Eine mittelzerebrale Arterienokklusionstechnik zur induzierung einer Depression im Raten nach dem Schlaganfall

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Depressionen bei Ratten nach dem Schlaganfall zu induzieren, indem wir die mittlere zerebrale Arterie über die innere Carotid-Arterie ausschließen. Wir verwenden den Porsolt-erzwungenen Schwimmtest und den Saccharose-Präferenztest, um induzierte depressive Stimmungen zu bestätigen und zu bewerten.

Zusammenfassung

Die poststämtliche Depression (PSD) ist die häufigste aller psychiatrischen Komplikationen, die durch einen ischämischen Schlaganfall entstehen. Größere Mehrheit (ca. 60%) Von allen ischämischen Schlaganfallpatienten leiden an PSD, einer Erkrankung, die als ischämische Schlaganfall-bedingte Vorstufe für einen erhöhten Tod und eine Verschlechterung der Gesundheit angesehen wird. Die Pathophysiologie von PSD ist noch unklar. Um den Entwicklungs-und Vorkommen von PSD weiter zu untersuchen und eine Therapie zu finden, haben wir versucht, ein neues Protokoll zu entwickeln, das das Vertuschen der mittleren zerebralen Arterie (MCA) über die interne Carotid-Arterie (ICA) bei Ratten erfordert. Dieses Protokoll beschreibt ein Modell der PSD, das bei Ratten durch die mittlere zerebrale Arterienverschluss (MCAO) induziert wird. Im Experiment werden auch der Porsolt-Zwangstest und der Saccharose-Präferenztest eingesetzt, um die depressive Stimmung der untersuchten Ratten zu bestätigen und zu bewerten. Anstatt den Katheter durch die äußere Carotid-Arterie (ECA) einzulegen, wie es für das ursprüngliche Verfahren vorgesehen ist, hat diese MCAO-Technik das Monofilament direkt durch die ICA geleitet. Diese MCAO-Technik wurde vor einigen Jahren entwickelt und führt zu einer Verringerung der Sterblichkeit und Variabilität. Es ist allgemein anerkannt, dass die verwendeten Kriterien bei der Auswahl biologischer Modelle bevorzugt werden. Die Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen werden, zeigen, dass dieses MCAO-Modell eine Möglichkeit sein könnte, PSD bei Ratten zu induzieren und potenziell zum Verständnis der Pathophysiologie und der zukünftigen Entwicklung neuer Medikamente und anderer neuroprotektiver Wirkstoffe führen könnte.

Einleitung

Schlaganfall steht auf der Liste der todbeweiskundierenden Krankheiten inden Vereinigten Staaten von 1^,2^{, 3 anvierter}Stelle, während er die meisten Behinderungen bei Erwachsenen in den Industrieländern^{verursacht 4;} Dies macht Schlaganfall zu einem führenden Anwärter unter den wichtigsten Gesundheitsproblemen der Welt. Die Normalität bei umschlagsüberlebenden Patienten ist selten, da etwa 15%-40% der Überlebensopfer unter einer dauerhaften Behinderung leiden, 20% eine institutionelle Betreuung 3Monate nach Schlaganfall 5 erfordern und etwa ein Drittel der sechsmonatigen Überlebenden andere benötigen, um ihnen zu helfen, zu leben. Durch jeden Tag⁶. Schlaganfall soll auch für die steigenden nationalen Gesundheitsausgaben^{7 verantwortlich}sein. Schätzungen der American Heart Association hat die fallbedingten Kosten in den Vereinigten Staaten bei über 50 Milliarden Dollar im^{Jahr 2010 8}.

Schlaganfall verursacht nicht nur langfristige Schäden, sondern einige Überlebende neigen dazu, emotionale und Verhaltensstörungen zu erleiden, wie Demenz, Müdigkeit, Angst, Depression, Delirium und Aggression^9,10^,11 ^{,12,13, 14}. Die wiederkehrende psychologische Fortsetzung nach einem Schlaganfall ist die nach einem Schlaganfall diagnostizierte Depression (PSD), die in etwa40%-50% der Überlebenden^{15,16, 17diagnostiziert}wird. Schlaganfall induzierte Depressionen führen zu erhöhter Morbidität und Mortalität¹⁸,¹⁹,^{20,21, 22.} Die Pathophysiologie von PSD ist nicht vollständig bekannt, aber sie wird offenbar durch mehrere Faktoren verursacht und ist mit Behinderung, kognitiven Beeinträchtigungen und Läsionenan Ort 23 verbunden.

