עורק מוחין בינוני טכניקת הסגר לגרימת שלאחר שבץ דיכאון בחולדות

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום דיכאון לאחר שבץ בחולדות על ידי הסגר את עורק המוח האמצעי באמצעות עורק הראש הפנימי. אנו משתמשים במבחן Porsolt שחייה כפויה במבחן העדפה הסוכות כדי לאשר ולהעריך מצבי דיכאון המושרה.

Abstract

לאחר שבץ דיכאון (PSD) הוא חוזר ונשנה ביותר של כל הסיבוכים הפסיכיאטריים כתוצאה משבץ איסכמי. רוב גדול (כ 60%) של כל המטופלים שבץ מוחי סובלים PSD, הפרעה שנחשבה להיות מבשר איסכמי שבץ הקשורים למוות מוגבר השפלה בריאות. הפתופסיולוגיה של PSD עדיין מעורפל. כדי ללמוד את המנגנון של פיתוח והתרחשות של PSD עוד, וכיצד למצוא טיפול, ניסינו לפתח פרוטוקול חדש שדורש חסימה של עורק המוח האמצעי (MCA) באמצעות עורק הראש הפנימי (ICA) בחולדות. פרוטוקול זה מתאר מודל של PSD המושרה חולדות באמצעות העורק האמצעי מוחין הסגר (MCAO). משמש גם בניסוי הם מבחן לשחות כפויה Porsolt ואת העדפת בדיקת סוכות כדי לאשר ולהעריך את מצב הרוח דיכאון של חולדות תחת חקירה. במקום להוסיף את הקטטר דרך העורק הראשי החיצוני (ECA), כאמור עבור ההליך המקורי, זו טכניקה MCAO יש המונופינט עובר ישירות דרך ה-ICA. טכניקת MCAO זו פותחה לפני מספר שנים ומובילה לירידה בתמותה ובשונות. מקובל בדרך כלל כי הקריטריונים המשמשים מעדיפים בבחירת מודלים ביולוגיים. הנתונים שהושגו עם פרוטוקול זה מראים כי מודל זה של MCAO יכול להיות דרך לגרום PSD בחולדות והוא עלול להוביל להבנת הפתופסולוגיה והתפתחות עתידית של תרופות חדשות וסוכנים עצביים אחרים.

Introduction

השבץ הוא הרביעי ברשימת מחלות מבצע המוות בארצות הברית^1,2,3, בעוד היא גורמת לרוב המוגבלות אצל מבוגרים במדינות מפותחות⁴; זה הופך שבץ מתמודד מוביל בין בעיות הבריאות המשמעותית ביותר בעולם. נורמליות בחולים ששרדו הוא נדיר, עם כ 15%-40% של קורבנות הישרדות סבל נכות קבוע, 20% הדורשים טיפול מוסדי 3 חודשים לאחר הופעת שבץ⁵, וכשליש של 6 חודשים שורדים הזקוקים לאחרים כדי לעזור להם לחיות כל יום⁶. קו הדיווחים גם לחשבון את ההוצאות הלאומיות בריאות לאומית⁷. האומדנים מאיגוד הלב האמריקני יש עלויות הקשורות לשבץ בארצות הברית ברחבי $50,000,000,000 ב 2010⁸.

לא רק שבץ לגרום נזק לטווח ארוך של אנשים, אבל כמה ניצולים נוטים לסבול הפרעות רגשיות והתנהגותיות, כגון דמנציה, עייפות, חרדה, דיכאון, הזיות, ותוקפנות^{9,10,11 ,12,13,14}. ההמשך הפסיכולוגי החוזרות ביותר לאחר שבץ הוא דיכאון לאחר שבץ (PSD), אובחן כ 40%-50% של שרידות^15,16,17. דיכאון בהשפעת שבץ תוצאות התחלואה ותמותה מוגברת^{18,19,20,21,22}. הפתופסיולוגיה של PSD הוא לא ידוע לחלוטין, אבל זה נגרם כנראה על ידי גורמים מרובים והוא מקושר נכות, ליקוי קוגניטיבי, ואת הנגע באתר²³.

