у крыс и потенциально может привести к пониманию патофизиологии и будущему развитию новых лекарственных средств и других нейропротекторной агентов.

Введение

Инсульт занимает четвертое место в списке смертельных заболеваний в Соединенных Штатах^1,2,3, в то время как он вызывает большинство инвалидности у взрослых в развитых странах⁴; Это делает инсульт ведущим претендентом среди наиболее значимых проблем в области здравоохранения в мире. Нормальная в инсульта-выживших пациентов редко, около 15%-40% от выживания жертв страданий постоянной инвалидности, 20% требующих институционального ухода 3 месяца после инсульта⁵, и около трети 6-месячного пережитком нуждающихся в других, чтобы помочь им жить через каждый день⁶. Инсульт, по сообщениям, также учитывает растущие национальные расходы на здравоохранение⁷. Оценки от Американской ассоциации сердца имеет связанные с инсультом расходы в Соединенных Штатах на более чем $50 000 000 000 в 2010⁸.

Мало того, что инсульт причиной долгосрочных повреждений лиц, но некоторые выжившие, как правило, страдают эмоциональные и поведенческие расстройства, такие как деменция, усталость, тревога, депрессия, бред, и агрессия^{9,10,11 ,12,13,14}. Наиболее повторяющимся психологическим продолжением после инсульта является постинсультный период депрессии (ОСЧС), диагностированный примерно в 40%-50% от пережитших^15,16,17. Вызванная инсультом депрессия приводит к повышению заболеваемости и смертности^{18,19,20,21,22}. Патофизиологии ОСЧС не известно полностью, но это, видимо, вызвано многочисленными факторами и связана с инвалидностью, когнитивные нарушения, и повреждение сайта²³.

Крыса-модель фокусного мозга, созданная mcao, является наиболее распространенной животной моделью инсульта^24,25,26,27. Демонстрируя индукцию ОСЧС у крыс путем окки МСА через ICA, методы, которые сводят к минимуму смертность и изменчивость модели МКАО, заняты²⁸.

Основная цель этого протокола состоит в том, чтобы наметить шаги для индуцирования ОСЧС у крыс путем окобинга МСА через ICA, модифицированную модель МКАО, которая уменьшает смертность и результат изменчивости²⁸. Конкретные цели включают проведение неврологических и гистологических обследований (Определение неврологического балла тяжести [СНБ], объема зоны инфаркта и отека головного мозга) для проверки эффективности MЦАО и использования поведенческих тестов для изучения влияние этой процедуры МЦАО на развитие эмоциональных расстройств, в основном ОСЧС.

протокол

Комитет по уходу за животными университета Бен-Гуриона в Негеве, Израиль одобрил все процедуры лечения и тестирования, используемые в этом протоколе.

1. Подготовка крыс для экспериментальной процедуры

Примечание: Выбрать взрослого самца Спрэг-даули крыс весом 300-350 г.

1. Дом крыс, четыре за клетку, в вивария при температуре 22 °C и 40% влажности, с обратным 12 ч света/темный цикл (горит в 8:00 утра) и неограниченный доступ к пище и воде.
2. Случайным образом назначить крыс на две группы, а именно группа MCAO (n = 24) и Шам группы (n = 19).

2. Подготовка крыс для хирургии

1. Для подготовки крыс для модифицированной процедуры MЦАО, обезболивать каждую крысу в течение 30 минут со смесью изофлуран (4% для индукции, 2% для хирургии, и 1,3% для обслуживания) в 24% кислорода (2 L/мин) в индукционной камере и дать ему возможность дышать спонтанно^{29 ,30}.
   Примечание: Стимулировать рефлекс снятия педали, зажимая кожу между пальцами и/или ног колодки с помощью тупой щипцы. Рассмотрим глубину анестезии адекватной, когда рефлекс исчезает.
2. Поддержание температуры основного тела при температуре 37 ° с с нагревательных пластин.
3. Измерьте температуру тела всех крыс через зонд, помещенный в прямую кишку крысы перед началом хирургической процедуры.
4. Держите температуру тела постоянной (37 ° c) для всех крыс, чтобы свести к минимуму любое гипотермическое воздействие на неврологический исход и любые неврологические травмы.
5. Применить искусственные слезы мазь на оба глаза каждого животного, пока они лежат на подготовительную таблицу.
6. Бритье шеи каждой крысы и дезинфицировать кожу с 70% спирта хлоргексидин (70% спирта и 0,5% хлоргексидин глюконет). Повторите процедуру дезинфекции еще два раза.
7. Обложка крыс стерилизованные хирургические шторы.