Das von MCAO geschaffene Rattenmodell der fokalen Hirnischämie ist das am weitesten verbreitete Tiermodell des Schlaganfalls 24^{,25, 26,27.} Bei der Demonstration der Einführung von PSD in Ratten durch den Verschluss des MCA über die ICA werden^Technikeneingesetzt, die Sterblichkeit und Variabilität im MCAO-Modell minimieren.

Das primäre Ziel dieses Protokolls ist es, die Schritte zur Anregung von PSD in Ratten zu skizzieren, indem man den MCA über die ICA, ein modifiziertes MCAO-Modell, ausschließt, das die Sterblichkeit und das Ergebnis der Variabilität 28 reduziert. Zu den spezifischen Zielen gehören die Durchführung neurologischer und histologischer Untersuchungen (Bestimmung der neurologischen Schwerpunktzahl [NSS], des Volumens der Infarktzone und des Gehirnödems), um die Wirksamkeit von MCAO zu überprüfen und Verhaltenstests zu verwenden, um die Einfluss dieses MCAO-Verfahrens auf die Entwicklung von emotionalen Störungen, vor allem PSD.

Protokoll

Der Tierpflegeausschuss der Ben-Gurion-Universität des Negev, Israel, genehmigte alle in diesem Protokoll verwendeten Behandlungs-und Testverfahren.

1. Vorbereitung der Ratten auf die Versuchsvorverfahrengestellung

NOTE: Wählen Sie erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 300-350 g.

1. Die Ratten, vier pro Käfig, in einem Vivarium bei 22 ° C und 40% Luftfeuchtigkeit, mit einem umgekehrten 12 h Licht-/Dunkelzyklus (Licht ab 8:00 Uhr) und unbegrenztem Zugang zu Nahrung und Wasser.
2. Zufällig weisen Sie die Ratten zwei Gruppen zu, nämlich einer MCAO-Gruppe (N = 24) und einer Scham-Gruppe (N = 19).

2. Vorbereitung der Ratten für die Chirurgie

1. Um die Ratten auf das modifizierte MCAO-Verfahren vorzubereiten, jede Ratte für 30 Minuten mit einer Mischung aus Isoofluran (4% für Induktion, 2% für die Operation und 1,3% für die Wartung) in 24% Sauerstoff (2 L/min) in einer Induktionskammer anästhesieren und spontan atmen lassen 29 ^,30.
   NOTE: Stimulieren Sie den Rückzugs-Reflex der Pedal, indem Sie die Haut mit stumpfen Zangen zwischen den Zehen und den Zehenpolstern kneifen. Betrachten Sie die Tiefe der Anästhesie ausreichend, wenn der Reflex verschwindet.
2. Halten Sie die Kerntemperatur bei 37 ° C mit einer Heizplatte.
3. Messen Sie die Körpertemperatur aller Ratten durch eine Sonde, die im Rektum der Ratte platziert wird, bevor Sie den chirurgischen Eingriff beginnen.
4. Halten Sie die Körpertemperatur konstant (37 ° C) für alle Ratten, um jede hypothermische Wirkung auf das neurologische Ergebnis und jede neurologische Verletzung zu minimieren.
5. Tragen Sie künstliche Risse Salbe auf die Augen jedes Tieres auf, während sie auf dem Vortisch liegen.
6. Rüben Sie den Hals jeder Ratte und desinfizieren Sie die Haut mit 70% alkoholhaltigem Chlorhexidin (70% Alkohol und 0,5% Chlorhexidin Gluconat). Wiederholen Sie den Desinfektionsschritt noch zwei Mal.
7. Bedecken Sie die Ratten mit sterilisierten chirurgischen Vorhängen.

3. Chirurgie (die MCAO-Technik)

NOTE: Führen Sie eine Operation durch, wie sie von Boyko et al.²⁸ beschrieben wurde, und verwenden Sie die Instrumente von McGarry et al. 29und Uluç u.a.³⁰ .

