Colletotrichum fioriniae Desarrollo en agua y extractos florales basadas en cloroformo arándano y arándano

Resumen

Aquí, se describen pruebas biológicas diseñadas para controlar el desarrollo de un hongo patógeno Colletotrichum fioriniae, en presencia de extractos florales arándano o cranberry en cubreobjetos de vidrio. Agua, cloroformo y agua de lluvia de campo - basan floral extracción se detallan técnicas así como información sobre cómo puede aplicarse esta información.

Resumen

Para controlar con precisión la fenología de la época de floración y la dinámica temporal de señales químicas florales fruta hongos patógenos de la descomposición, métodos de extracción floral y cubreobjetos bioensayos fueron desarrollados utilizando fioriniae Colletotrichum. En arándanos y arándanos, este patógeno es óptimamente controlada mediante la aplicación de fungicidas durante la floración debido al Juego de flores de papel en las etapas iniciales de la infección. El protocolo detallado aquí describe cómo florales extractos (FE) fueron obtenidas usando agua, cloroformo y métodos de campo basados en el agua de lluvia para su uso posterior en las correspondientes pruebas biológicas de cubreobjetos de vidrio. Cada FE sirve para proporcionar un conjunto diferente de datos: respuesta de C. fioriniae a movilizado químico floral de señales en el agua (a base de agua), respuesta del patógeno a flor y fruta superficie ceras (cloroformo-basado) y seguimiento basado en el campo de recoger agua de lluvia floral, en vitro observaciones hacia un entorno agrícolo. Ampliamente se describe la FE como ya sea base agua o cloroformo-, con una prueba biológica apropiado descrito para compensar las diferencias inherentes entre estos dos materiales. Agua de lluvia que tenía escurr con flores fue colectado en dispositivos únicos para cada cultivo, aludiendo a la flexibilidad y la aplicación de este enfoque para otros sistemas de cultivo. Los bioensayos son rápido, barato, simple y ofrecen la posibilidad de generar información spatiotemporal y site-specific sobre la presencia de compuestos florales estimulantes de diversas fuentes. Esta información en última instancia mejor informará estrategias de manejo de la enfermedad, como FE disminuye el tiempo necesario para que la infección que se produzca, así proporcionando la penetración en cambio los riesgos de infección del patógeno durante la temporada de crecimiento.

Introducción

Fioriniae Colletotrichum causa una putrefacción de la fruta de arándano de Highbush (Vaccinium corymbosum L.) y el arándano rojo americano (V. macrocarpon Aiton) grandes^1,2. Este patógeno fue recientemente delineado de C. acutatum especies complejas de^3,4,5,6 y es un agente causal de la antracnosis de arándano y un miembro de la putrefacción de la fruta de arándano complejo, además de causar numerosas otras plantas enfermedades en todo el mundo⁷. C. fioriniae tiene una latente, hemibiotrophic estilo de vida⁸, con las infecciones que ocurren durante el desarrollo de la floración y el síntoma no ser aparente hasta que la fruta está en etapas finales de maduración⁹. En arándanos y arándanos, putrefacción de la fruta sólo adecuadamente se controla con fungicidas durante el periodo de floración. El patógeno sobrevive al invierno en arándano latente botón floral escalas¹⁰ y sporulates durante la floración. Conidios se mueven a lo largo de la cabina a través de salpicaduras de lluvia dispersión^11,12 y acumulación de inóculo se ha correlacionado fuertemente en el período de floración¹³. Respuesta de especies de Colletotrichum a flores de host no es exclusiva de Vaccinium, flores son importantes componentes de la fruta de cítricos post floración drop (PFD)¹⁴ así como antracnosis fresa¹⁵, en ambos casos causando el patógeno a esporular. Todos estos casos destacan la necesidad de métodos efectivos para evaluar la dinámica temporal de señales químicas florales fioriniae C. y otros patógenos que infectan durante la floración. La información proporcionada por los métodos descritos aquí se está volviendo cada vez más valioso.

Este protocolo detalla métodos de obtención del extracto floral (FE) y guía la evaluación de respuestas C. fioriniae fe via vidrio cubreobjetos pruebas biológicas^15,16. Las técnicas de extracción de flores se dividen en dos tipos principales; extracciones de agua (activo-FE, pasivo (pass -FE) y campo base de agua de lluvia (rw-FE)) y basado en cloroformo (ch-FE)¹⁷ extracciones. Las extracciones de agua permiten la inspección de agua movilizada floral señales químicas. Estas señales movilizados son probablemente importantes componentes de la corte de la infección, ya que FE aumenta grandemente la velocidad de infección¹⁶, además de proporcionar la humedad necesaria para que la infección que se produzca. Además, representan un estado más natural como estimulación floral puede ser lavada en el pabellón durante eventos de humedecimiento como previamente observados en arándanos y otros sistemas de cultivo^14,16. Extracciones florales basada en cloroformo (ch-FE) también proporcionan información valiosa referente a la respuesta del patógeno a la superficie de host ceras^17,18, elucidar las primeras etapas de crecimiento de conidios una vez depositados sobre susceptible órganos de host (es decir, flores, los ovarios y fruta). Respuesta del patógeno a cambios estacionales en la superficie ceras de host también puede controlarse usando este protocolo. Por consiguiente, las pruebas biológicas se adaptan a trabajar con FE basados en agua o cloroformo basado en FE para mitigar las diferencias inherentes entre estos dos materiales.

Los datos generados por los bioensayos revelaron que las extracciones de agua estimulan mayores niveles de conidiation secundario que extracciones de cloroformo donde existe una respuesta definitiva appressorial, por lo tanto implicando múltiples compuestos presente en la FE. Curiosamente, ambas de estas respuestas de crecimiento se observaron cuando usando agua de lluvia que se había quedado fuera de flores de arándano y arándano, indicando múltiples compuestos estimulantes puede ser lavada de la superficie de las flores. Por lo tanto, seguimiento para el estímulo floral se proporciona información sobre la probabilidad de éxito del patógeno en un sistema agrícola.

