Colletotrichum fioriniae Entwicklung in Wasser und Chloroform-basierte Heidelbeere und Cranberry Floral Extrakte

Zusammenfassung

Hier werden Bioassays zur Überwachung der Entwicklung der pilzliche Erreger, Colletotrichum Fioriniae, im Beisein von Heidelbeeren oder Preiselbeeren floral Auszüge auf Glasdeckgläser beschrieben. Wasser, Chloroform und Feld Regenwasser - basierte floral Extraktion, die Techniken detailliert sind, sowie Einblick, wie diese Information angewendet werden kann.

Zusammenfassung

Um die Phänologie der Blütezeit und die zeitliche Dynamik der floralen chemische Hinweise auf Pilz Obst verfault Krankheitserreger genau zu überwachen, wurden florale Extraktionsmethoden und Deckglas Bioassays entwickelt unter Verwendung Colletotrichum Fioriniae. In Heidelbeeren und Preiselbeeren ist dieser Erreger optimal gesteuert, durch die Anwendung von Fungiziden während der Blütezeit wegen Blumen Rollenspiel in den ersten Stadien der Infektion. Das Protokoll hier detailliert beschreibt, wie florale Extrakte (FE) mit Wasser, Chloroform und Regenwasser-basierte Feldmethoden zur späteren Verwendung in entsprechenden Glas Deckglas Bioassays stammen. Jede FE serviert, einen anderen Satz von Informationen bereitzustellen: Antwort von C. Fioriniae mobilisiert floral chemischen Queues in Wasser (wasserbasiert), Erreger Reaktion auf Blüte und Frucht Oberfläche Wachse (Chloroform-basiert) und Feld-basierte Überwachung der floral Regenwasser, Umzug in-vitro- Beobachtungen in einer landwirtschaftlichen Umgebung gesammelt. Die FE ist allgemein als entweder Wasser oder Chloroform-basierte, mit einer entsprechenden Bioassay beschrieben als Ausgleich für die angeborene Unterschiede zwischen diesen beiden Materialien beschrieben. Regenwasser, das aus Blumen gelaufen wurde in einzigartige Geräte für jede Ernte in Anspielung auf die Flexibilität und die Anwendung dieses Ansatzes für andere Anbausysteme. Die Bioassays sind schnell, kostengünstig, einfach und bieten die Möglichkeit, räumlich-zeitliche und ortsspezifische Informationen über das Vorhandensein der stimulierende floral Verbindungen aus verschiedenen Quellen zu erzeugen. Diese Informationen letztendlich informieren besser Disease-Management-Strategien, wie FE verringern den Zeitaufwand für Infektion auftreten, so Einblicke in veränderten Risiken für Erreger Infektion über die Vegetationsperiode.

Einleitung

Colletotrichum Fioriniae verursacht eine Fruchtfäule Schneeball Heidelbeere (Vaccinium Corymbosum L.) und der großen amerikanischen Cranberry (V. Macrocarpon Aiton)^1,2. Dieser Erreger wurde vor kurzem von der C. Acutatum Arten komplexe^3,4,5,6 abgegrenzt und ist eine kausale Heidelbeere Anthraknose-Agent und Mitglied der Cranberry Frucht rot Komplex, neben zahlreichen anderen Pflanzen Krankheiten weltweit⁷verursacht. C. Fioriniae hat eine latente, Hemibiotrophic Lebensstil⁸, mit Infektionen, die während der Blüte und Symptom Entwicklung nicht sichtbar, bis die Frucht in der Endphase der Reifung⁹sind. Fruchtfäule wird in Heidelbeeren und Preiselbeeren nur ausreichend mit Fungizidanwendungen, die während der Blütezeit gesteuert. Der Erreger überwintert in ruhenden Heidelbeere floral Knospe Skalen¹⁰ und sporulates während der Blüte. Konidien werden in den Baumkronen über regen-Splash Zerstreuung^11,12 und Inokulum Aufbau wurde stark an die Blüte Periode¹³korreliert. Antwort von Colletotrichum Arten auf Host Blumen gilt nicht nur für Vaccinium, wie Blumen wichtige Komponenten der Zitrusfrüchte Post Blüte Frucht sind (PFD)¹⁴ sowie Erdbeer Anthraknose¹⁵, in beiden Fällen verursacht ablegen der Erreger, sporulate. Allen diesen Fällen unterstreichen die Notwendigkeit für effektive Methoden zur Beurteilung der zeitlichen Dynamik des floralen chemische Signale auf C. Fioriniae und andere Krankheitserreger, die während der Blüte zu infizieren. Die Einsichten, die durch die hier beschriebenen Methoden werden immer wertvoller.

Dieses Protokoll beschreibt Methoden der floralen Extrakt (FE) Beschaffung und führt die Auswertung der C. Fioriniae Reaktionen auf FE über Glas Deckglas Bioassays^15,16. Die floralen Extraktionstechniken werden in zwei Haupttypen unterteilt; wässrige Extraktionen (aktiv-FE, passive (Pass -FE) und Feld Regenwasser-basierte (Rw-FE)), und Chloroform-basierte (ch-FE)¹⁷ Extraktionen. Die wässrige Extraktionen ermöglichen für die Inspektion von Wasser mobilisiert floral chemische Signale. Diese mobilisiert Cues sind wahrscheinlich wichtige Bestandteile des Gerichts Infektion, da FE die Geschwindigkeit der Infektion^{16 erhöht}, neben der Bereitstellung der Feuchtigkeit erforderlich für die Infektion auftreten. Darüber hinaus stellen sie einen natürlicheren Zustand als floral Stimulation in den Baumkronen bei Benetzung-Veranstaltungen wie zuvor in Heidelbeeren und andere Ernte Systeme^14,16gewaschen werden kann. Chloroform-basierte florale Extraktionen (ch-FE) bieten auch wertvolle Informationen zu Erreger Reaktion auf Host Oberfläche^17,18, Aufklärung der frühen Entwicklungsstadien der Konidien auf anfälligen einmal hinterlegt Wachse Host-Organe (z. B. Blumen, Eierstöcke und entwickelnden Frucht). Erreger als Reaktion auf saisonale Veränderungen in Host Oberfläche Wachse kann auch mit diesem Protokoll überwacht werden. Dementsprechend sind die Bioassays zugeschnitten auf die Zusammenarbeit mit wasserbasierten FE oder Chloroform-basierte FE um die angeborene Unterschiede zwischen diesen beiden Materialien zu mildern.

