Une technique d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne pour induire la dépression post-AVC chez les rats

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour induire la dépression post-AVC chez les rats en occluant l’artère cérébrale moyenne via l’artère carotide interne. Nous utilisons le test de natation forcée Porsolt et le test de préférence de saccharose pour confirmer et évaluer les ambiances dépressives induites.

Résumé

La dépression post-AVC (PSD) est la plus récurrente de toutes les complications psychiatriques résultant d’un AVC ischémique. Une plus grande majorité (environ 60%) de tous les patients atteints d’AVC ischémique souffrent de PSD, un trouble considéré comme un précurseur ischémique lié aux AVC pour augmenter la mortalité et la dégradation de la santé. La pathophysiologie de PSD est encore obscure. Pour étudier le mécanisme de développement et l’occurrence de PSD plus loin, et pour découvrir une thérapie, nous avons tenté de développer un nouveau protocole qui nécessite d’occlusion l’artère cérébrale moyenne (MCA) par l’intermédiaire de l’artère carotidienne interne (ICA) chez les rats. Ce protocole décrit un modèle de PSD induit chez les rats à travers l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO). Aussi utilisé dans l’expérience sont le Porsolt test de natation forcée et le test de préférence de saccharose pour confirmer et évaluer l’humeur dépressif des rats sous enquête. Plutôt que d’insérer le cathéter à travers l’artère carotide externe (ECA), comme stipulé pour la procédure initiale, cette technique de MCAO a le monofilament passant directement par l’ICA. Cette technique de MCAO a été développée il y a quelques années et conduit à une réduction de la mortalité et de la variabilité. Il est généralement admis que les critères utilisés sont privilégiés dans la sélection des modèles biologiques. Les données obtenues avec ce protocole montrent que ce modèle de MCAO pourrait être un moyen d’induire le PSD chez le rat et pourrait potentiellement conduire à la compréhension de la pathophysiologie et le développement futur de nouveaux médicaments et d’autres agents neuroprotecteurs.

Introduction

Le AVC est le quatrième sur la liste des maladies qui commettent des décès aux États-Unis^1,2,³, alors qu’il provoque la majorité des handicaps chez les adultes dans les pays développés⁴; Cela fait de l’AVC un concurrent de premier plan parmi les problèmes de santé les plus importants au monde. La normalité chez les patients souffrant d’AVC est rare, avec environ 15%-40% des victimes de survie souffrant d’incapacité permanente, 20% nécessitant des soins institutionnels 3 mois après l’apparition de l’AVC⁵, et environ un tiers des survivants de 6 mois ayant besoin d’autres pour les aider à vivre chaque jour⁶. L’accident vasculaire cérébral serait également responsable de l’augmentation des dépenses de santé nationales⁷. Les estimations de l’American Heart Association ont des coûts liés aux AVC aux États-Unis à plus de $50 milliards en 2010⁸.

Non seulement l’AVC provoque des dommages à long terme des individus, mais certains survivants ont tendance à souffrir des troubles émotionnels et comportementaux, tels que la démence, la fatigue, l’anxiété, la dépression, le délire, et l’agression^{9,10,11 ,12,13,14}. La suite psychologique la plus récurrente après un AVC est la dépression post-AVC (PSD), diagnostiquée dans environ 40%-50% des survivances^15,16,17. La dépression induite par les AVC entraîne une augmentation de la morbidité et de la mortalité^{18,19,20,21,22}. La pathophysiologie de PSD n’est pas connue complètement, mais elle est apparemment causée par de multiples facteurs et est liée à l’invalidité, déficience cognitive, et le site de la lésion²³.

Le modèle de rat de l’ischémie du cerveau focal, créé par le MCAO, est le modèle animal le plus répandu de l’AVC^24,25,26,27. En démontrant l’induction de PSD chez le rat en occluant le MCA par l’ICA, des techniques qui minimisent la mortalité et la variabilité dans le modèle de MCAO sont employées²⁸.