El objetivo final de este protocolo es proporcionar una metodología para generar información biológica base en hongos fitopatógenos en respuesta a señales químicas florales, así como iniciar metodologías que pueden utilizar esta información floral para ayudar a procesos de la gestión y toma de decisiones de la enfermedad específica.

Protocolo

1. aislamientos y suspensiones de esporas

1. Aislante fioriniae Colletotrichum de un anfitrión infectado naturalmente¹⁹. A continuación, almacenar los cultivos limpios en harina de maíz agar (CMA) sesgos. Colocar el tapón de la cultura (de inclinación de CMA) en una celda de plástico estándar cultura plato (9 cm diámetro) que contiene que ya sea clarificado agar de jugo V8 (cV8A) (modificado de Miller 1955), o no aclarado zumo de V8 agar (V8A)²⁰. Cuando las colonias comienzan a esporular, raya conidios (masas conidiales naranja) a otro cV8A o V8A que contiene la placa de cultivo celular (con un asa estéril estándar) para producir una cultura esporulación alta densidad.
   Nota: Los pasos de protocolo con hongos se deben realizar en una campana de Flujo Laminar para reducir la posibilidad de contaminar culturas fungicidas o pruebas biológicas.
2. Después de 7 días de crecimiento, utilizando un asa estéril estándar reunir una pequeña cantidad de conidios de la cultura de alta densidad (al tocar ligeramente el bucle a la masa de conidios) y esto mezcle en un tubo de centrífuga de 15 mL que contiene 10 mL de agua desionizada estéril (SDW). Vórtice de esta muestra de 10 s, luego con ayuda de una pipeta estándar sumergirse hacia arriba y hacia abajo varias veces a la mezcla más la muestra.
3. Luego, coloque una gota de la muestra de agitarse en el hemocitómetro y estimar concentraciones de esporas. Cuenta de 5-10 campos en el hemocitómetro, obtener la media y media se multiplican por el factor de dilución (es decir, 10.000), obteniendo así la concentración de conidios por mL SDW.
4. Luego, usando un volumen (V) / ecuación de la concentración (C) (V₁● [C₁] = V₂● [C₂]) ajustar (con SDW) a 1.0 X 10⁵ conidios por mL de SDW con un volumen final de 5 mL. Esto se conoce como la suspensión de esporas y sólo se hace inmediatamente antes de usarlo en cualquier prueba.

2. activos, extractos florales a base de agua (activo -FE)^15,16

Nota: Ver suplementario Figura 1, suplementario Figura 2, figura 3 complementariay película suplementario 1.

1. Cuidadosamente mano-recoger arándanos (abril-mayo) y arándanos (junio-julio) flores durante sus floraciones del pico respectivo en el campo (suplementario Figura 1). Desgaste y cambiar los guantes de nitrilo entre ubicaciones de muestreo (localizaciones de cultivares, variedades, físico) para inhibir la contaminación del aceite de la piel humana así como la contaminación cruzada entre las variedades florales. Coloque flores de arándano o arándano (de una sola fuente) en bolsas de plástico (llenar una bolsa de 100 x 150 mm) e inmediatamente refrigerar a 4 ° C una vez que se recogen flores.
   Nota: La extracción de activos se modifica de Leandro et al. (2003) ¹⁶.
2. Antes de la extracción, quite cualquier flores deteriorados, dañados, enfermos, luego utilizando flores saludables quitar los ovarios, sépalos y pedúnculos con fórceps curvado (pinzas de 45 °) y descarte. Utilice sólo los restantes órganos (corola, estigma, estilo y estambres) para activos - extracciones. Cortar tela (150 x 150 mm) dentro de un embudo de 7 x 7 mm, colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL limpio y reservar.
3. Combinar 1 parte procesado flores en 9 partes SDW (1 peso: relación vol 9) en un mortero. Suavemente, moler con un mortero para 30 s (tenga cuidado de no totalmente pulverizar las muestras). Colar la pulpa resultante a través del embudo de tela preparada y recoger en tubo de centrífuga (50 mL). Limpie o use nuevo mortero/Maja entre cada extracción con 95% EtOH y agua corriente tibia.
4. Preparar un aparato de filtración de vacío: se reúnen el Embudo Buchner, matraz de Erlenmeyer vacío del filtro (capacidad de hasta 1.000 mL), papel de filtro de 55 mm círculo y fuente de manguera de vacío. Añadir papel de filtro en un embudo de Buchner tamaño apropiado y coloque en el matraz, entonces conecte el aparato a un agua fuente con manguera de succión y dejar de lado.
5. Aclarar aún más los extractos de flores de arándano por centrifugación 10 min a 8.055 x g. Vierta el sobrenadante en aparato de filtro de vacío preparados, encienda la fuente de vacío, filtrar el sobrenadante, luego Vierta el contenido del matraz en un nuevo tubo de centrífuga (50 mL). Limpie todos los componentes del aparato entre cada filtración 95% EtOH y agua corriente tibia. Filtro adicional a través de una jeringa adaptada con un 0.22 μm tamaño de los poros, acetato de esterilización, filtro en un nuevo tubo de centrífuga (50 mL).
   1. Para los extractos florales arándanos, vacío sólo filtrar con papel de filtro y vierta el contenido del matraz en un nuevo tubo de centrífuga (50 mL).
6. Preparación resultante se denomina activo- extracto floral (activo -FE). Almacenar todo a base de agua florales extractos (activo- pasivo-, colecciones del agua de lluvia) a-20 ° C en alícuotas de 5-50 mL hasta uso experimental. Repetición de extracciones con múltiples muestras (al menos 3 extracciones por tipo de muestra) para proporcionar repeticiones.