1. Führen Sie einen ventralen Mittellinie und zerlegen Sie die oberflächliche Faszie.
2. Führen Sie vorsichtig eine scharfe und stumpfe Trennung innerhalb der drei dreieckigen Muskeln (Sternohyoid, Digastric und sternomastoide Muskel) durch, um die Carotid-Arterien (ECA, ICA und die gemeinsame Carotid-Arterie [CCA]) zu identifizieren.
3. Die richtige CCA und die ICA sorgfältig zerlegen und aussetzen.
4. Trennen Sie die rechte CCA und ICA vom Vagusnerv.
   NOTE: Bei der Identifizierung der Carotid-Arterien, wie sie in Schritt 3.2 festgelegt ist, würde die ICA als die Hälfte der CCA-Filialen neben der ECA anerkannt.
5. Legen Sie einen Katheter (hitzebeöntes oder silikonbeschichtetes 4-0 Nylon) direkt durch die ICA ein, ~ 18,5 -19 mm vom Verzweifungspunkt des rechten CCA in den Kreis von Willis bis zu einem leichten Widerstand, um MCA zu verdecken.
   NOTE: Das wärmebeflachte Filament und das silikonbeschichtete 4-0 Nylon spielen die gleiche Rolle und sind in jüngster Zeit die bevorzugten Monofilamente, da sie eine bessere Verschluss bieten als der schlichte Nylonfaden28,30^.
6. Eine 4-0-Seidense um die ICA direkt über der rechten CCA (Pterygopalatin-Arterie) zu binden, um die ICA in der Nähe des Filamenteinsatzes dauerhaft zu blockieren und zeitweise zu verstreuten.
7. Die ICA um den intraluminalen Faden binden, um die Seidennaht zu befestigen, um Blutungen zu verhindern.
8. Unterziehen Sie die Schamratten dem gleichen chirurgischen Eingriff wie die MCAO-Ratten, legen Sie aber stattdessen^einenNylonfaden ein.
   NOTE: Der Nylonfaden, wie das siliziumbeschichtete Nylon, verdeckt die ICA, ist aber nicht so effektiv wie die zweite.
9. Schließen Sie die Wunde am Hals der Ratte, nachdem Sie den MCA geschlossen haben, schalten Sie die Anästhesie aus und legen Sie die Ratte in einen Inkubator unter Beobachtung, bis sie aufwacht.
   NOTE: Die Notwendigkeit der proximalen Ligation besteht darin, die ICA zu verdecken, und die der zusätzlichen distalen Ligation besteht darin, die Blutungen um das Filament zu reduzieren und an Ort und Stelle zu sichern. Auch sollte die Ratte wenige Minuten nach der Wunde aufwachen.

4. Postoperative Erholung

1. Amtsträger 5 mL von 0,9% Salzlösung für jede Ratte intraperitoneal, unmittelbar nach der Operation, um Austrocknung zu verhindern.
2. Administer Schmerzmittel bedingungslos am ersten Tag nach der Operation; Verwenden Sie Meloxicam 1 mg/kg SQ q24 h. Geben Sie verdünnte Dipyrone (0,5 g in 400 ml Trinkwasser aufgelöst) an Ratten, die Symptome von Schmerzen während der ersten 3 Tage zeigen.
3. Opfer von Ratten mit Anfällen (Anfälle werden durch den erhöhten intrakraniellen Druck durch Gehirnödem oder Gehirnblutung 28 verursacht).

5. Neurologische Severity-Score³¹

NOTE: Diese Prozedur wird von zwei Beobachtern durchgeführt, die nicht an dem chirurgischen Verfahren teilnehmen; Sie testen die neurologischen Defizite und die Gradmotordefizite auf eine Gesamtpunktzahl von 0-4^32. Die Auswertung dieser Punktzahl kann in unterschiedlichen Zeitabständen erfolgen; In dieser Untersuchung wurde es 50 Minuten, 24 Stunden, 7, 15 und 30 Tage nach der Operation durchgeführt. Hier finden Sie die Schritte zur Bewertung der NSS. Obwohl es in dieser Situation keine Notwendigkeit ist, ist diese Punktzahl erforderlich, um Schlaganfall bei Nagetieren zu ermitteln, um die Behandlung zu verabreichen.

1. Legen Sie die Ratte auf einen Keramikboden und lassen Sie sie sich für 1 Minute frei bewegen.
2. Ziehen Sie die Ratte vorsichtig am Schwanz nach hinten und sind sie wie folgt sorgenvoll.
   1. Sorde die Ratte mit der Punktzahl 0 für kein neurologisches Defizit.
   2. Grade die Ratte mit der Punktzahl 1 für Vorderbflexion.
   3. Sorde die Ratte mit der Punktzahl 2 für kontralateral-schwachen Vorderglied.
   4. Sorde die Ratte mit der Punktzahl 3 für die Zirkulation auf der paretischen Seite, wenn sie durch den Schwanz gezogen wird.
   5. Sorde die Ratte mit der Punktzahl 4 fürspontanes Kreisen 32.
      NOTE: Wenn mehr als eine der Reaktionen beobachtet wird, wird die Aktion mit einer höheren Punktzahl bevorzugt.