L’objectif principal de ce protocole est de décrire les étapes pour induire le PSD chez le rat en occluant le MCA par l’intermédiaire de l’ICA, un modèle modifié de MCAO, qui réduit la mortalité et le résultat de la variabilité²⁸. Les objectifs spécifiques comprennent l’exécution d’examens neurologiques et histologiques (détermination du score de sévérité neurologique [NSS], le volume de la zone d’infarctus et œdème cérébral) pour vérifier l’efficacité du MCAO et l’utilisation de tests comportementaux pour examiner la influence de cette procédure MCAO sur le développement de troubles émotionnels, principalement PSD.

Protocole

Le Comité de soins aux animaux de l’Université Ben Gourion du Negev, Israël a approuvé toutes les procédures de traitement et d’essai utilisées dans ce protocole.

1. préparation des rats pour la procédure expérimentale

Remarque: Sélectionner des rats Sprague-Dawley mâles adultes pesant 300-350 g.

1. Loger les rats, quatre par cage, dans un vivarium à 22 ° c et 40% d’humidité, avec un cycle de lumière/obscurité inversé de 12 h (s’éteint à 8:00 a.m.) et un accès illimité à la nourriture et à l’eau.
2. Assigner aléatoirement les rats à deux groupes, à savoir un groupe MCAO (n = 24) et un groupe Sham (n = 19).

2. préparation des rats pour la chirurgie

1. Pour préparer les rats pour la procédure modifiée de MCAO, anesthésier chaque rat pendant 30 min avec un mélange d’isoflurane (4% pour l’induction, 2% pour la chirurgie, et 1,3% pour l’entretien) dans 24% d’oxygène (2 L/min) dans une chambre d’induction et lui permettre de respirer spontanément^{29 ,30}.
   Remarque: Stimuler le réflexe de retrait de la pédale en pinçant la peau entre les orteils et/ou les coussinets d’orteil à l’aide de forceps contondants. Considérez la profondeur de l’anesthésie adéquate quand le réflexe disparaît.
2. Maintenir la température du corps de base à 37 ° c avec une plaque chauffante.
3. Mesurez la température corporelle de tous les rats à travers une sonde placée dans le rectum du rat avant de commencer l’intervention chirurgicale.
4. Maintenir la température corporelle constante (37 ° c) pour tous les rats afin de minimiser tout effet hypothermique sur le résultat neurologique et toute blessure neurologique.
5. Appliquez des larmes artificielles pommade aux deux yeux de chaque animal pendant qu’ils se trouvent sur la table de préparation.
6. Raser le cou de chaque rat et désinfecter la peau avec 70% d’alcool chlorhexidine (70% d’alcool et 0,5% de gluconate de chlorhexidine). Répétez l’étape de désinfection deux fois de plus.
7. Couvrez les rats avec des rideaux chirurgicaux stérilisés.

3. chirurgie (la technique MCAO)

Remarque: Procéder à une intervention chirurgicale décrite par Boyko et al.²⁸ et utiliser les instruments fournis par McGarry et al.²⁹ et Uluç et coll.³⁰.