המודל חולדה של איסכמיה המוח מוקד, נוצר על ידי mcao, הוא הדגם הנפוץ ביותר בעלי חיים של שבץ^24,25,26,27. ב להפגין את אינדוקציה של PSD בחולדות על ידי הסגר את MCA באמצעות ICA, טכניקות למזער את התמותה והשונות במודל MCAO מועסקים²⁸.

המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לתאר את הצעדים לגרימת PSD בחולדות על ידי הסגר את MCA דרך ה-ICA, מודל שונה של MCAO, אשר מפחית את התמותה ואת תוצאת השונות²⁸. מטרות ספציפיות כוללות ביצוע בדיקות נוירולוגיות היסטולוגית (קביעת הציון החומרה הנוירולוגית [nss], נפח של אזור הלב, בצקת במוח) כדי לאמת את היעילות של mcao ושימוש במבחני התנהגות כדי לבחון את ה השפעה זו הליך MCAO על פיתוח הפרעות רגשיות, בעיקר PSD.

Protocol

הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת בן-גוריון בנגב אישרה את כל תהליכי הטיפול והבדיקות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת חולדות להליך הניסיוני

הערה: בחר חולדות בוגרים גברי-דאולי במשקל 300-350 g.

1. הבית החולדות, ארבעה לכלוב, ב יבר ב 22 ° צ' ו 40% לחות, עם היפוך 12 h מחזור אור/כהה (אורות כבוי ב 8:00 בבוקר) וגישה בלתי מוגבלת למזון ומים.
2. באופן אקראי להקצות את החולדות לשתי קבוצות, כלומר קבוצת MCAO (n = 24) ו קבוצת שאם (n = 19).

2. הכנת חולדות לניתוח

1. כדי להכין את החולדות עבור הליך שונה MCAO, להחטיף כל עכברוש עבור 30 דקות עם תערובת של isofלינה (4% עבור אינדוקציה, 2% עבור ניתוח, ו 1.3% עבור תחזוקה) ב 24% חמצן (2 L/min) בחדר אינדוקציה ולאפשר לו לנשום ספונטנית^{29 ,30}.
   הערה: לעורר רפלקס נסיגה דוושה ידי צובט את העור בין הבהונות ו/או רפידות הבוהן באמצעות מלקחיים קהה. בהתחשב בעומק ההרדמה. הנאותה כשהרפלקס נעלם
2. שמרו על טמפרטורת הגוף המרכזית ב-37 ° c עם צלחת חימום.
3. למדוד את טמפרטורת הגוף של כל החולדות באמצעות בדיקה ממוקם הרקטום של החולדה לפני תחילת ההליך כירורגי.
4. שמור על טמפרטורת הגוף קבוע (37 ° c) עבור כל החולדות כדי למזער את ההשפעה ההיפותרמיה על התוצאה הנוירולוגית ואת כל הפציעה הנוירולוגית.
5. החלת משחה של דמעות מלאכותיות לעיני כל חיה בזמן שהן שוכבות על שולחן ההכנה.
6. לגלח את הצוואר של כל חולדה ולחטא את העור עם 70% כלורקסאינין של אלכוהול (70% אלכוהול ו 0.5% כלורהקאינין gluconate). חזור על שלב החיטוי. עוד פעמיים
7. כסו את החולדות. עם וילונות כירורגיים מעוקרים

3. כירורגיה (טכניקת MCAO)

הערה: לבצע ניתוח כפי שמתואר על ידי Boyko et al.²⁸ ולהשתמש במכשירים שסופקו על ידי mcgarry ואח '²⁹ ו uluç ואח '³⁰.