Von den Bioassays generierten Daten ergab, dass wässrige Extraktionen höhere Niveaus von sekundären Conidiation als Chloroform-basierte Extraktionen stimulieren gab es eine definitive Appressorial Antwort, daher Verwicklung mehrere Verbindungen in der FE vorhanden. Interessanterweise waren beide dieser Wachstum Antworten beobachtet, wenn die Nutzung von Regenwasser, die von Heidelbeere und Cranberry Blumen, zeigt mehrere stimulierende Verbindungen ausgeführt hatte von der Oberfläche der Blumen gewaschen werden können. So wird die Überwachung für florale Stimulation Einblick in die Erfolgswahrscheinlichkeit Erreger in ein landwirtschaftliches System bieten.

Das ultimative Ziel dieses Protokolls ist es, bieten eine Methode zur Erzeugung von biologischen Basisinformationen auf Pilz Pflanzenpathogene als Reaktion auf florale chemische Signale sowie initiierende Methoden, die diese floralen Informationen zur Unterstützung nutzen können standortspezifische Krankheitsprozesse Leitungs- und Entscheidungsstrukturen.

Protokoll

(1) Pilz Isolate und Spore Suspensionen

1. Isolieren Sie Colletotrichum Fioriniae von einem natürlich infizierten Wirt¹⁹. Speichern Sie dann die sauberen Kulturen auf Maismehl Nährbodenschrägen (CMA). Legen Sie die Stecker der Kultur (von CMA schräg) auf einen Kunststoff Standardzelle Kultur Teller (9 cm Durchmesser) mit entweder V8 Saft Agar (cV8A) (geändert von Miller 1955) oder nicht geklärt V8 Saft Agar (V8A)²⁰geklärt. Wenn Kolonien beginnen, sporulate, Streifen Konidien (orange conidial Massen) auf einen anderen cV8A oder V8A mit Zelle Kulturschale (mit einer standard steril Schleife) um eine High-Density sporulating Kultur zu produzieren.
   Hinweis: Keine Protokoll-Schritte mit Pilzen sollte in einer Laminar-Flow-Haube um die Möglichkeit einer Kontamination Pilzkulturen und/oder Bioassays durchgeführt werden.
2. Nach 7 Tagen Wachstum, mit einer standard steril Schleife eine kleine Menge der Konidien aus der High-Density-Kultur sammeln (durch leichte Berührung der Schleife der conidial Masse) und rühren Sie dies in einem 15 mL Zentrifugenröhrchen mit 10 mL sterile entionisiertem Wasser (SDW). Wirbel in diesem Beispiel für 10 s, dann mit einer standard Pipette stürzen oben und unten mehrfach weitere Mischung die Probe.
3. Dann geben Sie einen Tropfen der Probe auf die Hemocytometer verwirbelt und schätzen Sie Spore Konzentrationen zu. Graf von 5-10 Felder auf die Hemocytometer erhalten im Durchschnitt und multiplizieren Sie Durchschnitt mit den entsprechenden Verdünnungsfaktor (d.h. 10.000), wodurch die conidial Konzentration pro mL SDW.
4. Dann mit einem Volumen (V) / Konzentration (C) Gleichung (V₁● [C₁] = V₂● [C₂]) auf 1,0 X 10⁵ Konidien pro mL SDW mit einem Endvolumen von 5 mL (mit SDW) einstellen. Dies wird als die Spore-Suspension bezeichnet und erfolgt erst unmittelbar vor dem Gebrauch in beiden Bioassay.

2. aktiv, wässrige Extrakte Floral (aktiv -FE)^15,16

Hinweis: Siehe ergänzende Abbildung 1, ergänzende Abbildung 2 zusätzliche Abbildung 3und ergänzende Film 1.

1. Sorgfältig Hand sammeln Heidelbeeren (April-Mai) und Cranberry (Juni-Juli) Blumen während ihrer jeweiligen Spitze Blüten im Feld (ergänzende Abbildung1). Tragen und Nitril-Handschuhe zwischen Probenahme Standorten (Sorten/Sorten/physische Standorte) hemmen menschliche Haut Ölverschmutzung sowie Kreuzkontaminationen zwischen floralen Sorten zu ändern. Heidelbeeren oder Preiselbeeren Blumen (aus einer Hand) in Plastiktüten (füllen Sie eine Tasche in 100 x 150 mm) und sofort im Kühlschrank bei 4 ° C, sobald die Blumen gesammelt werden.
   Hinweis: Die aktiv - Extraktion wird von Leandro Et al.geändert. (2003) ¹⁶.
2. Entfernen Sie vor der Extraktion keine verschlechterten, beschädigte, Kranken Blüten zu, dann mit gesunden Blüten entfernen der Eierstöcke, Kelchblätter und fruchtbaren mit gebogenen Pinzette (45° Pinzette) und entsorgen. Verwenden Sie nur die übrigen Organe (Corolla, Stigma, Stil und Staubfäden) für aktiv - Extraktionen. Gaze (150 x 150 mm) schneiden innerhalb eines 7 x 7 mm-Trichters, legen Sie in einem sauberen 50 mL Zentrifugenröhrchen und beiseite stellen.
3. Kombinieren Sie 1 Teil verarbeitet Blumen, 9 Teile SDW (1 wt: 9 Vol-Verhältnis) in einem Mörser. Schleifen Sie vorsichtig mit einem Stößel für 30 s (darauf achten, dass die Proben nicht vollständig pulverisieren). Resultierende Zellstoff durch vorbereitete Gaze/Trichter abseihen und sammeln in Zentrifugenröhrchen (50 mL). Reinigen oder neue Mörtel/Stößel zwischen jeder Extraktion mit 95 % EtOH und warmem, fließendem Wasser zu verwenden.
4. Bereiten Sie einen Apparat Vakuumfiltration: Buchner Trichter, Vakuumfilter Erlenmeyerkolben (bis zu 1.000 mL Fassungsvermögen), 55 mm Kreis Filterpapier und Vakuum Schlauch/Quelle zu sammeln. Eine geeignete Größe Buchner Trichter Filterpapier hinzu und legen Sie oben auf den Kolben dann verbinden Apparat zu einem Wasser / Saug-Quelle über Vakuumschlauch und beiseite.
5. Die Heidelbeere floral Extrakte eine weitere Klärung durch Zentrifugation für 10 min bei 8.055 X g. Überstand Gießen Sie ab, in vorbereitete Vakuumfilter Apparat, schalten Sie Vakuumquelle, Filtern Sie überstand zu, dann gießen Sie Flasche Inhalt in einem neuen Zentrifugenröhrchen (50 mL). Reinigen Sie alle Teile der Vorrichtung zwischen jeder Filtration mit 95 % EtOH und warmem, fließendem Wasser. Weitere Filter durch eine Spritze mit einer 0,22 µm Porengröße, Acetat, sterilisieren, Filter in einem neuen Zentrifugenröhrchen (50 mL) angepasst.
   1. Für die Cranberry floral-Extrakte nur Vakuum-Filter durch Filterpapier und Flasche Inhalt in einem neuen Zentrifugenröhrchen (50 mL).
6. Daraus resultierende Vorbereitung bezeichnet man als aktiv- floral Extrakt (aktiv -FE). Speichern Sie alle Wasser-basierte floral Extrakte (aktiv- passiv-, Regenwasser-Sammlungen) bei-20 ° C in 5-50 mL-aliquoten bis zum experimentellen Gebrauch. Wiederholen Sie Extraktionen mit mehreren Proben (mindestens 3 Extraktionen pro Probentyp), um Wiederholungen zu bieten.