1. Effectuer une incision de la ligne médiane ventrale et disséquer le fascia superficiel.
2. Effectuer avec précaution une dissection pointue et émoussée dans les trois muscles en forme de triangle (le sternohyoid, le digastric et le muscle sternomastoïde) pour identifier les artères carotidiennes (ECA, ICA et artère carotide commune [CCA]).
3. Soigneusement disséquer et exposer le CCA droit et l’ICA.
4. Séparer le CCA droit et l’ICA du nerf nerf vague.
   Remarque: Après avoir identifié les artères carotidienne comme stipulé à l’étape 3,2, l’ICA serait reconnue comme la moitié des succursales de la CCA aux côtés de la CEA.
5. Insérez un monofilament de cathéter (en nylon 4-0 à la chaleur ou recouvert de silicone) directement à travers l’ICA, de ~ 18,5 à 19 mm du point de bifurcation du CCA droit dans le cercle de Willis jusqu’à ce qu’il atteigne une légère résistance, à l’occlure MCA.
   Remarque: Le filament de chaleur-émoussé et le nylon 4-0 enduit de silicone jouent le même rôle et sont les monofilaments plus préférés ces derniers temps, étant donné qu’ils fournissent une meilleure occlusion que le fil de nylon ordinaire^28,30.
6. Attacher une suture de soie 4-0 autour de l’ICA juste au-dessus de la bifurcation de la CCA (artère pterygopalatine) droite pour bloquer l’ICA proximale au point d’insertion de filament de façon permanente et distale à elle temporairement.
7. Attacher l’ICA autour du fil intraluminale pour attacher la suture de soie pour éviter les saignements.
8. Soumettre les rats simulacres à la même intervention chirurgicale que les rats MCAO, mais insérer un fil de nylon au lieu de²⁸.
   Remarque: Le fil de nylon, comme le nylon enduit de silicium, occlusion l’ICA, mais il n’est pas aussi efficace que ce dernier.
9. Fermez la plaie sur le cou du rat après avoir occlusion le MCA, éteignez l’anesthésie, et placez le rat dans un incubateur sous observation jusqu’à ce qu’il se réveille.
   Remarque: La nécessité de la ligature proximale est d’occlure l’ICA, et celle de la ligature distale additionnelle est de réduire le saignement autour du filament et de le sécuriser en place. En outre, le rat devrait se réveiller quelques minutes après que sa blessure a été fermée.

4. récupération post-chirurgicale

1. Administrer 5 mL de solution saline à 0,9% à chaque rat intrapéritonéale, immédiatement après la chirurgie, pour prévenir la déshydratation.
2. Administrer l’analgésie inconditionnellement le premier jour après l’opération; utiliser du méloxicam 1 mg/kg SQ Q24 h. donner de la DIPYRONE diluée (0,5 g dissous dans 400 mL d’eau potable) aux rats présentant des symptômes de douleur au cours des 3 premiers jours.
3. Sacrifiez tous les rats avec des crises (les crises sont causées par l’augmentation de la pression intracrânienne de l’œdème cérébral ou de l’hémorragie cérébrale²⁸).

5. score de sévérité neurologique³¹

Remarque: Cette procédure est assurée par deux observateurs qui ne participent pas à la procédure chirurgicale; Ils testent les déficits neurologiques et les déficits moteurs de grade sur un score cumulatif de 0-4³². L’évaluation de ce score peut être effectuée à différents intervalles de temps; dans cette enquête, il a été exécuté 50 min, 24 h, 7, 15 et 30 jours après la chirurgie. Retrouvez ci-dessous les étapes d’évaluation du NSS. Bien que n’étant pas une nécessité dans cette situation, cette note est nécessaire pour vérifier l’AVC chez les rongeurs afin d’administrer le traitement.

1. Placez le rat sur un sol en céramique et laissez-le se déplacer librement pendant 1 min.
2. Tirez doucement le rat vers l’arrière par la queue et le grade comme suit.
   1. Noter le rat avec le score 0 pour aucun déficit neurologique.
   2. Noter le rat avec le score 1 pour la flexion du membre antérieur.
   3. Noter le rat avec le score 2 pour la poignée de la faible membre antérieur contralatérale.
   4. Noter le rat avec le score 3 pour encercler le côté paretique lorsqu’il est tiré par la queue.
   5. Noter le rat avec le score 4 pour le cercle spontané³².
      Remarque: Si plus d’une des réactions sont observées, la préférence est donnée à l’action avec un score plus élevé.

6. détermination du volume de l’infarctus (examen Hhistologique)