1. לבצע חתך באמצע קו ביניים ולנתח את fascia שטחי.
2. בזהירות לבצע ניתוח חד וקהה בתוך שלושת המשולש בצורת שריר (הסטרנושון, הדיקיבה, ואת שריר sternomastoid) כדי לזהות את העורקים העורק (ECA, ICA, ואת עורק הראש המשותף [אמנות עכשווית]).
3. בזהירות לנתח ולחשוף את אמנות עכשווית הנכון ואת ה-ICA.
4. הפרד את האמנות עכשווית הימנית. מהעצב התועה
   הערה: לאחר זיהוי העורקים הראשיים כאמור בשלב 3.2, ה-ICA יזוהה כמחצית מסניפי אמנות עכשווית לצד ה-ECA.
5. הכנס צנתר (חום-מצופה מכוסה סיליקון 4-0 ניילון) מונופינט ישירות דרך ה-ICA, ~ 29.8-19 מ"מ מנקודת הביקטיון של הזכות אמנות עכשווית לתוך מעגל של ויליס עד שהגיע התנגדות קלה, כדי לסגר de MCA.
   הערה: את החוט החום ואת הסיליקון מצופה 4-0 ניילון לשחק את אותו תפקיד והוא הרבה יותר מונופיל בזמנים האחרונים, בהתחשב בכך שהם מספקים חסימה טובה יותר חוט ניילון רגיל^28,30.
6. עניבה 4-0 תפר משי סביב ה-ICA בדיוק מעל אמנות עכשווית הימני (עורק מקומי) ביפוריון כדי לחסום את הבית הראשי של ה-ICA לנקודת ההכנסה באופן קבוע ומלא ממנו זמנית.
7. לקשור את ה-ICA סביב פתיל intraluminal כדי להדק את תפר המשי כדי למנוע דימום.
8. הנושא חולדות המופעלות המזויף לאותו הליך כירורגי כמו חולדות MCAO אבל להוסיף חוט ניילון במקום²⁸.
   הערה: חוט ניילון, כמו ניילון מצופה סיליקון, סגר את ה-ICA, אבל זה לא יעיל כמו האחרון.
9. סגרו את הפצע על צווארו של החולדה לאחר שסגרו את הMCA, כבו את ההרדמה, והניחו את החולדה בחממה תחת השגחה עד שהיא מתעוררת.
   הערה: הצורך בתשלום הבית הוא לסגור את ה-ICA, ולצמצם את הדימום מסביב לחוט הלהט ולאבטח אותו במקומו. כמו כן, החולדה אמורה להתעורר כמה דקות לאחר שהפצע נסגר.

4. לאחר ניתוח התאוששות

1. ניהול 5 מ ל של 0.9% תמיסת מלח לכל intraperitoneally חולדה, מיד לאחר הניתוח, כדי למנוע התייבשות.
2. לנהל כאבים ללא תנאי ביום הראשון שלאחר הניתוח; השתמש מלוקסיאם 1 מ"ג/ק"ג SQ q24 h לתת מדולל dipyrone (0.5 גרם מומס 400 mL של מי שתייה) לחולדות מראה סימפטומים של כאב במהלך 3 הימים הראשונים.
3. להקריב כל חולדות עם התקפים (התקפים נגרמים על ידי לחץ תוך גולגולתי מוגברת מבצקת מוחין או דימום מוחי²⁸).

5. סיכון נוירולוגי ציון³¹

הערה: הליך זה מבוצע על ידי שני משקיפים שאינם משתתפים בהליכים כירורגיים; הם בודקים את החסרונות הנוירולוגיים וכיתות מנוע בציון מצטבר של 0-4³². הערכה של ציון זה ניתן לבצע במרווחי זמן שונים; בחקירה זו, היא בוצעה 50 דקות, 24 שעות, 7, 15, ו 30 ימים לאחר הניתוח. חפש מתחת לשלבים להערכת ה-NSS. למרות שאין צורך במצב זה, ציון זה נדרש כדי לוודא שבץ במכרסמים כדי לנהל את הטיפול.

1. מניחים את העכברוש על רצפת קרמיקה ומאפשרים לו לנוע בחופשיות במשך 1 דקות.
2. משוך בעדינות את העכברוש לאחור על ידי הזנב והציון כדלקמן.
   1. כיתה החולדה עם ציון 0 עבור גרעון נוירולוגי.
   2. כיתה עכברוש עם ציון 1 עבור forelimb כיפוף.
   3. כיתה העכברוש עם ציון 2 עבור מחזיק הצלעות חלש לאחיזה forelimb.
   4. כיתה העכברוש עם ציון 3 עבור מסתובב אל הצד הפראטי כאשר משכה על ידי הזנב.
   5. כיתה עכברוש עם ציון 4 עבור המקיפים³²ספונטנית.
      הערה: אם יותר מאשר אחת התגובות נצפו, העדפה ניתנת לפעולה עם ניקוד גבוה יותר.