3. passive , wässrige Extrakte Floral ( pass -FE) ¹⁶

Hinweis: Siehe ergänzende Film 2.

1. Hand sammeln ganze Heidelbeere Blumen (50 g) wie oben beschrieben, und im Kühlschrank nach dem sammeln. Vor der Extraktion keine verschlechterten, beschädigte, Kranken Blüten entfernen Sie und nur die fruchtbaren von intakten Blume. Kühlen Sie vorbereitete Proben, bis die passiv - Absauganlage, wie unten beschrieben, ist.
2. Spülen Sie alle Komponenten vor, mit 95 % Ethanol (EtOH) und warmem, fließendem Wasser zu verwenden, um Kontaminationen (Kunststoffgitter Blatt, zwei Kunststoffgitter Körbe, Glas-Backform und Nebel Pumpflasche) zu vermeiden. Auch bereiten Sie ein 4-Layer-Gaze/Trichter/50 mL Zentrifugenröhrchen für jede Extraktion wie oben beschrieben (im Schritt 2.2) und beiseite.
3. Bereiten Sie das Sieb: Legen Sie ein Kunststoffgitter Blatt (aka klar bar Matten) in einem Kunststoffgitter Korb (114 x 102 mm). Legen Sie einen zweite, identische, Netz-Korb umgedreht (invertiert) in einen Glas-Backform (127 x 229 mm) (zur Vermeidung von Blüten sitzen in SDW) und das Netz Blatt mit Korb auf. Fügen Sie 50 g vorbereitete Blumen in das Sieb.
   Hinweis: Alternativ können kleine Reagenzglas [Reinigung] Körbe anstelle der ursprünglich verwendeten Kunststoffgitter Körbe verwendet werden (alte, grüne, Erdbeer Netz Pint Körbe sind oft schwer zu beziehen).
4. Gleichmäßig Nebel Blüten mit 250 mL mittels einer Pumpe Flasche Nebel und Abfluss in der Glas-Backform zu erfassen. Dann abseihen Sie Filtrat durch die vorbereitete Gaze/Trichter in eine saubere Zentrifugenröhrchen. Daraus resultierende Vorbereitung bezeichnet man als passiv- floral Extrakt (Pass -FE); Speichern Sie nach oben (Schritt 2.6).
5. Reinigen Sie alle Teile zwischen jeder Extraktion mit 95 % EtOH und warmem, fließendem Wasser. Extraktionen mit mehreren Proben Wiederholungen (mindestens 3 pro Probentyp) zu wiederholen.

(4) Chloroform-basierte Floral Extrakte (ch-FE) ¹⁷

1. Sammeln Sie Heidelbeere und Cranberry Blumen wie pro oben (Schritt 2.1) und bereiten Sie Blumen für die Extraktion (Schritt 2.2, unvorbereitet Gaze/Trichter). Halten Sie zubereitete Blumen gekühlt bis vor dem Gebrauch.
   1. Jede Arbeit mit Chloroform muss unter einem Abzug aus Gründen der Sicherheit durchgeführt werden. Dazu gehören die Vorbereitung der Materialien / Glaswaren, Extraktionsverfahren und Bioassay Leitwert (Schritte mit ch-FE).
2. Reinigen Sie alle Teile mit 95 % EtOH zweimal, dann zweimal mit Chloroform Verunreinigung für jede Extraktion: Kultur Glasröhren, 2 Glas Becher, kleine Edelstahl-Bildschirm und einem [Glaszylinder] graduate Gewinde. Beiseite stellen und trockenen Kopf. Spülen Sie Polytetrafluorethylen (PTFE) ausgekleidet Kappen zweimal mit 95 % EtOH nur (Chloroform schädigt die Obermaterialien der GAP) und zum Trocknen beiseite.
3. Kombinieren Sie 1 Teil verarbeitet Blumen, 9 Teile Chloroform (1 wt: 9 Vol-Verhältnis) in ein Becherglas (Blumen dann Chloroform), sanft Wirbel für 30 s und Belastung durch einen Edelstahl-Bildschirm in das zweite Becherglas. Gießen Sie ch-FE aus der zweiten Becherglas Kultur Glasröhre (10-15 mL) und kleben Sie die PTFE-Kappe. Wickeln Sie die Kappe mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern.
4. Dieses Präparat ist der Chloroform-basierte floral-Extrakt (ch-FE). Probe in der Dunkelheit (Verringerung der leichten Abbau) bei 4 ° C bis zum experimentellen Gebrauch zu speichern. Extraktionen mit mehreren Proben Wiederholungen (mindestens 3 pro Probentyp) zu wiederholen.

(5) Sammlung von Regenwasser von Blueberry Blumen (BB Rw-FE)¹⁶

Hinweis: Die Heidelbeere floral Regenwasser Sammelvorrichtung besteht aus einer Luft Pistole Einweg-Spray Farbbecher mit Anschlussadapter (Cup: Innengewinde, Adapter: Stecker-Stecker-Thread), 50 mL Zentrifuge Röhren (Polypropylen), Parafilm und Kunststoff beschichtete Drähte ( Standard-Telefon-Draht, interne Einzeldraht Strang Inhalt).