1. Mesure du volume de l’infarctus
   Remarque: Exécutez cette procédure comme décrit précédemment^33,34. Mesurer le volume d’infarctus du cerveau en utilisant le chlorure de 2, 3, 5-triphényltétrazolium (TTC) coloration 24 h après reperfusion.
   1. Euthanasier cinq rats de chaque groupe, 24 h après le dernier NSS, en les exposant à une overdose d’isoflurane dans une chambre d’induction.
   2. Décapiter les rats et isoler rapidement leur cerveau à l’aide de petits ciseaux et forceps.
   3. Laver les cerveaux isolés dans 0,9% de sérum physiologique.
   4. Examinez les points de saignement sur le cerveau pour exclure les souris qui ont subi une hémorragie sous-arachnoïde dans le cercle de Willis.
   5. Placez chaque cerveau sur une lame de verre propre sur un paquet de glace-20 ° c, puis placez-les dans un réfrigérateur de-20 ° c pendant 5 min pour rendre le cerveau plus facile à trancher.
   6. Prenez la glissière de verre avec le cerveau sur elle hors du réfrigérateur-20 ° c, remettez-la sur le paquet de glace-20 ° c, et disséquez le poteau frontal et le cervelet avec la lame et la forceps.
   7. Découper les sections du cerveau horizontalement en épaisseur de 2 mm avec une lame pour produire six tranches.
   8. Préparer une solution de 0,05% TTC en ajoutant 1,25 g de poudre TTC à 500 mL de solution saline normale avant le sacrifice, transférer la solution à une plaque de 24 puits (1 mL par puits) recouverte de feuille d’aluminium et la conserver à 4 ° c.
      Remarque: TTC et les tissus colorés avec TTC sont sensibles à la lumière.
   9. À l’aide de forceps, transférer les tranches de cerveau à la plaque de 24 puits contenant la solution TTC (une tranche par puits) et étirer les tranches dans la solution.
   10. Incuber la teneur en plaque à 37 ° c dans un bain d’eau peu profond pendant 30 min.
   11. Aspirer la solution TTC de la plaque avec une pipette, les laver avec un liquide de lavage de cerveau et incuber à température ambiante pendant 30 min.
   12. Placez les tranches dans l’ordre dans lequel elles ont été coupées sur un verre de laboratoire et examinez les segments avec un scanner.
   13. Analysez la taille de l’infarctus en pourcentage de la tranche de cerveau entière, en utilisant le logiciel d’analyse ImageJ, basé sur l’identification visuelle.
2. Analyse de l’infarctus volume³⁵
   1. Quantifiez le volume de l’infarctus en utilisant un logiciel d’analyse d’image standard (ImageJ) et analysez le volume cérébral de l’infarctus en pourcentage de la taille totale du cerveau³³.
   2. Placez les tranches de cerveau sur des lames de microscope en verre et Scannez-les avec un scanner optique à haute résolution (1 600 x 1 600 dpi) pour une analyse adéquate.
   3. Recadrez les images et uniformisez l’échelle pour toutes les images, à l’aide de la règle métrique incluse dans l’image numérisée.
   4. Mesurez la surface de la pâleur marquée dans six sections consécutives de 2 mm en utilisant un outil baguette (traçage) et une sélection à main levée sur le logiciel ImageJ 1,37 v³⁶.
   5. Calculez le volume d’infarctus indirect à l’aide de la formule³⁷suivante.

7. mesure de l’œdème cérébral³⁸

Remarque: L’œdème cérébral a été mesuré 24 h après le dernier MCAO.  Euthanasier les animaux atteints d’un déficit neurologique sévère qui interfèrent avec l’alimentation et/ou l’alcool pendant au moins trois jours, plus de 20% de perte de poids, d’hémiplégie ou d’épilepsie.

1. Évaluez l’amplitude de l’œdème de l’hémisphère droit en utilisant la sommation des zones en tranches coronaires pour calculer les volumes des hémisphères droite et gauche dans des unités arbitraires (pixels).
   Remarque: Utilisez le logiciel ImageJ 1,37 v pour ce calcul, après numérisation optique (résolution: 1 600 x 1 600 dpi). Sélectionnez la zone d’intérêt et utilisez la fonction measure dans le menu analyse . Des macros ont été utilisées dans notre enquête.
2. Exprimer la zone oedème du cerveau en pourcentage des zones standard dans l’hémisphère contralatéral non affecté.
3. Calculez le degré de gonflement à l’aide de l’équation développée précédemment³⁹.