3. хирургия (техника МЦАО)

Примечание: Выполните операции, описанные Бойко et al.²⁸ и использовать инструменты, предоставляемые Мак-Гарри et al.²⁹ и uluç et al.³⁰.

1. Выполните разрез брюшной срединной линии и рассекать поверхностную фасцию.
2. Аккуратно выполните резкое и тупое рассечение в пределах трех треугольных мышц (стероидный, дигастральный, и sternomastоидных мышц), чтобы определить сонные артерии (ЭКА, ICA, и общей сонной артерии [ОСО]).
3. Тщательно рассекать и разоблачить право ОСО и ICA.
4. Отделить право ОСО и ICA от блуждающего нерва.
   Примечание: По определению сонных артерий, как это предусмотрено в шаге 3,2, ICA будет признана как половина ветвей КЦА наряду с ЭКА.
5. Вставить катетер (тепло-притупляются или силиконовые покрытием 4-0 нейлона) мононити непосредственно через ICA, ~ 18.5-19 мм от точки бифуркации правой ОСО в круг Уиллис до достижения мягкого сопротивления, чтобы закутывать де МСА.
   Примечание: Тепло-притупляемая нить и силиконовый 4-0 нейлон играют ту же роль и являются наиболее предпочтительными мононитями в последнее время, учитывая, что они обеспечивают лучшую окклюзию, чем обычная Нейлоновая нить^28,30.
6. Галстук 4-0 Шелковый шов вокруг ICA чуть выше правой ОСО (пиопипалатин артерии) бифуркации, чтобы блокировать ICA проксимально к точке вставки нити постоянно и дистальнее к нему временно.
7. Свяжите ICA вокруг интравыпускного потока, чтобы закрепить Шелковый шов, чтобы предотвратить кровотечение.
8. Тема фиктивных эксплуатируемых крыс той же хирургической процедуры, как крысы MЦАО, но вставить нейлоновой нитью вместо²⁸.
   Примечание: Нейлоновые нити, как и кремний с покрытием нейлона, перекрывает ICA, но это не так эффективны, как последний.
9. Закройте рану на шею крысы после закусания МСА, выключите анестезию и поставьте крысу в инкубатор под наблюдением, пока он не проснется.
   Примечание: Потребность в проксимальной перевязки, чтобы оклиде ICA, и что из дополнительных дистальной перевязки, чтобы уменьшить кровотечение вокруг нити и закрепите его на месте. Кроме того, крысы должны проснуться через несколько минут после его рана была закрыта.

4. послеоперационное восстановление

1. Администрирование 5 мл 0,9% физиологического раствора для каждой крысы интраперитально, сразу после операции, чтобы предотвратить обезвоживание.
2. Администрирование обезболивания безоговорочно на первый день после операции; Использование мелоксикама 1 мг/кг кв Q24 h. Дайте разбавленный дипирон (0,5 г растворенного в 400 мл питьевой воды) для крыс показаны симптомы боли в течение первых 3 дней.
3. Жертвоприношение крыс с припадками (судороги вызваны увеличением внутричерепного давления от отека головного мозга или кровоизлияние в мозг²⁸).