3. pasiva , extractos florales a base de agua ( pasar -FE) ¹⁶

Nota: Ver pelicula complementaria 2.

1. A mano de flores recoger arándanos enteros (50 g) que el anterior y refrigere después de recoger. Antes de la extracción, quite cualquier flores deteriorados, dañados, enfermos y quite sólo los pedúnculos de flor intacta. Refrigerar muestras preparadas hasta que el pasivo - sistema de extracción, que se describe a continuación, en el lugar.
2. Enjuague todos los componentes antes 95% etanol (EtOH) y agua corriente tibia para prevenir la contaminación (hoja de malla de plástico, dos canastas de malla de plástico, molde de pan de cristal y botella de nebulización bomba). También preparar un tubo de centrífuga de estopilla/embudo/50 mL de 4 capas para cada extracción como se describe anteriormente (en el paso 2.2) y ponga a un lado.
3. Preparar el tamiz: Coloque una hoja de malla de plástico (aka clara barra estera) en cesta de una malla de plástico (114 x 102 mm). Coloque una canasta de malla en segundo lugar, idéntica, al revés (invertida) en un vidrio-bandeja para pan (127 x 229 mm) (para evitar flores en SDW) y coloque la malla hoja que contiene la cesta encima. Añadir 50 g de flores preparados en el tamiz.
   Nota: Como alternativa, cestas de pequeño tubo de ensayo [limpieza] pueden utilizarse en lugar de las cestas de malla de plástico originalmente usados (viejo, verde, fresa malla pinta cestas son a menudo difíciles a la fuente).
4. Flores de niebla con 250 mL con una bomba de niebla botella y uniformemente capturan de escorrentía en la bandeja de pan de cristal. Luego cuele filtrado a través del estopilla/embudo preparado en un tubo de centrífuga limpio. Preparación resultante se denomina pasiva- extracto floral (pass -FE); almacenar como por arriba (paso 2.6).
5. Limpie todos los componentes entre cada extracción con 95% EtOH y agua corriente tibia. Repetición de extracciones con muestras múltiples para proporcionar repeticiones (por lo menos 3 por tipo de muestra).

4. cloroformo a base de extractos florales (ch-FE) ¹⁷

1. Recoger flores de arándano y el arándano como por arriba (paso 2.1) y preparar las flores para la extracción (paso 2.2, sin preparación de estopilla/embudo). Mantener flores preparadas refrigeradas hasta antes de su uso.
   1. Cualquier trabajo realizado con cloroformo debe realizarse en una campana de humos por razones de seguridad. Esto incluye la preparación de materiales / cristalería, procedimientos de extracción y conductancia de prueba (pasos con ch-FE).
2. Limpiar todos los componentes con un 95% EtOH dos veces, luego dos veces con cloroformo para evitar la contaminación para cada extracción: roscado de tubos de cultivo de vidrio, 2 vasos de precipitado de vidrio, rejilla de acero inoxidable pequeño y un cilindro graduado [vidrio]. Dejar de lado a seco boca abajo. Enjuague tapas de politetrafluoroetileno (PTFE) alineado dos veces con 95% EtOH (cloroformo dañará los materiales del exteriores de la tapa) y dejar de lado que se seque.
3. Combinar 1 parte procesado flores en 9 partes de cloroformo (1 peso: relación vol 9) en un vaso de precipitados (flores entonces cloroformo), suavemente remolino para 30 s y la tensión a través de una pantalla de acero inoxidable en el segundo vaso. Vierta ch-FE del segundo vaso en el tubo de la cultura de cristal (10-15 mL) y fije el tapón PTFE. Envuelva la tapa con parafilm para evitar la evaporación.
4. Esta preparación es el extracto floral basada en cloroformo (ch-FE). Almacenar la muestra en la oscuridad (para reducir la degradación de la luz) a 4 ° C hasta su uso experimental. Repetición de extracciones con muestras múltiples para proporcionar repeticiones (por lo menos 3 por tipo de muestra).

5. recogida de aguas pluviales de flores de arándano (BB rw-FE)¹⁶

Nota: El dispositivo de recolección de agua de lluvia floral de arándanos consiste en una taza de rocío de aire pistola pintura desechables con adaptador de conexión (Copa: rosca, adaptador: rosca macho a macho), tubos de centrífuga de 50 mL (polipropileno), parafilm y () cables revestido plástico cable de teléfono estándar, contenido de filamento de alambre interno individual).

1. Seleccione varias ubicaciones dentro de un arbusto de arándanos para captar agua de lluvia correr fuera de flores antes de crear dispositivos para la recolección. Estos incluyen directamente debajo de las inflorescencias (flor) a la base de la zarza (corona). Registro de diámetro de los tallos (desde 1-5 cm) en lugares seleccionados, ya que esto determinará el tamaño de agujeros utilizados para la fijación del dispositivo, que se describe a continuación.
2. Para cada ubicación seleccionada crear un dispositivo de la colección. Taladre un agujero en la parte inferior de la taza de spray (donde la Copa curvas hacia la apertura de rosca) con el correspondiente diámetro de tallo, con un poco de paso a una prensa del taladro. Luego, cortar una línea recta desde la parte superior del fondo a la boca de la Copa de rocío. Taladro 4 agujeros equidistantes (suficientemente grandes para roscar el alambre revestido de plástico), en la boca de la Copa de rocío y conecte un extremo de los cables revestidos plástico dejando un extremo libre.
3. Perfore un agujero lo suficientemente grande para Enrosque el adaptador de taza de pulverizador de pintura de una tapa de tapa de centrífuga de 50 mL. Sellar las roscas del adaptador con parafilm para evitar fugas. Conecte este a la tapa de centrífuga y la parte roscada de la Copa del rociador. Conecte el tubo de centrífuga de 50 mL acoplado.
4. Repita los pasos 5.4 5.3 para crear múltiples dispositivos según las localizaciones, un mínimo de dispositivos de captación 4 por localidad de muestreo.
5. Implementar dispositivos en lugares seleccionados por flexión tazas rociador para acoplarse a los tallos. Orientar el lado cortado de la Copa de rocío hacia arriba usando los cables recubiertos de material plástico a otros tallos (para asegurar el agua que pasa sobre flores es capturado). Colocar parafilm las aberturas que podrían tener fugas de agua de lluvia. (Suplementario Figura 3, suplementario figura 4, suplementario Figura 5y suplementario Figura 6).
6. Tubos de etiqueta con el despliegue de fecha / hora. Después de un evento de lluvia, remover y reemplazar la parte inferior (tubo) del tubo de centrífuga (etiqueta de fecha / hora de recogida). Traer colecciones de escurrimiento (denominados Extracto de flores de agua de lluvia de arándano (rw-FE de BB)) dentro y vacío filtro (filtración descrito en pasos 2.4-2.5). Tienda como arriba (paso de 2.6), hasta que en un bioensayo con base de agua.