1. Wählen Sie mehrere Positionen in einem Heidelbeere Busch, Regenwasser laufen weg von Blumen vor der Erstellung der Kollektion Geräte zu erfassen. Dazu gehören direkt unter Blütenstände (Blume), die eigentliche Basis des Busches (Krone). Rekord Durchmesser der Stämme (im Bereich von 1 bis 5 cm) an ausgewählten Standorten, da dies bestimmen die Größe der Löcher für Gerät Anlage, nachfolgend beschriebenen verwendet.
2. Für jeden ausgewählten Standort erstellen einer Sammelvorrichtung. Zuerst bohren Sie ein Loch an der Unterseite einer Tasse Spray (wo die Tasse auf dem Gewinde Öffnung Kurven) zu den entsprechenden Stammdurchmesser mit einem Schritt-Bit mit einer Bohrmaschine verbunden. Dann schneiden Sie eine gerade Linie von der Spitze des Thehole bis zur Mündung des Spray-Cup. Bohrungen Sie 4 äquidistant (groß genug, um Gewinde Kunststoff beschichtetem Draht), an der Mündung des Spray-Cup, und schließen Sie ein Ende der Kunststoff beschichtete Drähte einseitig frei verlassen.
3. Bohren Sie ein Loch groß genug, um thread-Paint Sprayer Cup Adapter in einem 50 mL Zentrifuge Kappe Deckel. Versiegeln Sie Adapter Threads mit Parafilm um auslaufen zu verhindern. Befestigen Sie das Zentrifuge GAP und Gewindeteil der Sprayer-Cup. Befestigen Sie die schätzungsweise 50 mL Zentrifugenröhrchen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 5.3 5.4 um mehrere Geräte nach ausgewählten Standorten, mindestens 4 Sammlung Geräte pro Probenahmeort zu erstellen.
5. Bereitstellen Sie Geräte an ausgewählten Standorten durch Beugung Sprüher Tassen auf Stielen passen. Richten Sie die Schneidenseite des Spray-Cup nach oben mit Kunststoff beschichteten Drähte mit anderen Stämmen verbunden (um sicherzustellen, dass Wasser über Blumen erfasst wird). Befestigen Sie Parafilm keine Öffnungen, die Regenwasser gelangen könnte. (Ergänzende Abbildung 3 zusätzliche Abbildung 4, ergänzende Abbildung 5und ergänzende Abbildung 6).
6. Label Röhrchen mit Bereitstellung Datum / Uhrzeit. Nach einem Regen-Ereignis, entfernen und ersetzen (Röhre) Bodenbereich des die Zentrifugenröhrchen (beschriften Sie Datum / Uhrzeit der Sammlung). Abfluss-Sammlungen (Heidelbeere Regenwasser floral Extrakt (BB Rw-FE) genannt) im Inneren zu bringen und Vakuum-Filter (Filtration beschriebenen Schritte 2,4-2,5). Store als oben (Schritt 2,6), bis in eine wässrige Bioassay verwendet.

6. Erhebung von Regenwasser von Cranberry Blumen (CB Rw-FE)

1. Die floralen Regenwasser Sammelvorrichtung in Cranberry besteht aus einem 7 X 7 cm Polypropylen Trichter, 50 mL Zentrifuge Röhren (Polypropylen), Parafilm, und 4 Standard, Kunststoff beschichtet Twist Bindungen (pro Gerät).
2. Zunächst Wärme Punktion 8 äquidistant Löcher (Durchmesser von Twist Ties) um die Mündung des Trichters mittels Metall Sonde. 4 Löcher stecken Sie Twist Beziehungen. Legen Sie die anderen Enden an dieser Löcher entgegengesetzte Position, bilden ein ordentlich Kreuzung Muster. Trichter nach unten-Stamm mit Parafilm wickeln und beiseite stellen.
3. Bohren Sie ein Loch groß genug, um den Trichter nach unten-Stamm in ein 50 mL Zentrifuge Kappe mit einem Schritt-Bit einfügen. Vorbereitete Trichter in die Zentrifuge Haube einlegen. Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.3 um mehrere Geräte, ein Minimum von 4 Sammlung Geräte pro Probenahmeort zu erstellen.
4. Bereitstellen Sie beschriftete (Datum/Uhrzeit) Geräte in ausgewählten Cranberry Mooren. Verstauen Sie ordentlich zwei Blume Lager Blütenstände (bekannt als Pfosten) unter die gekreuzten Kunststoff Dreh-Bande. Dann vertikal richten Sie das Gerät durch piercing die Zentrifugenröhrchen in der Cranberry Baldachin (ergänzende Abbildungen 7-8, ergänzende Movie 3 aus).
5. Nach Regenfällen oder an der Decke Bewässerung entfernen und ersetzen (Röhre) Bodenbereich des die Zentrifugenröhrchen (beschriften Sie Datum / Uhrzeit der Sammlung). Abfluss (bezeichnet als Cranberry Regenwasser floral Extrakt (CB Rw-FE)) innen zu bringen und Vakuum-Filter (Filtration beschriebenen Schritte 2,4-2,5). Store als oben (Schritt 2,6), bis in eine wässrige Bioassay verwendet.

(7) Bioassay mit Wasser basierte Floral extrahiert^15,16 (aktiv-FE, pass-FE, Rw-FE)

Hinweis: Siehe Abbildung 1.

1. Diese Bioassay ist in einer Laminar-Flow-Haube vorbereitet. Materialien vorbereiten: dreifach spülen Glasdeckgläser mit 95 % EtOH und mit Luft trocknen, dann beiseite. Papier-Handtuch-Festplatten auf der Innendurchmesser eine Standardzelle Kunststoff-Kultur-Gerichte (9 cm) geschnitten. 2 Lagen Papier Datenträger innerhalb von Kultur Speisen und Tränken mit 2 mL SDW.
2. Bereiten Sie mindestens 5 mL eines 1.0 X 10⁵ Konidien pro mL SDW Spore Suspension (C. Fioriniae) nach oben (Schritt 1.2-1.4), beiseite stellen. Als nächstes mischen Sie gleiche Volumina der SDW und wasserbasierte floral Extrakt in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie ein gleiches Volumen der Spore Aussetzung zu den vorbereiteten 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen (SDW und FE); die daraus resultierende Vorbereitung bezeichnet man als eine wässrige Behandlungsansatzes. Lassen Sie für das Steuerelement FE Teil Weg und ersetzen Sie durch SDW, conidial Konzentrationen konsistent zu halten.
   Hinweis: die Portionsgröße ist abhängig von Anzahl der Wiederholungen und Zeitpunkten. In der Regel überschreiten Teile 500 µL nicht. Sobald Konidien und FE kombiniert werden hat die Biotest begonnen, 0 h nach Impfung.
3. Legen Sie die vorgereinigten Glasdeckgläser auf die getränkte Papiertücher innerhalb der Zelle Kulturschale. Legen Sie einen 40 µL Tropfen der wässrigen Behandlungsansatzes auf der Mitte von einem Deckgläschen. Wiederholen Sie für die gewünschten Behandlungen, einschließlich der Kontrolle, in der Nähe der Zelle Kulturschale. Wiederholen Sie in separaten Zelle Kultur Gerichte für Replikationen (mindestens 3) und Zeitpunkte (jedes Gericht ist für 1 Punkt). Sobald alle Behandlungen und Wiederholungen verzichtet wurde, legen Sie alle replizierten Zelle Kultur Gerichte in einem versiegelten Kunststoff-Behälter (30 x 13 x 7 mm) und bei 25° C im Dunkeln inkubieren.
4. 10 µL ein Fixiermittel wie Lactophenol Baumwolle-blau (20,0 g Phenol Kristalle, 20,0 mL 2,5 % Milchsäure, 40,0 mL Glycerin, 0,05 g Baumwolle blau) hinzufügen zu vorgegebenen Zeitpunkten, die Tröpfchen, Wachstum zu stoppen und semi-Erhaltung der Halterung.
   1. Warten Sie 2 h 0 h-Zeit-Punkt zu sammeln, da dies conidial Haftung auf der Glasoberfläche ermöglicht aber nicht lang genug für conidial Keimen ist. Fügen Sie zu allen anderen Zeitpunkten Fixiermittel zum entsprechenden Zeitpunkt hinzu.
5. Sobald ein Fixiermittel hinzugefügt wurde, invertieren Sie sorgfältig Deckgläsern, indem sie Tropfen Seite nach unten auf einen Glas-Objektträger zur mikroskopischen Untersuchung (1 Deckglas pro Folie) zu erleichtern. Wenn alle Deckgläsern auf Glas-Objektträger sind, lassen sie sich und teilweise trocken in der Fluss-Haube für 20 Minuten.
6. Graf präsentieren alle Konidien (total Konidien) auf das Deckglas (primäre Konidien, gekeimte Konidien und neu gebildete sekundäre Konidien) sowie Appressoria bei beiden 400 X Vergrößerung (Zählung 16 Felder) oder 200 X (zählen 4 Felder), insgesamt eine Fläche von 3,808 mm ². gesamte Bioassay für statistische Analysen zu replizieren. Analysieren Sie für Assays mit wasserbasierten FE Daten wie im Waller Et Al. beschrieben 2017¹⁶, in der Regel als mittlere Graf/mm² (insgesamt Konidien oder Appressoria) anzeigen.