5. неврологические серьезность Оценка³¹

Примечание: Эта процедура выполняется двумя наблюдателями, которые не участвуют в хирургическом разбирательстве; они тестируются неврологические дефициты и степени дефицита двигателя на совокупный балл 0-4³². Оценка этого показателя может выполняться в разные промежутки времени; в этом расследовании, было выполнено 50 мин, 24 ч, 7, 15 и 30 дней после операции. Ниже приведены меры по оценке НСС. Хотя это и не является необходимостью в этой ситуации, эта оценка необходима для определения инсульта у грызунов для того, чтобы управлять лечением.

1. Поместите крысу на керамический пол и дайте ему свободно передвигаться в течение 1 мин.
2. Осторожно потяните крысы назад за хвост и оценка следующим образом.
   1. Оценка крысы с счетом 0 не неврологического дефицита.
   2. Оценка крысы с оценкой 1 для передних конечностей сгибания.
   3. Оценка крысы со счетом 2 для контралатеральной слабой хватки передних конечностей.
   4. Оценка крысы с счетом 3 для кружения к парной стороне, когда вытащил на хвост.
   5. Оценка крысы со счетом 4 для спонтанного кружить³².
      Примечание: Если более чем одна из реакций наблюдается, предпочтение отдается действию с более высоким счетом.

6. Определение тома инфаркта (Хгистологический экзамен)

1. Измерение объема инфаркта
   Примечание: Выполните эту процедуру, как описано ранее^33,34. Измерение мозга тома инфаркта с использованием 2, 3, 5-трифенилтетазолиум хлорид (Пт) окрашивание 24 ч после синтеза.
   1. Усыпляйте пять крыс из каждой группы, 24 ч после последней НСС, подвергая их передозировки изофлуран в индукционной камере.
   2. Обезглавить крыс и быстро изолировать их мозги с помощью небольших ножниц и щипцов.
   3. Вымойте изолированные мозги в 0,9% физиологического раствора.
   4. Изучите кровотечения точек на мозги, чтобы исключить мышей, которые подверглись субарахноидальное кровоизлияние в кругу Уиллис.
   5. Поместите каждый мозг на чистую стеклянную горку на-20 °C лед, а затем поместить их в-20 °C холодильник на 5 минут, чтобы сделать мозг легче нарезать.
   6. Возьмите стеклянную горку с мозгом на нем из-20 °C Холодильник, положить его обратно на-20 °C лед, и вскрыть лобной полюс и мозжечок с лезвием и щипцы.
   7. Ломтик мозга разделы горизонтально в 2 мм толщиной с лезвием производить шесть кусков.
   8. Подготовьте 0,05% ТТК решение, добавив 1,25 g порошка ТТК до 500 мл нормального физиологического раствора до жертвы, передача раствора на 24-хорошо пластины (1 мл в колодец) покрыты фольгой, и хранить его на 4 ° c.
      Примечание: ТТК и ткани с пятнами ТТК являются легкими чувствительными.
   9. Использование щипцов, передавать кусочки мозга на 24-хорошо пластины, содержащие решения ТТК (один ломтик на колодец) и растянуть ломтики в растворе.
   10. Инкубировать содержание пластины при температуре 37 ° c в мелкой водяной бане в течение 30 мин.
   11. Аспоте раствор ТТК от пластины с пипеткой, промойте их с промывания мозгов жидкость, и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
   12. Поместите ломтики в порядке, в котором они были сокращены на лабораторном стекле и изучить сегменты с помощью сканера.
   13. Проанализируйте размер инфаркта в процентах от всего фрагмента мозга, используя программное обеспечение для анализа изображений, основанное на визуальной идентификации.
2. Анализ объема инфаркта³⁵
   1. Количественное определение объема инфаркта с помощью стандартного программного обеспечения для анализа изображений (Иимадж) и анализа объема мозга миокарда в процентах от всего размера мозга³³.
   2. Поместите кусочки мозга на слайды из стеклянного микроскопа и сканируйте их с помощью оптического сканера с высоким разрешением (1 600 x 1 600 ДОИ) для адекватного анализа.
   3. Обрезать изображения и стандартизировать шкалу для всех изображений, используя метрическую линейку, включрованную в отсканированный снимок.
   4. Мера области отмечены бледность в шесть последовательных 2 мм корональных разделов с помощью палочки (трассировка) инструмент и от руки отбора на 1.37 v программного обеспечения³⁶.
   5. Рассчитать косвенный объем инфаркта с использованием следующей формулы³⁷.