6. recogida de aguas pluviales de las flores de arándano (CB rw-FE)

1. El dispositivo de recolección de agua de lluvia floral en arándanos consiste en un embudo de polipropileno 7 X 7 cm, tubos de centrífuga de 50 mL (polipropileno), parafilm, y 4 estándar, de plástico revestido lazos de torcedura (por dispositivo).
2. En primer lugar, calor pinche 8 agujeros equidistantes (diámetro de lazos de torcedura) alrededor de la boca del embudo utilizando una sonda de metal. Inserte lazos de torcedura de 4. Conecte los otros extremos a ubicación opuesta agujeros, formando un patrón de cruce aseado. Enrolle abajo-vástago del embudo con parafilm y apartar.
3. Perfore un agujero lo suficientemente grande como para insertar el vástago de abajo del embudo en una tapa de centrífuga de 50 mL con un poco de paso. Inserte el embudo preparado en la tapa de la centrífuga. Repita los pasos 6.2-6.3 para crear múltiples dispositivos, un mínimo de dispositivos de captación 4 por localidad de muestreo.
4. Implementar dispositivos de etiquetado (fecha/hora) en pantanos de arándanos seleccionados. Cuidadosamente doble dos flor cojinete inflorescencias (conocidas como montantes) bajo los lazos de giro plástico cruzados. Luego orientar verticalmente el dispositivo por la perforación del tubo de centrífuga en el dosel del arándano (suplementario figuras 7-8, suplemento 3 de la película).
5. Después de un riego de lluvia o arriba Quite y vuelva a colocar la parte inferior (tubo) del tubo de centrífuga (etiqueta de fecha / hora de recogida). Traigo escurrimiento (denominado Extracto de arándano rojo lluvia floral (CB rw-FE)) dentro y vacío filtro (filtración descrito en pasos 2.4-2.5). Tienda como arriba (paso de 2.6), hasta que en un bioensayo con base de agua.

7. bioensayos con extractos florales en base de agua^15,16 (activo-FE, pasar-FE, FE de rw)

Nota: Vea la figura 1.

1. Este bioensayo se prepara en una campana de Flujo Laminar. Preparar materiales: Enjuague triple vidrio cubreobjetos con 95% EtOH y aire seco, entonces se puso a un lado. Cortar discos de toalla de papel para el diámetro interno de un platos de cultivo celular de plástico estándar (9 cm). 2 capas de discos de papel dentro de platos de la cultura y poner en remojo con 2 mL SDW.
2. Preparar por lo menos 5 mL de 1.0 X 10⁵ conidias por cada mL de suspensión de esporas SDW (C. fioriniae) como por arriba (paso 1.2-1.4), a un lado. A continuación, mezclar volúmenes iguales de SDW y basados en agua floral extracto en 2 mL tubos de microcentrífuga. Luego, añadir un volumen igual de la suspensión de esporas en los tubos de microcentrífuga de preparados 2 mL (SDW más FE); la preparación resultante se conoce como una mezcla de tratamiento acuosa. Para el control, omitir parte de FE y reemplazar con SDW, para mantener constantes las concentraciones de conidios.
   Nota: tamaño de porción depende de número de repeticiones y los puntos de tiempo. Por lo general, las porciones no excedan 500 μl. Una vez que se combinan los conidios y FE la prueba biológica ha comenzado, post-inoculación de 0 h.
3. Colocar el cubreobjetos de vidrio previamente limpiado encima de las toallas de papel empapadas dentro de la placa de cultivo celular. Coloque una gota de 40 μl de mezcla de tratamiento acuosa en el centro de un cubreobjetos. Repetición de tratamientos deseados, incluyendo el control, cierre la placa de cultivo celular. Repita en platos de cultura independiente de la célula para replicaciones (menos 3) y el tiempo (cada plato es de 1 punto). Una vez que han salido todos los tratamientos y repeticiones, coloque todos platos de cultura células replicadas en un envase plástico sellado (30 x 13 x 7 mm) e incubar a 25° C en la oscuridad.
4. En momentos predeterminados, añadir 10 μl de un fijador como el azul algodón de lactofenol (cristales de fenol de 20,0 g, ácido láctico de 20,0 mL de 2,5%, 40,0 mL glicerol, algodón 0.05 g azul) a las gotitas, detener el crecimiento y la conservación del Monte.
   1. Esperar 2 h para recoger el momento 0 h como esto permite conidial adherencia a la superficie de vidrio pero no es tiempo suficiente para la germinación de conidios. Todos los otros puntos de tiempo, añadir fijador al tiempo correspondiente.
5. Una vez que se ha añadido un fijador, invertir con cuidado el cubreobjetos, colocarlas lado gota en un portaobjetos de vidrio para facilitar el examen microscópico (1 cubreobjetos por diapositiva). Cuando los cubreobjetos sobre el portaobjetos de vidrio, dejar que se colocan y parcialmente seco en la campana de flujo por 20 min.
6. Los conidios (conidias total) presentan en el cubreobjetos (conidios primarios conidios germinados y conidios secundarios recién formados) así como apresorios en cualquiera de los dos 400 X aumentos (contando 16 campos) o 200 X (contando 4 campos), cuenta con un total de un área de 3,808 mm ². replicar toda prueba biológica para el análisis estadístico. Para los ensayos con FE a base de agua, análisis de datos como se describe en Waller et al. 2017¹⁶, normalmente viendo como media count/m² (total conidios o apresorios).