8. Bioassay mit Chloroform-basierte Floral extrahiert (ch-FE)¹⁷

Hinweis: Siehe Abbildung 2.

1. Bereiten Sie Materialien und Zell-Kultur-Gerichte wie pro oben (Schritte 7.1). Darüber hinaus eine gleiche Anzahl von Van Tieghem Zellen (VanT.) spülen (8 mm OD, 6 mm ID) auf Deckgläsern, sowie eine Glaspipette (1 mL mit 1 µl Schritten) innerhalb einer Abzugshaube (zweimal mit 95 % EtOH dann zweimal mit Chloroform), und beiseite stellen.
2. In Laminar-Flow-Haube, mit einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch fügen Sie zwei gleiche Volumina (mindestens 500 µL-Portionen) der SDW und 1 Volumen von Spore Aussetzung, dann beiseite stellen. Dies ist die wässrige Behandlungsansatzes für ch-FE Bioassays.
3. Platzieren Sie in einer Dampfhaube eine VanT. Zelle auf einem Glas Deckgläschen in der Kulturschale bereit Kunststoff Zelle. Verzichtet (Glaspipette) 33 µL des gewünschten ch-FE in der Mitte der Zelle Van T. (berühren Sie nicht die Wände der VanT. Zelle; für die Kontrollbehandlung hinzufügen jungfräulichen Chloroform) und trocknen lassen. Wiederholen Sie in getrennten Zellen Kultur Gerichte für Replikationen (mindestens 3).
4. Ch-FE getrocknethat, verzichten Sie 99 µL der zubereiteten wässrigen Behandlungsansatzes mit einer standard-Pipette in die Mitte der VanT. Zelle, dann schließen alle Kultur Gerichte Zelle. Sobald die wässrige Behandlungsansatzes in Kontakt mit den getrockneten ch-FE Behandlungen gekommen ist, hat die Biotest begonnen, 0 h nach Impfung.
5. Sobald alle Behandlungen und Wiederholungen verzichtet wurde, legen Sie alle (geschlossenen) Zelle Kultur Gerichte in einem versiegelten Kunststoff-Behälter (30 x 13 x 7 mm) und bei 25° C im Dunkeln inkubieren.
6. Fügen Sie zu vorgegebenen Zeitpunkten 15 µL eines Fixiermittels (Lactophenol Baumwolle-blau hinzu) der VanT. Zelle und lassen Sie sitzen für mindestens 5 min, angemessene Pilz Färbung zu versichern. Entfernen Sie nach dieser Zeit vorsichtig die VanT. Zelle und Schritte Deckglas Inversion und Daten Akquisition (Schritte 7,5-7,6). Folgen Sie für die Datenanalyse Methoden beschrieben in Gager 2015¹⁷, in der Regel anzeigen von Daten als Appressorium Bildung, das ist das Verhältnis der gesamten Konidien, Appressoria in der Gegend beobachtet (3,808 mm²) gezählt.

9. Cranberry Phänologie-basierte Extraktionen¹⁷

1. Hand Cranberry Blumen sammeln (im Juni; 100 g), unreife Frucht (zweimal; Juli und August; 200 g), und Cranberry Früchte bei der Ernte Reifen (Oktober; 200 g), legen Sie in entsprechend großen Plastiktüten und im Kühlschrank bei 4 ° C sofort nach der Entnahme. Walten Sie die Kontamination, skizzierten (Schritt 2.1).
   Hinweis: Es werden zusätzliche Pflanzenmaterial zu jeder Zeit gesammelt, aber davor hüten, diese Beträge offensichtlich Pilz infizierten Eierstöcke und Obst (zeigt Symptome und Anzeichen der Krankheit) zu extrahieren.
2. Entfernen Sie vor der Extraktion einer verschlechterten, beschädigte, Kranken Blüten, dann mit nur gesunde Blumen, die Kelchblätter, fruchtbaren, Blumenkronen, Narben, Stile und Staubblätter mit gebogenen Pinzette (45° Pinzette) entfernen und entsorgen Sie alle, aber die Eierstöcke. Sobald Eierstöcke erhoben werden, führen die Chloroform-basierte Extraktion bei einer 1 wt: 9 Vol-Verhältnis (siehe Schritte 4.2-4.4, mit nur Eierstöcke). Proben zu speichern, bis alle anderen Extraktionen abgeschlossen, sind also bis Bioassay Leitwert.
3. Sobald Obst gesammelt werden, durchführen eine Chloroform-basierte Extraktion (Schritte 4.2-4.4 mit gesammelten Obst statt Blumen), aber fügen Sie 10 g Früchten zu 90 mL Chloroform und einmal extrahiert, lassen Sie die Lösung zu verdampfen, 9 mL (was zu einem 10 g: 9 mL wt : Vol-Lösung).
4. Stellen Sie Obst Extraktionen, sofort nach dem Sammeln im Juli, August und Oktober. Speichern Sie als pro oben (Schritt 4.4), bis alle Extraktionen gesammelt werden. Nach der letzten Frucht Chloroform-basierte Extraktion, unterliegen alle Penology basierende Chloroform Extrakte für diese Probe zu Chloroform-basierte Bioassay gesammelt und entsprechend zu analysieren (Schritte 8.1-8.6).