7. Измерение отека мозга³⁸

Примечание: Отек головного мозга измеряется 24 ч после последнего MЦАО.  Эвтаназия животных с тяжелым неврологическим дефицитом, вмешиваясь в еде и/или питье, по крайней мере три дня, более 20% потеря веса, гемиплегия или судороги.

1. Оцените величину отека правого полушария с помощью суммирования участков, нарезанных в косо, для расчета объемов правого и левого полушарий в произвольных единицах (пикселях).
   Примечание: Используйте программное обеспечение 1.37 v для этого расчета, после оптического сканирования (разрешение: 1 600 x 1 600 ДОИ). Выберите область интереса и используйте функцию измерения из меню анализа . Макросы использовались в нашем расследовании.
2. Выразить отек мозга области в процентах от стандартных областей в не влияет контралатерально полушария.
3. Рассчитать степень отечности с помощью уравнения, разработанного ранее³⁹.

8. поведенческие парадигмы

1. Выполняйте поведенческие тесты между 30 и 33 днями после операции в закрытой, тихой и контролируемой светом комнате.
2. Назначьте следователей ослепленные на все экспериментальные процедуры видеозапись всех поведенческих тестов с коммерчески доступной программой.
3. Тест на предпочтение сахарозы^40,41
   1. Поместите крыс в отдельные клетки в той же комнате, где они размещаются во время темного цикла.
   2. В течение следующих 24 ч, поместите одну бутылку 100 мл 1% (w/v) раствора сахарозы в каждой клетке с крысой, чтобы быть проверены и позволяют адаптации крысы.
   3. После 24 ч, лишить крыс пищи и воды для 12 ч, удалив бутылки.
   4. Затем после 12 ч, поместите две бутылки в каждой клетке для 4 ч, один из которых содержит 100 мл водопроводной воды и другой, содержащий 100 мл раствора сахарозы (1% [w/v]).
   5. Запишите количество раствора сахарозы и воды, потребляемой крыс в миллилитрах. Вычислить близость к предпочтению сахарозы следующим образом.
4. Porsolt вынуждены плавать тест⁴²
   Примечание: Испытание на купание в Porsolt проводилось как описано в предыдущем протоколе, опубликованном Зельдетзом et al.⁴⁰ и Бойко и др.⁴². Принцип этого испытания гласит, что, когда крысы вынуждены плавать в запретной зоне, откуда, они не могут убежать, они в конечном итоге становятся неподвижными, прекратив любые попытки избежать воды^43,44. Этот тест был проведен в другом помещении во время темного цикла.
   1. Поместите каждую крысу в вертикальный цилиндр из оргстекла (высота: 100 см; диаметр: 40 см), содержащий 80 см воды при температуре 25 °C в течение 15 минут для привыкания.
   2. Возьмите крыс и дайте ему высохнуть в течение 15 минут в отапливаемом корпусе (32 ° c).
   3. Верните крысу к ее домашней (оригинальной) клетке.
   4. Повторите шаг 8.4.1 24 ч позже, на этот раз для расследования, в течение 5 минут.
   5. Видеозапись 5 мин тест и рассчитать общую продолжительность неподвижности в течение этого периода.

Результаты

Гистологические находки (Таблица 1) выявили статистически значимый объем инфаркта в процентах от общего мозга (p < 0,0001) после mцао по сравнению с животными в группе управления фиктивным. Также сообщалось, был статистически значимый отек головного мозга, ко?...

Обсуждение

Один из способов, с помощью которого представленная здесь методика МКАО может считаться более безопасным, чем первоначальная модель МЦАО, иллюстрируется тем фактом, что ЭКА и ее филиалы, включая затылочную артерию, терминал на языках и верхнечелюстной артерии, не находятся под угрозой ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test