8. paradigmes comportementaux

1. Effectuez des tests comportementaux entre les jours 30 et 33 après la chirurgie dans une pièce fermée, silencieuse et contrôlée par la lumière.
2. Assigner les enquêteurs aveuglé à toutes les procédures expérimentales pour filmer tous les tests comportementaux avec un programme disponible dans le commerce.
3. Test de préférence de saccharose^40,41
   1. Placer les rats dans des cages individuelles dans la même pièce que celles où ils sont logés pendant le cycle sombre.
   2. Pour les 24 heures suivantes, placer une bouteille de 100 mL de solution de saccharose à 1% (p/v) dans chaque cage avec le rat à tester et permettre l’adaptation du rat.
   3. Après 24 h, priver les rats de nourriture et d’eau pendant 12 h en enlevant les bouteilles.
   4. Ensuite, après 12 h, placer deux flacons dans chaque cage pendant 4 h, un contenant 100 mL d’eau du robinet et un autre contenant 100 mL de solution de saccharose (1% [w/v]).
   5. Noter la quantité de solution de saccharose et d’eau consommée par les rats en millilitres. Calculez l’affinité avec la préférence de saccharose comme suit.
4. Porsolt forcé Swim test⁴²
   Remarque: Le test de natation forcée de Porsolt a été effectué comme décrit dans un protocole antérieur publié par Zeldetz et coll.⁴⁰ et Boyko et al.⁴². Le principe de ce test stipule que, lorsque les rats sont forcés de nager dans une zone restreinte d’où, ils ne peuvent pas s’échapper, ils finissent par devenir immobile, cessant toute tentative d’échapper à l’eau^43,44. Ce test a été effectué dans une pièce différente pendant le cycle sombre.
   1. Placer chaque rat dans un cylindre vertical en plexiglas (hauteur: 100 cm; diamètre: 40 cm) contenant 80 cm d’eau à 25 ° c pendant 15 min pour l’accoucation.
   2. Sortez le rat et laissez-le sécher pendant 15 min dans une enceinte chauffée (32 ° c).
   3. Retournez le rat à sa cage d’origine.
   4. Répétez l’étape 3, 24 h plus tard, cette fois pour l’enquête, pendant 5 min.
   5. Filmer le test de 5 min et calculer la durée totale de l’immobilité pendant cette période.

Résultats

Les résultats histologiques (tableau 1) révèlent un volume d’infarctus statistiquement significatif en pourcentage du cerveau total (p < 0,0001) post-MCAO comparativement aux animaux du groupe de contrôle factice. On a également signalé un œdème cérébral statistiquement significatif lorsque l’évaluation du groupe expérimental (p < 0,0003) a été mise côte à côte avec celle du groupe de contrôle factice.

Discussion

L’une des façons dont la technique MCAO présentée ici pourrait être jugée plus sûre que le modèle original du MCAO est illustrée par le fait que la CEA et ses branches, y compris l’artère occipital, le terminal linguale et l’artère maxillaire, ne sont pas compromises lors de l’occlusion de la MCA via l’ICA. Le décalage du modèle MCAO original de la CEA (et de ses branches), en disséquant et en coagulant distalement les⁴⁶, provoque une mastication altérée, en raison d’un ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absorbent pad	-	-	-
Black lusterless perspex box	-	-	(120 cm × 60 cm × 60 cm), divided into a 25% central zone and the surrounding border zone
Bottles	Techniplast	ACBT0262SU	150 mL bottles filled with 100 mL of water and 100 mL 1%(w/v) sucrose solution
Electric Shock	Heat System Ultasonic Inc.	-	-
Horizon-XL	Mennen Medical Ltd
Imaging System	Kodak	-	For imaging and quantification
Monofilament	-	-	-
Paper towels	Pharmacy	-	Dry towels used for keeping rats dry after immersing them in water
Pexiglass cylinder	-	-	a 100 cm tall and 40 cm in diameter cylinder used for carrying out the forced swim test
Purina Chow	Purina	5001	Rodent laboratory chow given to rats, mice and hamster is a life-cycle nutrition that has been used in biomedical researc for over 5 decades. Provided to rats ad libitum in this experiment
Rat Cages	Techniplast	2000P	Conventional housing for rodents. Was used for housing rats throughout the experiment
Scanner	Canon CanoScan	4200F	-
Video Camera	ETHO-VISION (Noldus)	-	Digital video camera for high definition recording of rat behavior under open field test