Ergebnisse

Die hier vorgestellten Ergebnisse sind ein paar Beispiele für die vielen Tests, die mit dieser Methodik durchgeführt werden können. Abbildung 1 ist ein illustrierter Führer zu den wasserbasierten FE Bioassay und wird ergänzt durch Abbildung 2 die zu Chloroform-basierte FE Bioassay folgt. Abbildung 3 bietet eine visuelle Anleitung, was auf mikroskopische Beurteilung des C. Fioriniae 24 h, in beiden Wasser und Chloroform-basierte Bioassays (gegenüber SDW-Kontrollen) erwartet werden können. Abbildung 4 beschreibt eine 24 h-Zeitverlauf-Studie mit C. Fioriniae in Anwesenheit der Cranberry Sorte "Stevens" ch-FE und bietet visuelle Referenz zu einem Import-Ergebnis dieser Forschung: FE verringert den Zeitaufwand zu Infektion Strukturen im Vergleich zum SDW. Abbildung 5 ist ein Beispiel für Daten, die aus einem Deckglas Bioassay mit Cranberry floral Regenwasser Abfluss (CB "Flower" Rw-FE). Abbildung 6 stellt ein weiteres wichtiges Ergebnis: floral Eierstock ch-FE war viel mehr stimulierende als Obst ch-FE, was die Bedeutung von Bloom im Lebenszyklus des C. Fioriniae. Zusätzliche Fotos und Filme bieten wichtige Visuals von die Blumen verwendet in den Extraktionen und floralen Regenwasser Sammlung Geräte/Bereitstellung, zusätzlich zu Filmen, die das aktive und passive - Extraktion (visualisieren Wasserbasis) Prozesse.

Abbildung 1 : Allgemeine Übersicht über die wasserbasierten floral extrahieren (FE) Bioassay. Dieser Assay für wasserbasierte floral Extrakte mit Heidelbeere und Cranberry Blumen genutzt wurde: aktiv -floral Auszüge (aktiv-FE), passiv -floral Auszüge (pass-FE) und floralen Regenwasser Abfluss (Rw-FE). -FE Teil bildet in der Regel den experimentellen/Variable Faktor. Umgekehrt - FE Teil kann konstant bleiben und Zeit Punkte/Stunden Post-Impfung kann ausgewertet werden. Präferenz hat 4 Feld-Analyse bei 200 X Vergrößerung erzielt. Abkürzungen: Sterile deionisiertes Wasser, SDW; Fläche pro Gesichtsfeld, A. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Allgemeine Übersicht über die Chloroform-basierte floral extrahieren (ch-FE) Bioassay. Dieser Test wurde für Heidelbeeren und Preiselbeeren (Eierstöcke, Blumen und Früchte) verwendet. Nur eine Art von wässrigen Behandlungsansatzes diente in diesem Assay, 1 Teil Spore-Aufhängung, 2 Teile SDW (zu conidial Konzentration durch ch-FE Verdunstung konsistent zu halten). Dieser Test kann verwendet werden, um mehrere ch-FE (Wachse aus verschiedenen pflanzlicher Oberflächen) oder mehrere Zeit Punkte/Stunden nach Impfung mit einem einzigen ch-FE zu vergleichen. Abkürzungen: Sterile deionisiertes Wasser, SDW; Van Tieghem [Glas] Zellen, VanT. Zelle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Visueller Vergleich der Colletotrichum Fioriniae in Gegenwart von Wasser-basierte FE und ch-FE. In diesem Assay-Heidelbeere 'Bluecrop' (aktiv-FE, wässrige) (Pilz Isolat: BB #10) und Cranberry "Stevens" Chloroform-basierte (ch-FE) (Pilz Isolat: CB-PMAP182) floral Extrakte SDW Kontrollen verglichen wurden. Eine dramatische Zunahme der sekundären Conidiation (Ringe) und Appressorium Bildung (Pfeilspitzen) wurden beobachtet, beim Vergleich von Konidien in Anwesenheit von SDW (Steuerung) (A) auf aktiv-FE (B) bei 24 h nach Impfung. Sekundäre Conidiation war jedoch nicht so offensichtlich, vergleicht man das Chloroform Bioassay SDW-Steuerelement (C) ch-FE (D); C. Fioriniae Wachstum verlagert vielmehr Appressorial Bildung. Gezeigt wird eine gemeinsame Antwort auf jede Extraktion Art, wässrige und Chloroform-basierte, unabhängig von der Host/Blumenarten beschrieben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Zeitverlauf Studie (24 h) mit Colletotrichum Fioriniae in Anwesenheit von ch-FE. In diesem Test wurden ein SDW Kontrolle (A-D) und Cranberry "Stevens" ch-FE (E-F) auf 0, 6, 12 und 24 h nach Impfung (ein Beispiel von Variablen Zeitpunkten anstatt zu vergleichen mehrere FE) Sichtprüfung. Appressorium Formation (Pfeilspitzen) begann um 6 Uhr in der ch-FE und stetig in der gesamten nachfolgenden Zeitpunkte. Diese Ergebnisse entzieht sich als wichtiger Faktor der Erreger Biologie während der Blütezeit: Blumen reduzieren den Zeitaufwand Infektion um Strukturen zu bilden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Grafische Darstellung der Daten mit Rw-FE in einem Bioassay. Regenwasser laufen weg von Cranberry Blumen (CB "Flower" Rw-FE) und Jungfrau Regenwasser, das nicht, jede Cranberry Pflanzengewebe ("Ground" Rw-FE) aus einem Einzelereignis Benetzung plus ein standard aktiv, Cranberry wasserbasierte floral-Extrakt (CB aktiv berührt hatte -FE) (Positivkontrolle) und SDW (Negativkontrolle) waren eine wässrige Deckglas Bioassay unterzogen und bewertet für C. Fioriniae Wachstum. CB "Blume" Rw-FE hatte das gleiche Maß an sekundäre Conidiation und Appressorium Bildung als die standard CB aktiv-FE in 24 h nach Impfung, darauf hinweist, dass die Sammlung Geräte effektiv bei der Erfassung von floraler Stimulanzien während freigegeben waren ein Benetzung-Event. Insgesamt Konidien besteht aus primären (hinterlegt), Konidien und neu gebildete sekundäre Konidien. Buchstaben geben an, dass signifikante Unterschiede bei p < 0,05 nach Fischers wenigsten signifikanten Unterschied testen (LSD); Großbuchstaben, total Konidien; Kleinbuchstaben, Appressoria. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : Cranberry Phänologie basierte ch-FE Bioassay, Sichtprüfung. Disease-Management für Obst Pilze oft Fäulnis beinhaltet Fungizidanwendungen Blüte Zeit. Hier wurden Cranberry Chloroform-basierten-Extrakte (ch-FE) aus mehreren Entwicklungsstadien von Cranberry ("Stevens") für die Wirkung der Oberfläche Wachse auf C. Fioriniae in 24 h nach Impfung visuell bewertet. Eierstöcke gesammelt im Juni (A), unreife Früchte gesammelt im Juli und August (B, C), geernteten Früchte gesammelt im Oktober (D), und ein SDW-Steuerelement (E) für Appressorial Bildung (Pfeilspitzen) geprüft wurden. Eierstock ch-FE hatte die größte Stärke der Appressorial Formation, darauf hinweist, dass diese Pflanze Phänologie (Bloom) von entscheidender Bedeutung für den Lebenszyklus von C. Fioriniae. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung1: Blueberry Blütenstand. Heidelbeere Blumen sammelten für Extraktionen in voller Blüte (April-Mai in New Jersey, USA) (siehe 'Bluecrop'). Beachten Sie die Überlappung der Blumenkronen/Eierstöcke aus angrenzenden Blumen und die Gesamtarchitektur des Blütenstandes im Vergleich zu ergänzenden Abbildung2 (Cranberry aufrecht). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung2: Cranberry aufrecht. Cranberry Blumen wurden für Extraktionen in voller Blüte (Juni-Juli in New Jersey, USA) (siehe "Stevens") gesammelt. Beachten Sie die abwechslungsreiche Blume Stufen auf einen einzigen Cranberry Blütenstand (aufrecht) und die Haken, Wassertropfen, die Beibehaltung der Form des Corolla. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 3: Blueberry Regenwasser Bereitstellung (Blume). Heidelbeere floral Regenwasser Sammelvorrichtung, platziert direkt unter einem Cluster der Blütenstände abgeschlossen. Beachten Sie die kunststoffummantelten Draht verwendet, um das Gerät vertikal auszurichten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 4: Blueberry Regenwasser Bereitstellung (Stem). Abgeschlossene Heidelbeere floral Regenwasser Sammelvorrichtung, halbem Weg nach unten den Stamm zwischen Blütenstands und die Krone des Busches platziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 5: Blueberry Regenwasser Bereitstellung (Krone). Heidelbeere floral Regenwasser Sammelvorrichtung, platziert an der Basis des Busches (Krone) abgeschlossen. Hinweis Kunststoff beschichtete Drähte können ggf. nicht entfernt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 6: Blueberry Regenwasser Bereitstellung (Boden). Natives Regenwasser Sammelvorrichtung, platziert neben Heidelbeere Büsche abgeschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 7: Cranberry Regenwasser Bereitstellung (Nahaufnahme). Cranberry floral Regenwasser Sammelvorrichtung, mit zwei Ständern, die versteckt unter der ordentlich gekreuzten Kabelbinder abgeschlossen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Abbildung 8: Cranberry Regenwasser Bereitstellung. Multiple abgeschlossen Cranberry floral Regenwasser Geräte in einem Moor eingesetzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Film 1: aktive, auf Wasser basierende floral Extrakte (aktiv -FE). Zusätzliche video-Unterstützung folgende Schritte 2,3-2.5.1. Heidelbeere 'Bluecrop' Blumen wurden verwendet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Ergänzende Movie 2: Passive, wasserbasierte floral Extrakte (pass-FE). Zusätzliche video-Unterstützung folgende Schritte 3.3 3.4. Heidelbeere 'Bluecrop' Blumen wurden verwendet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Ergänzende Movie 3: Bereitstellung von Cranberry floral Regenwasser Sammlung Geräten. Zusätzliche video-Unterstützung nach Schritt 6.4. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Diskussion