8. bioensayo usando cloroformo basado en extractos florales (ch-FE)¹⁷

Nota: Véase la figura 2.

1. Preparar materiales y platos de la cultura como por arriba (pasos 7.1) de la célula. Además, un número igual de Van Tieghem (células VanT.) enjuague (8 m m OD, ID 6 mm) a cubreobjetos y una pipeta de vidrio (1 mL con incrementos de 1 μl) dentro de una campana de humos, (dos veces con 95% EtOH luego dos veces con cloroformo) y reservar.
2. En campana de flujo laminar, utilizando un tubo de microcentrífuga de 2 mL agregar dos volúmenes iguales (porciones de al menos 500 μl) de SDW y 1 volumen de suspensión de esporas, y luego apartar. Esta es la mezcla de tratamiento acuosa para bioensayos ch-FE.
3. En una campana de humos, colocar un VanT. celular en un cubreobjetos de vidrio dentro de la placa de cultivo celular de plástico preparada. Añada (con pipeta de vidrio) 33 μl de deseada ch-FE en el centro de la célula de T. Van (no toque las paredes de lo VanT. Célula; para el tratamiento de control, añadir cloroformo Virgen) y dejar para secar. Repita en platos de cultura independiente de la célula para replicaciones (menos 3).
4. Ch-FE ha secado, dispensar 99 μl de la mezcla de tratamiento acuosa preparada con una pipeta estándar en el centro de lo VanT. celular, a continuación, cierre todos platos de la cultura de la célula. Una vez que la mezcla de tratamiento acuosa ha entrar en contacto con los tratamientos de secado ch-FE, la prueba ha comenzado, post-inoculación de 0 h.
5. Una vez que han salido todos los tratamientos y repeticiones, coloque los platos de cultura de célula (cerrada) en un envase plástico sellado (30 x 13 x 7 mm) e incubar a 25° C en la oscuridad.
6. En momentos predeterminados, añadir 15 μl de un fijador (lactofenol azul algodón) a la VanT. célula y dejar sentado durante al menos 5 minutos asegurar adecuada tinción de hongos. Después de ese tiempo, retire con cuidado el VanT. celular y siga los pasos de cubreobjetos inversión y datos de adquisición anteriormente (pasos 7.5-7.6). Para análisis de datos, siga los métodos descritos en el diseño 2015¹⁷, suelen Mostrar datos como formación de apresorio, cuál es la proporción de conidios total a apresorios en la zona observada (3,808 mm²).

9. arándano extracciones basados en la fenología¹⁷

1. Mano recoger flores de arándano (en junio; 100 g), no maduro fruta (dos veces; Julio y agosto; 200 g) y madurar fruta arándano en la cosecha (octubre; 200 g), colocar en bolsas de plástico de tamaños adecuado y refrigerar a 4 º C inmediatamente después de su obtención. Tome las precauciones de contaminación mencionadas anteriormente (paso 2.1).
   Nota: Habrá material extra planta recogido en cada momento, pero estas cantidades protección contra extracción de ovarios infectados obviamente hongos y frutas (mostrando síntomas y signos de enfermedad).
2. Antes de la extracción, quite cualquier flores deteriorados, dañados, enfermos y luego utilizando flores sólo sanas, eliminar los sépalos, pedúnculos, corollas, estigmas, estilos y estambres con fórceps curvado (pinzas de 45 °) y deseche todo menos los ovarios. Una vez recopilados los ovarios, realizar la extracción de cloroformo basado en un 1 peso: 9 relación de vol (detallado en pasos 4.2-4.4, usando sólo los ovarios). Almacenar las muestras hasta que todas las extracciones son completas, es decir, hasta la conductancia de la prueba biológica.
3. Una vez que los frutos se recogen, realizan una extracción basada en cloroformo (pasos 4.2-4.4, con recogida fruta en lugar de flores), pero añadir 10 g de fruta a 90 mL de cloroformo y una vez extrajeron, deje que la solución se evaporan 9 mL (dando por resultado un peso de 9 mL de 10 g: : solución de vol).
4. Hacer extracciones de fruta inmediatamente después de recoger en julio, agosto y octubre. Guardar como por arriba (paso 4.4) hasta que se recogen todas las extracciones. Después de la última extracción de fruta basada en cloroformo, sujetos todos los extractos de cloroformo basado en Penología recogidos de este análisis a la prueba biológica basada en cloroformo y en consecuencia analizar (pasos 8.1-8.6).