6. Bestimmung des Infarct-Volumens (Hhistologische Untersuchung)

1. Messung des Infarktvolumens
   NOTE: Führen Sie dieses Verfahren, wie zuvor^beschrieben33^,34. Messen Sie das Volumen des Gehirns mit 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC), das sich 24 Stunden nach der Reperfusion verfärbt.
   1. Ethanisieren Sie fünf Ratten aus jeder Gruppe, 24 Stunden nach der letzten NSS, indem sie in einer Induktionskammer einer Isofluran-Überdosis ausgesetzt werden.
   2. Die Ratten verdassen und ihre Gehirne mit einer kleinen Schere und Zange schnell isolieren.
   3. Die isolierten Gehirne in 0,9% Salz waschen.
   4. Prüfen Sie Blutungen auf dem Gehirn, um die Mäuse, die subarachnoide Blutungen im Kreis Willis unterzogen ausschließen.
   5. Legen Sie jedes Gehirn auf eine saubere Glasscheibe auf eine-20 ° C-Eispackung und legen Sie sie dann 5 Minuten lang in einen-20 ° C-Kühlschrank, um das Gehirn leichter zu schneiden.
   6. Nehmen Sie die Glasscheibe mit dem Gehirn auf sie aus dem-20 ° C-Kühlschrank, legen Sie sie wieder auf die-20 ° C Eispackung und zerlegen Sie den Frontalpol und das Kleinhirn mit Klinge und Zangen.
   7. Schneiden Sie das Gehirn horizontal in 2 mm Dicke mit einer Klinge, um sechs Scheiben zu produzieren.
   8. Bereiten Sie eine 0,05% TTC-Lösung vor, indem Sie 1,25 g TTC-Pulver zu 500 ml normaler Salzlösung vor dem Opfer hinzufügen, übertragen Sie die Lösung auf eine 24-Brunnen-Platte (1 ml pro Brunnen), die mit Folie bedeckt ist, und speichern Sie sie bei 4 ° C.
      NOTE: Der mit TTC befleckte und gebeizte Gewebebegewebe ist lichtempfindlich.
   9. Mit Zangen die Hirnscheiben auf die 24-Well-Platte mit der TTC-Lösung (eine Scheibe pro Brunnen) übertragen und die Scheiben in der Lösung ausstrecken.
   10. Den Plattengehalt bei 37 ° C in einem flachen Wasserbad 30 min anbraten.
   11. Die TTC-Lösung vom Teller aus mit einer Pipette aufsaugen, mit einer Gehirnwäsche waschen und bei Raumtemperatur 30 min inkubieren.
   12. Legen Sie die Scheiben in der Reihenfolge, in der sie geschnitten wurden, auf ein Laborglas und untersuchen Sie die Segmente mit einem Scanner.
   13. Analysieren Sie die Infarktgröße als Prozentsatz der gesamten Gehirnscheibe, mit Hilfe von ImageJ-Analysesoftware, die auf visueller Identifizierung basiert.
2. Analyse des Infarktvolumens 35
   1. Quantifizieren Sie das Infarktvolumen mit Hilfe einer Standard-Bildanalyse-Software (ImageJ) und analysieren Sie das Infarkt-Hirnvolumen als Prozentsatz^dergesamten Gehirngröße 33.
   2. Legen Sie die Hirnscheiben auf Glasmikroskop-Dias und scannen Sie sie mit einem optischen Scanner mit einer hohen Auflösung (1.600 x 1.600 dpi) für eine adäquate Analyse.
   3. Die Bilder aussuchen und die Skala für alle Bilder standardisieren, wobei der metrische Lineal verwendet wird, der im gescannten Bild enthalten ist.
   4. Messen Sie den Bereich des markierten Pallors in sechs aufeinanderfolgenden 2 mm Koronalen Abschnitten mit einem Wandwerkzeug (Tracing) und Freehand-Auswahl auf der ImageJ1.37v-Software 36.
   5. Berechnen Sie das indirekte Infarktvolumen mit der folgenden Formel³⁷.

7. Messung der Hirnödema³⁸

NOTE: Hirnödem wurde 24 Stunden nach dem letzten MCAO gemessen.  Euthanierung von Tieren mit starkem neurologischem Defizit, die mindestens drei Tage lang beim Essen und Trinken stören, mehr als 20% Gewichtsverlust, Hemiplegie oder Anfälle.