Die Erkennung der C. Fioriniae auf florale Extrakte (FEs) Bioassays wurden entwickelt für die Heidelbeere und Cranberry Frucht Rot Pathosystems aber an anderen Gartenbaukulturen leicht angepasst werden können. Das oben beschriebene Protokoll wurde erwerben viele wichtige Datensätze, darunter wertvolle, aber nicht beschränkt auf: FE Auswirkungen auf mehrere Isolate von zahlreichen Krankheitserregern, Zeitverlauf Informationen zu Pilzwachstum Stadien in Anwesenheit von verschiedenen FEs Vergleich der Extraktionstechniken, Überprüfung der einzelnen Chemikalien auf C. Fioriniae Wachstum und Differenzierung, Bewertung der einzelnen Blume Orgel extrahiert, Auswirkungen der Temperatur auf C. Fioriniae während in Gegenwart von FE, Effekte Phänologie abhängigen Wachs Extraktionen und floralen Regenwasser Effekte. Durch den Einsatz dieser Techniken hat Daten generiert auch ein viel klareres Verständnis von C. Fioriniae Leben inszeniert und teilweise erläutert, warum die Blütezeit so entscheidend für die Kontrolle über viele Früchte faulen Krankheitserreger ist.

Zunächst alle Blumen auf die aktiveidentisch verarbeitet wurden-FE, aber die Extraktion in Richtung unter Verwendung der ganze Blumen verschoben hat. Floral Dissektion war zeitaufwendig und hatte wenig Einfluss auf die Bioaktivität der daraus resultierenden FEs. Können jedoch einzelne Blütenorganen und haben wurde bewertet mit dieses Protokoll, aber großer Sorgfalt getroffen werden, um nicht vollständig die floralen Geweben (Supplemental Film 1, bei Vorsichtsmaßnahmen detailliert Schritt 2.3), Mazerat als dies unter Umständen freigegeben Pilze giftig/statische Verbindungen in der FE, die die mikroskopischen Bewertungen verfälschen könnte. Weniger invasive Extraktionen wie Pass -sind FE (Supplemental Movie 2) und Rw-FE jetzt günstiger wegen ihrer Leichtigkeit des Erwerbs. Darüber hinaus benötigen diese Extraktionstechniken nur Vakuumfiltration, biologisch aktiven floral chemische Signale zu erwerben.

Die Blumen in allen Extraktionen verwendet wurden in der Regel gekühlt für 0-3 Tage vor dem Auszug-Vorbereitung. Eine Herausforderung dieses Protokolls ist Zeitmanagement FE Umsatzes (Feldsammlung durch Speicherung von Auszügen). Dies wurde durch zahlreiche Proben aus unterschiedlichen Quellen und Termine verschärft. Gefrorene Blumen wurden nicht in echte Ausmaß, evaluiert, wie aufgetaute Blumen verschlechterten und verfärbt erscheinen. Jedoch sobald die wässrige FEs hergestellt worden sein, wiederholt Einfrieren und Auftauen, hat keine Wirkung gezeigt, auf die Bioaktivität der FE, so lange wie die FE sind schnell gefroren nach Bioassay Vorbereitung (tragfähige 3-jährige FE).