Resultados

Los resultados presentados aquí son unos ejemplos de los muchos ensayos que pueden realizarse utilizando esta metodología. Figura 1 es una guía ilustrada para el bioensayo de la FE a base de agua y se complementa con la figura 2 que sigue a la prueba de FE basada en cloroformo. La figura 3 muestra a una guía visual a lo que puede esperarse en la evaluación microscópica de C. fioriniae en 24 h, en ambos bioensayos basados en agua y cloroformo (en comparación con controles SDW). Figura 4 detalles de un estudio de tiempo-curso de 24 h con fioriniae C. en presencia de la variedad de arándano 'Stevens' ch-FE y da la referencia visual a un resultado de la importación de esta investigación: FE disminuida el tiempo necesario para formar las estructuras de infección Comparado con el SDW. Figura 5 es un ejemplo de datos obtenidos de un bioensayo de cubreobjetos con escurrimiento de lluvia floral arándano (CB "Flor" rw-FE). La figura 6 representa otro importante resultado: ovario floral ch-FE fue mucho más estimulante que fruta ch-FE, indicando la importancia de la floración en el ciclo de vida de C. fioriniae. Las fotografías adicionales y películas proporcionan importantes visuales de las flores utilizadas en las extracciones y lluvia floral colección dispositivos o despliegue, además de películas que visualizar el (extracción de activos - y pasivos- procesos basados en agua).

Figura 1 : Visión general de la base de agua floral extracto prueba biológica (FE). Este ensayo fue utilizado para los extractos florales a base de agua con flores de arándano y arándano: activo -floral extractos (activo-FE), pasivo -floral extractos (pasar-FE) y escurrimiento de agua de lluvia floral (rw-FE). La - FE porción generalmente constituye el factor de la variable experimental. Por el contrario la - FE parte puede permanecer constante y puede evaluarse post-inoculación de puntos/horas de tiempo. Preferencia se han realizado en 4 análisis de campo con 200 aumentos. Abreviaturas: Agua desionizada estéril, SDW; Área por campo de visión, A. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Visión general de cloroformo floral extracto prueba biológica (ch-FE). Este ensayo se utilizó para el arándano y arándano (flores, los ovarios y fruta). Sólo un tipo de mezcla acuosa de tratamiento fue utilizado en este ensayo, la suspensión de esporas de 1 parte en 2 partes SDW (para mantener la concentración conidial constante debido a la evaporación de ch-FE). Este ensayo puede utilizarse para comparar varios ch-FE (ceras de diferentes superficies de la planta), o múltiples tiempo puntos/horas post inoculación utilizando un solo ch-FE. Abreviaturas: Agua desionizada estéril, SDW; Células van Tieghem [cristal], VanT. celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Comparación visual de Colletotrichum fioriniae en presencia de FE basada en agua y FE ch. En este arándano de ensayo 'Bluecrop' (activo-FE, base de agua) (aislar hongos: BB #10) y arándano 'Stevens' basada en cloroformo (ch-FE) (aislar hongos: CB-PMAP182) extractos florales fueron comparados a los controles SDW. Un aumento dramático en la secundaria conidiation (anillos) y la formación de apresorio (flecha) se observó al comparar los conidios en presencia de SDW (control) (A) a activo-FE (B) a la inoculación posterior 24 h. Sin embargo, conidiation secundario no era tan evidente al comparar el cloroformo bioensayo SDW control (C) ch-FE (D); por el contrario, C. fioriniae crecimiento desplazado hacia la formación de appressorial. Es una respuesta común para cada tipo de extracción, basada en agua y cloroformo-base, independientemente del host/especies descritas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Tiempo-curso de estudios (24 h) con Colletotrichum fioriniae en presencia de FE ch. En este ensayo, un control SDW (A-d) y arándano 'Stevens' ch-FE (E-F) fueron inspeccionados visualmente en 0, 6, 12 y post-inoculación de 24 h (un ejemplo de puntos de tiempo variable en lugar de comparar múltiples FE). Formación de apresorio (flecha) comenzó a las 6 h en el ch-FE y aumentado constantemente a lo largo de puntos de tiempo posteriores. Este resultado se escapa un factor importante de la biología del patógeno durante el periodo de floración: flores de reducen el tiempo necesario para formar las estructuras de infección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Representación gráfica de los datos recogidos en un bioensayo con rw-FE. Correr agua de lluvia fuera de flores de arándano (CB "Flor" rw-FE) y aguas pluviales Virgen que no habían tocado cualquier tejidos de la planta de arándano rojo ("Tierra" rw-FE) de un solo evento de humedecimiento, además de un estándar activa, basada en agua floral Extracto de arándano (CB activo -FE) (control positivo) y SDW (control negativo) fueron sometidos a una prueba biológica cubreobjetos a base de agua y evaluados para el crecimiento de C. fioriniae . CB "Flor" rw-FE tenía el mismo nivel de formación conidiation y apresorio secundaria como el estándar CB activo-FE en inoculación después de 24 h, lo que indica que los dispositivos de captación fueron eficaces en la captura de flores estimulantes durante un evento de humedecimiento. Conidias total se compone de primaria (depositado), conidios y conidios secundarios recién formados. Letras indican diferencias significativas a p < 0.05 según por lo menos una diferencia Fischer significativa prueba (LSD); mayúsculas, total de conidios; minúsculas, apresorios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Arándano fenología en ch-FE prueba, inspección visual. Manejo de la enfermedad para fruta descomposición hongos a menudo consiste en aplicaciones de fungicida de tiempo de la floración. Aquí, extractos cloroformo basado en arándano (ch-FE) de múltiples etapas de crecimiento de arándano ('Stevens') visualmente evaluaron el efecto de superficie ceras en C. fioriniae en inoculación después de 24 h. Los ovarios recogido en junio (A), frutos inmaduros que se recogen en julio y agosto (B, C), fruta recogida en octubre (D), y un control SDW (E) fueron examinados para la formación de appressorial (flecha). Ovario ch-FE tuvo la mayor magnitud de appressorial formación, indicando que esta fenología de la planta (floración) es muy importante que el ciclo de vida de C. fioriniae. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 1: inflorescencia de Blueberry. Se colectaron flores de arándano para las extracciones durante plena floración (abril-mayo en New Jersey, USA) (se muestra 'Bluecrop'). Tenga en cuenta la superposición de corolas/ovarios de flores adyacentes y la arquitectura general de la inflorescencia en comparación con suplementario Figura 2 (arándano vertical). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 2: arándano rojo vertical. Se colectaron flores de arándano para extracciones durante plena floración (junio-julio en New Jersey, USA) (se muestra a 'Stevens'). Tenga en cuenta las etapas de flor variada en una sola inflorescencia arándano (vertical) y la forma de gancho, gotita de agua manteniendo la forma de la corola. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 3: distribución de agua de lluvia arándano (flor). Completa el dispositivo de recolección de agua de lluvia floral arándano, colocado directamente bajo un conjunto de inflorescencias. Nota el alambre recubierto de plástico usado para orientar verticalmente el dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario figura 4: implementación de agua de lluvia de arándano (stem). Blueberry completo lluvia floral dispositivo de la colección, a medio camino abajo del tallo entre una inflorescencia y la corona del casquillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 5: distribución de agua de lluvia de arándano (corona). Completa el dispositivo de recolección de agua de lluvia floral arándano, colocado en la base del arbusto (corona). Los cables revestidos plástico Nota pueden quitarse si no es necesario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 6: implementación de agua de lluvia de arándano (tierra). Completa el dispositivo de recolección de aguas pluviales Virgen, colocado junto a arbustos de arándanos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 7: implementación de lluvia arándano (primer plano). Completa dispositivo de recogida de arándanos lluvia floral, con dos barras verticales bajo los lazos del alambre cruzado perfectamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario Figura 8: implementación de arándano lluvia. Múltiples terminado dispositivos arándano lluvia floral en un pantano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Suplementario 1 película: extractos florales activados, a base de agua (activo -FE). Soporte de vídeo adicional siguiendo los pasos 2.3-2.5.1. Se utilizaron flores de arándano 'Bluecrop'. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Adicional 2 de la película: pasiva, extractos florales a base de agua (pasar-FE). Soporte de vídeo adicionales siguientes pasos 3.3-3.4. Se utilizaron flores de arándano 'Bluecrop'. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Complementaria 3 película: implementación de dispositivos de captación de lluvia floral arándano. Soporte de vídeo complementaria siguiente paso 6.4. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Discusión