1. Bewerten Sie die Größe des Ödems der rechten Hemisphäre, indem Sie die Zusammenstellung der teilweise in Scheiben geschnittenen Flächen verwenden, um die Volumina der rechten und linken Hemisphäre in beliebigen Einheiten (Pixel) zu berechnen.
   NOTE: Verwenden Sie die ImageJ 1.37v-Software für diese Berechnung, nach dem optischen Scannen (Auflösung: 1.600 x 1.600 dpi). Wählen Sie den Interessenbereich aus und nutzen Sie die Messfunktion aus dem Analysemenü. Makros wurden bei unserer Untersuchung verwendet.
2. Drücken Sie den Bereich des Gehirns in der Regel Ödeme als Prozentsatz der Standardbereiche in der nicht betroffenen kontralateralen Hemisphäre.
3. Berechnen Sie den Schwellungsgrad mit der zuvor entwickelten Gleichung 39.

8. Verhaltensmuster

1. Führen Sie Verhaltenstests zwischen den Tagen 30 und 33 nach der Operation in einem geschlossenen, ruhigen und lichtgesteuerten Raum durch.
2. Weisen Sie den Ermittlern, die alle experimentellen Verfahren geblendet haben, alle Verhaltenstests mit einem kommerziell erhältlichen Programm auf Video zu versenden.
3. Sukrose-Präferenztest^40,41
   1. Platzieren Sie die Ratten in einzelne Käfige in den gleichen Raum wie dort, wo sie während des dunklen Zyklus untergebracht sind.
   2. Für die nächsten 24 Stunden, legen Sie eine Flasche von 100 ml von 1% (w/v) Saccharose Lösung in jedem Käfig mit der Ratte getestet werden und ermöglichen für die Anpassung der Ratte.
   3. Nach 24 Uhr die Ratten 12 Stunden lang Nahrung und Wasser berauben, indem sie die Flaschen entfernen.
   4. Dann nach 12 Uhr zwei Flaschen in jeden Käfig für 4 Stunden legen, eine mit 100 ml Leitungswasser und eine andere mit 100 ml Saccharose-Lösung (1% [w/v]).
   5. Notieren Sie die Menge an Saccharose Lösung und Wasser, das von Ratten in Millilitern verbraucht wird. Berechnen Sie die Affinität zur Saccharose wie folgt.
4. Porsolt erzwang Schwimmprüfung⁴²
   NOTE: Der Porsolt-Zwangstest wurde durchgeführt, wie in einem früheren Protokoll beschrieben, das von Zeldetz et al^{. 40} und Boyko et al.⁴²veröffentlicht wurde. Das Prinzip dieses Tests besagt, dass, wenn Ratten gezwungen sind, in einem begrenzten Gebiet zu schwimmen, von wo aus sie nicht entkommen können, sie schließlich unbeweglich werden und jegliche Versuche, demWasser 43^,44zu entkommen, einstellen. Dieser Test wurde während des dunklen Zyklus in einem anderen Raum durchgeführt.
   1. Legen Sie jede Ratte in einen vertikalen Plexiglaszylinder (Höhe: 100 cm; Durchmesser: 40 cm) mit 80 cm Wasser bei 25 ° C für 15 min für Gewöhnung.
   2. Die Ratte herausnehmen und in einem beheizten Gehäuse (32 ° C) 15 Minuten trocknen lassen.
   3. Bringe die Ratte in ihren (ursprünglichen) Käfig zurück.
   4. Wiederholungsschritt 8.4.1 24 Stunden später, diesmal für die Untersuchung, für 5 min.
   5. Videotape den 5-minütigen Test und berechnen die Gesamtdauer der Unbeweglichkeit während dieses Zeitraums.

Ergebnisse

Histologische Befunde (Tabelle 1) ergaben im Vergleich zu Tieren der Schamkontrollgruppe ein statistisch signifikantes Infarktvolumen als Prozentsatz des gesamten Gehirns (p < 0.0001) nach-MCAO. Auch wurde ein statistisch signifikantes Hirnödem berichtet, als die Auswertung aus der Versuchsgruppe (p < 0.0003) mit der der Schamkontrollgruppe nebeneinander gestellt wurde.

Die in Tabelle ...

Diskussion

Eine der Möglichkeiten, wie die hier präsentierte MCAO-Technik als sicherer angesehen werden könnte als das ursprüngliche MCAO-Modell, zeigt sich daran, dass die ECA und ihre Zweige, einschließlich der Okzidentarterie, der Terminallinguale und der Kiefernarterie, nicht beeinträchtigt werden. Beim Verschluss des MCA über die ICA. Der Ausgesatz des ECA (und seiner Zweige) durch den ursprünglichen MCAO-Modell, durch die distale Trennung und Gerinnung von⁴⁶, verursacht eine beeinträchtigte Ma...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test