6. קביעת עוצמת הקול הסיכונים (בחינת היסטולוגית)

1. מדידה של אמצעי האחסון הסיכונים
   הערה: בצע הליך זה כמתואר בעבר^33,34. למדוד את המוח סיכונים נפח באמצעות 2, 3, 5-triפניליום כלוריד (TTC) מכתים 24 h לאחר reperfusion.
   1. להרוג חמישה חולדות מכל קבוצה, 24 שעות אחרי ה-NSS האחרון, על ידי חשיפת אותם למנת יתר של מינון בחדר אינדוקציה.
   2. ולבודד את המוחות שלהם. באמצעות מספריים קטנים ומלקחיים
   3. תשטוף את המוח המבודד. ב-0.9% תמיסת מלח
   4. בדוק נקודות דימום על המוח כדי להוציא את העכברים שעברו דימום תת הארכחואיד במעגל של ויליס.
   5. מניחים כל מוח על שקופית זכוכית נקייה על הקרח 20 ° c לארוז ולאחר מכן למקם אותם ב-20 ° c מקרר עבור 5 דקות כדי להפוך את המוח קל יותר לחתוך.
   6. קחו את הזכוכית עם המוח שנמצא מחוץ למקרר של 20 ° c, הכניסו אותו חזרה לחבילת הקרח של 20 ° c, ובכך מנתחים את הקוטב הקדמי ואת המוח החלק המכלי עם להב ומלקחיים.
   7. פורסים את חתכי המוח אופקית לעובי של 2 מ"מ עם להב להפקת שש פרוסות.
   8. הכינו פתרון TTC 0.05% על ידי הוספת 1.25 g של אבקת TTC ל 500 mL של תמיסת מלח רגיל לפני ההקרבה, להעביר את הפתרון לצלחת 24-באר (1 mL לכל טוב) מכוסה נייר כסף, ולאחסן אותו ב 4 ° c.
      הערה: TTC ומוכתם רקמות עם TTC הם רגישים באור.
   9. באמצעות מלקחיים, להעביר את פרוסות המוח לצלחת 24-באר המכילה את הפתרון TTC (פרוסה אחת לכל טוב) ולמתוח את הפרוסות בפתרון.
   10. מודקת את תוכן הצלחת ב 37 ° c באמבט מים רדודים עבור 30 דקות.
   11. מטפי את התמיסה TTC מהצלחת עם פיפטה, לשטוף אותם עם נוזל שטיפת מוח, ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות.
   12. מניחים את הפרוסות בסדר שבו הם נחתכו על זכוכית מעבדה ובודקים את המקטעים בסורק.
   13. נתח את הגודל הסיכונים כאחוז מפרוסת המוח כולה, באמצעות תוכנת ניתוח ImageJ, המבוססת על זיהוי חזותי.
2. ניתוח סיכונים של אמצעי האחסון³⁵
   1. כמת את אמצעי האחסון הסיכונים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה סטנדרטית (ImageJ) ולנתח את עוצמת המוח הסיכונים כאחוז מגודל המוח כולו³³.
   2. מניחים את פרוסות המוח על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית וסורקים אותם באמצעות סורק אופטי ברזולוציה גבוהה (1,600 x 1,600 dpi) לניתוח הולם.
   3. חתוך את התמונות ותקנן את קנה המידה של כל התמונות, תוך שימוש בסרגל המדד הנכלל בתמונה הסרוקה.
   4. למדוד את האזור של הארון מסומן בשישה ברציפות 2 מילימטר הסעיפים ילתית באמצעות שרביט (מעקב) כלי בחירה חופשית על imagej 1.37 v תוכנה³⁶.
   5. חשב את אמצעי האחסון העקיף סיכונים באמצעות הנוסחה הבאה³⁷.

7. מדידה של בצקת המוח³⁸

הערה: בצקת המוח נמדדה 24 שעות. לאחר MCAO האחרון  בעלי חיים בעלי גרעון נוירולוגי חמור המפריעים לאכילה ו/או לשתייה למשך שלושה ימים לפחות, יותר מ -20% הרזיה, המיפלגיה או התקפים.