Los bioensayos de detección de la respuesta de C. fioriniae extractos florales (FEs) fueron desarrollados para la fruta de arándano y arándano patosistemas putrefacción pero pueden ser fácilmente adaptados para otros cultivos hortícolas. El protocolo detallado arriba ha sido valioso en la adquisición de muchos conjuntos de datos importantes incluyendo, sin limitarse a: efectos de la FE en varios aislados de numerosos patógenos, curso del tiempo la información relacionada con etapas de crecimiento del hongo en presencia de varias FEs, comparación de técnicas de extracción, los extractos de inspección de los productos químicos individuales en fioriniae C. crecimiento y diferenciación, evaluación del órgano de la flor individual, efectos de temperatura en C. fioriniae en presencia de FE, efectos de extracción de cera dependiente de fenología y efectos de lluvia floral. Mediante el uso de estas técnicas, los datos generados también ha proporcionado una comprensión mucho más clara de vida fioriniae C. etapas y aclara parcialmente por el período de floración es tan importante para el control de fruta muchos patógenos de la descomposición.

Inicialmente, todas las flores fueron procesadas idénticamente a la activa-FE, pero el proceso de extracción se ha movido hacia el uso de flores todo. Disección floral fue lenta y tuvo muy poco efecto en la bioactividad de la FEs resultante. Sin embargo, los órganos florales individuales pueden y han sido evaluados mediante este protocolo, pero el gran cuidado debe ser tomado no totalmente macerar los tejidos florales (suplemento 1 de la película, con las precauciones detalladas en el paso 2.3), como esto puede resultar en liberados compuestos de hongos tóxicos/estático en la FE que podría distorsionar la evaluación microscópica. Menos extracciones invasoras como paso -FE (adicional 2 de la película) y rw-FE ahora son más favorables debido a su facilidad de adquisición. Además, estas técnicas de extracción requieren sólo vacío filtración para adquirir señales químicas florales biológicamente activos.

Las flores utilizadas en todas las extracciones fueron típicamente refrigeradas para 0-3 días antes de la preparación del extracto. Gestión del tiempo del volumen de negocios de la FE (colección de campo a través del almacenamiento de información de extractos) es un reto del presente Protocolo. Esto fue exacerbado por las numerosas muestras de múltiples fuentes y fechas. Flores congeladas no han sido evaluadas en cualquier medida real, descongelados flores aparecen deteriorados y decolorados. Sin embargo, la FEs a base de agua han sido preparados, repetida congelación y descongelación no ha demostrado ningún efecto en la bioactividad de la FE, tan de largo como la FE son rápidamente congelar nuevamente después de la preparación de la prueba biológica (viable FE 3 año de edad).

Extracción de cloroformo permite la investigación de las respuestas de patógeno a ceras superficiales fruta floral tridimensional en un plano bidimensional a través evaporación ch-FE en cubreobjetos de vidrio. Sin embargo, es poco probable que las estructuras cristalinas reales de ceras depositadas la ch-FE son idénticas a la superficie de la cual fueron recogidos. Deben aplicarse técnicas significadas suplementarias si hongos ante las estructuras de cera específicas en vivo es el foco principal de investigación. Extractos de cloroformo necesitan más mantenimiento de almacenamiento de información de las extracciones de agua. Además de mantener la FE ch extractos en la oscuridad, el cultivo celular PTFE alineado tubo tapas y parafilm sellado abrigo deban revisarse regularmente para pérdidas por evaporación y reemplazado si es necesario.