Chloroform-basierte Extraktion ermöglicht die Untersuchung der Erreger Antworten auf dreidimensionale Blumen/Früchte Oberfläche Wachse in einer zweidimensionalen Ebene über ch-FE Verdunstung am Glasdeckgläser. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass die tatsächliche Kristallstrukturen Wachse abgeschieden von der ch-FE identisch mit der Oberfläche sind aus denen sie erhoben wurden. Bedeutung, ergänzende Techniken sollten umgesetzt werden, wenn Pilz Reaktion auf spezifische Wachs Strukturen in Vivo der Schwerpunkt der Untersuchung sind. Chloroform-basierte Extrakte benötigen mehr Speicher Pflege als wässrige Extraktionen. Bewahrt, nicht nur die ch-FE Extrakte in der Dunkelheit die PTFE ausgekleidet Zellkultur tube Kappen und Parafilm Abdichtung wickeln müssen regelmäßig evaporative Dichtheit überprüft werden und bei Bedarf ersetzt.

Das Konzept der Überwachung floral Regenwasser wurzelt in der Idee der fortschreitenden ortsspezifische Krankheit Überwachungstools. Die Regenwasser-Sammlung-Geräte können auf viele andere Pflanze-Architekturen angepasst werden, so lange, wie der Sammelvorrichtung Regenwasser erfasst, die von Blumen ausgeführt hat. Dieser Ansatz bietet Informationen über ob florale Stimulation ist vor Ort zu einem bestimmten Zeitpunkt und in der gesamten Saison überwacht werden kann. Alternativ können Sammlung Geräte eingesetzt werden, an mehreren Standorten der Baldachin um festzustellen, wie weit floral Hinweise bei einem bestimmten Benetzung-Event gewaschen worden sind. In Zukunft werden Experimente, Rw-FE diktieren, wenn Fungizidanwendungen beginnen soll und wann sie sicher beenden können. Darüber hinaus ist durch die Überwachung der Phänologie abhängigen Wachs Extraktionen (Protokoll Abschnitt 9), wie wichtig es ist, dass die Blütezeit zur Biologie des Erregers noch deutlicher geworden. Dieser Abschnitt wurde auch aufgenommen, um demonstrieren die Flexibilität dieser Bioassays, Bereitstellung von Methoden, mit denen für Side-by-Side-Vergleich der Host Oberfläche Wachse, die zeitlich getrennt sind. Die Daten generiert mit floralen Extraktionstechniken und Bioassays stellen konkrete Indikatoren der Erreger Stimulation, spezifischen chemischen Klassen wichtig, Erreger Biologie und Ziele für die künftige Bekämpfungsstrategien.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter	VWR	101102-280	Blueberry floral extract (FE) clarification
200-1000 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
40-200 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
5-40 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter	Harbor Freight	97098	Blueberry rainwater (rw-)FE collection
Autoclave	Amsco	3011	Equipment, media preparation
Bar mesh matting (plastic mesh sheet)	Winco	BL-240	Passive (pass)-FE collection
Benchtop timer	Fisher Scientific	06-662-47	Equipment, FE preparation
Black pressure/vacuum hose	VWR	62994-795	Vacuum filter component
Buchner funnel	Coors USA	60240	Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks
Bunsen burner	-	-	Equipment
Calcium carbonate	Fisher Scientific	C64-500	Media component
Centrifuge	Sorvall	RC 5B Plus	Equipment
Centrifuge tubes (15 ml)	Fisher Scientific	05-527-90	Equipment
Centrifuge tubes (50 ml)	VWR	10025-694	Equipment, rw-FE collection
Cheesecloth (grade 50)	Fisher Scientific	AS240	Equipment, FE preparation
Chloroform	VWR	JT9175-3	Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free
Corn Meal Agar (CMA)	Fisher Scientific	B11132	Pre-mix media, isolate storage on slants
Cotton-blue stain	Sigma-Aldrich	61335	Lactophenol cotton-blue stain
Difco Agar	VWR	90004-032	Media component
Drill-press	Delta	-	Equipment, rw-FE collection
EASYpure LF Ultrapure water	Barnstead	D738	Equipment, deionized water source
Ethanol (95%)	-	-	Chemical
Filter flask (500 ml)	Pyrex	No. 5340	Vacuum filter component
Fume hood	Hamilton	-	Equipment, chloroform usage
Funnel (7 X 7 cm)	VWR	60820-110	Cranberry rw-FE collection, FE preparation
Generic glass slide	Fisher Scientific	22-038-101	Bioassay conductance
Generic plastic pump spray bottle	VWR	16126-454	pass-FE collection, at least 250 ml capacity
Glass cell culture tubes	-	-	Storage of ch-FE
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B	Bioassay conductance
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)	-	-	Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)
Glass-pipette (1-100 µl)	Hamilton Co. Inc.	#710	ch-FE bioassay
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Lactophenol cotton-blue stain
Hemocytometer	Bright-Line	5971R10	Equipment
Lactic acid	Sigma-Aldrich	W261106	Lactophenol cotton-blue stain
Laminar flow hood	Labconco	3730400	Equipment, sterile work environment
Metal probe (generic)	-	-	Equipment
Microcentrifuge tubes (2 ml)	Fisher Scientific	05-408-138	Aqueous treatment mixture storage and preparation
Microscope, Leica DMLB	Leica	020-519.010	Equipment
Mortar (ceramic)	Coors USA	60313	Vacuum filter component
Nitrile gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D	Flower collection
Paper disks (cut paper towels)	Office Basics	KCC01510	humidity control in bioassay
Parafilm	Bemis	PM-996	Plastic paraffin film
Pestle (ceramic)	Coors USA	60314	Vacuum filter component
Phenol crystals	Fisher Scientific	A92-100	Lactophenol cotton-blue stain
Plastic bags (~100 mm X 152 mm)	Uline	S1294	Equipment, flower refrigeration
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)	Fisher Scientific	FB0875712	(Petri dish), bioassay conductance
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps	VWR	60927-228	Storage of ch-FE
Pyrex beakers (100 ml)	Pyrex	No. 1000	Preparation of ch-FE
Pyrex bread-pan	-	-	pass-FE collection
Pyrex graduated cylinder	-	-	Equipment, FE preparation
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)	-	-	Bioassay conductance
Sharp-pointed dissecting scissors	Fisher Scientific	8940	Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks
Stainless steel mesh strainer	VWR	470149-756	Preparation of ch-FE
Step drill bit (step-bit)	Dewalt	-	Equipment, rw-FE collection
Sterile loop (combi-loop)	Fisher Scientific	22-363-602	Culture preparation
Telephone wire (internal wires)	-	-	Blueberry rw-FE collection
Test tube basket	VWR	470137-792	Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket
V8 Juice	Campbell's Soup Company	-	Fungal media component
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets	Donation	-	pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)
Vortex Genie (Vortex)	Fisher Scientific	12-812	Spore suspension preparation
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles	Whatman	1001-055	Vacuum filter component
White plastic twist ties (100 mm)	Uline	S-566W	Cranberry rw-FE collection