1. העריכו את סדר הגודל של הבצקת באונה הימנית באמצעות הסיכום של אזורים שפרוסים באופן כושל כדי לחשב את הכרכים של האונות הימנית והשמאלית ביחידות שרירותיות (פיקסלים).
   הערה: השתמש בתוכנת ImageJ 1.37 v עבור חישוב זה, לאחר סריקה אופטית (רזולוציה: 1,600 x 1,600 dpi). בחר את אזור העניין והשתמש בפונקציה ' מדידה ' מתפריט הניתוח. השתמשו בפקודות מאקרו. בחקירה שלנו
2. בטא את אזור בצקת המוח כאחוז מהאזורים הסטנדרטיים בחצי הכדור הרגיל שאינו מושפע.
3. חישוב מידת הנפיחות באמצעות המשוואה שפותחה בעבר³⁹.

8. תבניות התנהגותיות

1. לבצע בדיקות התנהגותיות בין ימים 30 ו 33 לאחר הניתוח בחדר סגור, שקט, בשליטה באור.
2. כדי להקליט את כל בדיקות ההתנהגות. בעזרת תוכנית מסחרית
3. סוכרוז העדפה מבחן^40,41
   1. מניחים את החולדות בכלובים בודדים באותו חדר שבו הם שוכנו במהלך המחזור האפל.
   2. במשך 24 h, מקום בקבוק אחד של 100 mL של 1% (w/v) הפתרון סוכרוז בכל כלוב עם החולדה להיבדק ולאפשר את ההסתגלות של העכברוש.
   3. לאחר 24 שעות, לשלול חולדות של מזון ומים עבור 12 h על ידי הסרת הבקבוקים.
   4. לאחר 12 h, הניחו שני בקבוקים בכל כלוב במשך 4 שעות, אחד המכיל 100 מ ל של מי ברז ועוד המכיל 100 mL של הפתרון של סוכרוז (1% [w/v]).
   5. הקלט את כמות התמיסה והמים הנצרכים בידי חולדות במילייטר. חשב את הזיקה להעדפה של סוכות כדלקמן.
4. כפייה לשחות במבחן⁴²
   הערה: הבדיקה הנכפית Porsolt בוצעה כמתואר בפרוטוקול הקודם שפורסם על ידי Zeldetz ואח '.⁴⁰ ו boyko et al.⁴². העיקרון של מבחן זה קובע כי, כאשר חולדות נאלצים לשחות באזור מוגבל ממנו, הם לא יכולים לברוח, הם בסופו של דבר להיות משותק, להפסיק את כל הנסיונות להימלט המים^43,44. בדיקה זו בוצעה בחדר אחר במהלך המחזור האפל.
   1. מניחים כל חולדה בצילינדר פלקסיגלס אנכי (גובה: 100 ס"מ; קוטר: 40 ס"מ) המכיל 80 ס מ של מים ב -25 ° c עבור 15 דקות עבור הרגלה.
   2. הוציא את החולדה והרשה לו להתייבש במשך 15 דקות במתחם מחומם (32 ° c).
   3. החזר את העכברוש לביתו (המקורי) כלוב.
   4. חזור על השלב 8.4.1 24 שעות מאוחר יותר, הפעם עבור החקירה, עבור 5 דקות.
   5. צלם את הבדיקה 5 דקות וחשב את משך הזמן הכולל של חוסר ניידות בתקופה זו.

תוצאות

ממצאים היסטולוגית (שולחן 1) חשף אמצעי אחסון משמעותי סיכונים מבחינה סטטיסטית כאחוז של המוח הכולל (p < 0.0001) post-mcao כאשר בהשוואה לבעלי חיים בקבוצת שליטה מזויף. כמו כן דווח שהיה בצקת מוחית סטטיסטית משמעותית כאשר ההערכה מהקבוצה הניסיונית (p < 0.0003) הושם זה לצד זה ש...

Discussion

אחת הדרכים בהן טכניקת MCAO המוצגת כאן יכולה להיחשב בטוחה יותר ממודל MCAO המקורי מומחש על-ידי העובדה כי ה-ECA וענפיו, כולל עורק העורף, המסוף הלשוני ועורק הלסת הראשי, אינם נחשפים כשסגר את הMCA באמצעות ה-ICA. מודל MCAO המקורי של היסט של ECA (ואת ענפיו), על ידי מבתר קרוש אותם⁴⁶, גורם לקויי מסטיק, בש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test