El concepto de control de escorrentía de lluvia floral se basa en la idea de avanzar en herramientas de monitoreo de la enfermedad específica. Los dispositivos de captación de agua de lluvia pueden ser adaptados a muchas otras arquitecturas de planta, siempre y cuando el dispositivo de la colección captura agua de lluvia que se ha ejecutado de flores. Este enfoque proporciona información sobre si la estimulación floral está presente en el campo en cualquier momento y puede controlarse durante toda la temporada. Alternativamente, se pueden implementar dispositivos de recolección en varias ubicaciones de pabellón para determinar hasta qué punto señales florales han sido lavados durante cualquier dado humectante-evento. En el futuro experimentos, rw-FE dictará Cuándo deben comenzar a fungicidas y cuándo puede terminar con seguridad. Además, mediante el control de extracciones de cera dependiente de fenología (Protocolo, artículo 9), la importancia del período de floración a la biología del patógeno se ha convertido en aún más evidente. Esa sección fue incluida también para demostrar la flexibilidad de estos bioensayos, proporcionando métodos que permiten la comparación lado a lado de ceras superficiales anfitrión temporal separadas. Los datos generados utilizando las técnicas de extracción floral y pruebas biológicas representan indicadores tangibles de estímulo patógeno, clases químicas específicas importantes para la biología del patógeno y objetivos para futuras estrategias.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter	VWR	101102-280	Blueberry floral extract (FE) clarification
200-1000 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
40-200 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
5-40 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter	Harbor Freight	97098	Blueberry rainwater (rw-)FE collection
Autoclave	Amsco	3011	Equipment, media preparation
Bar mesh matting (plastic mesh sheet)	Winco	BL-240	Passive (pass)-FE collection
Benchtop timer	Fisher Scientific	06-662-47	Equipment, FE preparation
Black pressure/vacuum hose	VWR	62994-795	Vacuum filter component
Buchner funnel	Coors USA	60240	Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks
Bunsen burner	-	-	Equipment
Calcium carbonate	Fisher Scientific	C64-500	Media component
Centrifuge	Sorvall	RC 5B Plus	Equipment
Centrifuge tubes (15 ml)	Fisher Scientific	05-527-90	Equipment
Centrifuge tubes (50 ml)	VWR	10025-694	Equipment, rw-FE collection
Cheesecloth (grade 50)	Fisher Scientific	AS240	Equipment, FE preparation
Chloroform	VWR	JT9175-3	Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free
Corn Meal Agar (CMA)	Fisher Scientific	B11132	Pre-mix media, isolate storage on slants
Cotton-blue stain	Sigma-Aldrich	61335	Lactophenol cotton-blue stain
Difco Agar	VWR	90004-032	Media component
Drill-press	Delta	-	Equipment, rw-FE collection
EASYpure LF Ultrapure water	Barnstead	D738	Equipment, deionized water source
Ethanol (95%)	-	-	Chemical
Filter flask (500 ml)	Pyrex	No. 5340	Vacuum filter component
Fume hood	Hamilton	-	Equipment, chloroform usage
Funnel (7 X 7 cm)	VWR	60820-110	Cranberry rw-FE collection, FE preparation
Generic glass slide	Fisher Scientific	22-038-101	Bioassay conductance
Generic plastic pump spray bottle	VWR	16126-454	pass-FE collection, at least 250 ml capacity
Glass cell culture tubes	-	-	Storage of ch-FE
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B	Bioassay conductance
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)	-	-	Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)
Glass-pipette (1-100 µl)	Hamilton Co. Inc.	#710	ch-FE bioassay
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Lactophenol cotton-blue stain
Hemocytometer	Bright-Line	5971R10	Equipment
Lactic acid	Sigma-Aldrich	W261106	Lactophenol cotton-blue stain
Laminar flow hood	Labconco	3730400	Equipment, sterile work environment
Metal probe (generic)	-	-	Equipment
Microcentrifuge tubes (2 ml)	Fisher Scientific	05-408-138	Aqueous treatment mixture storage and preparation
Microscope, Leica DMLB	Leica	020-519.010	Equipment
Mortar (ceramic)	Coors USA	60313	Vacuum filter component
Nitrile gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D	Flower collection
Paper disks (cut paper towels)	Office Basics	KCC01510	humidity control in bioassay
Parafilm	Bemis	PM-996	Plastic paraffin film
Pestle (ceramic)	Coors USA	60314	Vacuum filter component
Phenol crystals	Fisher Scientific	A92-100	Lactophenol cotton-blue stain
Plastic bags (~100 mm X 152 mm)	Uline	S1294	Equipment, flower refrigeration
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)	Fisher Scientific	FB0875712	(Petri dish), bioassay conductance
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps	VWR	60927-228	Storage of ch-FE
Pyrex beakers (100 ml)	Pyrex	No. 1000	Preparation of ch-FE
Pyrex bread-pan	-	-	pass-FE collection
Pyrex graduated cylinder	-	-	Equipment, FE preparation
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)	-	-	Bioassay conductance
Sharp-pointed dissecting scissors	Fisher Scientific	8940	Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks
Stainless steel mesh strainer	VWR	470149-756	Preparation of ch-FE
Step drill bit (step-bit)	Dewalt	-	Equipment, rw-FE collection
Sterile loop (combi-loop)	Fisher Scientific	22-363-602	Culture preparation
Telephone wire (internal wires)	-	-	Blueberry rw-FE collection
Test tube basket	VWR	470137-792	Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket
V8 Juice	Campbell's Soup Company	-	Fungal media component
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets	Donation	-	pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)
Vortex Genie (Vortex)	Fisher Scientific	12-812	Spore suspension preparation
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles	Whatman	1001-055	Vacuum filter component
White plastic twist ties (100 mm)	Uline	S-566W	Cranberry rw-FE collection