Colletotrichum fioriniae Развитие в воде и хлороформе основе черники и клюквы цветочные экстракты

Резюме

Здесь описаны bioassays, предназначенные для наблюдения за развитием грибкового патогена, Colletotrichum fioriniae, присутствии черники или клюквы цветочных экстрактов на стекло coverslips. Вода, хлороформ-, поле дождевой воды на основе и цветочные добычи, которые подробно методы а также понять, как эта информация может быть применена.

Аннотация

Точно контролировать фенологии в период цветения и временная динамика цветочные химические сигналы на грибковые фруктов, гниение патогенов, были разработаны цветочные извлечения методы и coverslip bioassays, используя Colletotrichum fioriniae. В черники и клюквы Этот возбудитель оптимально контролируется путем применения фунгицидов в период цветения из-за роли цветы в начальных стадиях инфекции. Протокол, здесь подробно описывает как цветочные экстракты (FE) были получены с помощью воды, хлороформ и поле дождевой воды-методы на основе для последующего использования в соответствующем bioassays coverslip стекла. Каждый FE служил предоставить другой набор информации: ответ C. fioriniae мобилизовал цветочные химические сигналы в воде (на водной основе), возбудитель ответ на цветок и поверхности воски плода (хлороформ основе) и контроль на местах за собранные цветочные дождевой воды, движущихся в vitro наблюдения сельскохозяйственной параметру. FE широко описан как либо или хлороформ водная, с соответствующей биопроб, описанные для компенсации присущи различия между этими двумя материалами. Дождевой воды, что бежать цветы были собраны в уникальных устройств для каждого урожая, намекая на гибкость и применения такого подхода для других культур систем. Bioassays, быстрый, недорогой, простой и предоставляют возможность генерировать пространственно-временных и участкам информации о присутствии стимулирующее цветочные соединений из различных источников. Эта информация будет в конечном итоге лучше информировать стратегии борьбы с болезнями, как FE уменьшить время, необходимое для инфекции происходит, таким образом обеспечивая понимание изменения рисков для возбудителя инфекции течение вегетационного сезона.

Введение

Colletotrichum fioriniae вызывает гнили плодов голубики (Vaccinium corymbosum L.) и большой американской клюквы (V. macrocarpon Айтон)^1,2. Этот возбудитель был недавно разделенное от C. acutatum видов комплекс^3,4,5,6 и возбудителя голубики антракноз и членом гнили плодов клюквы комплекс, помимо многочисленных других растений заболеваний во всем мире⁷. C. fioriniae имеет скрытые, hemibiotrophic образ жизни⁸, с инфекций во время цветения и симптом развития, не становится очевидным, пока плоды находятся в заключительной стадии созревания⁹. В черники и клюквы плоды гниют только адекватно управляется с фунгицидом заявлений в период цветения. Возбудитель Перезимовывает в спящие голубики цветочные почки весы¹⁰ и sporulates во время цветения. Конидий перемещаются во всем купола через дождь всплеск разгон^11,12 и нарастание посевным материалом был сильно коррелирует с Блум периода¹³. Ответ Colletotrichum видов цветов хост не уникален для Vaccinium, как цветы являются важными компонентами плодов цитрусовых пост Блум падение (ПФО)¹⁴ , а также¹⁵клубники антракноз, в обоих случаях причиной патогена на sporulate. Все эти случаи свидетельствуют о необходимости эффективных методов для оценки временнóй динамики цветочные химические сигналы на C. fioriniae и других патогенов, которые заражают во время цветения. Идеи, предоставляемые описанные здесь методы становятся все более ценным.

Этот протокол детали методов закупок, цветочные экстракт (FE) и проведет оценку ответов C. fioriniae FE через стекла coverslip bioassays^15,16. Цветочные добыча методы делятся на два основных типа; на водной основе экстракции (активных-FE, пассивный (перевал -FE) и поля на основе дождевой воды (rw-FE)) и на основе хлороформ (ch-FE)¹⁷ экстракции. На водной основе экстракции позволяют для осмотра воды мобилизованы цветочные химические сигналы. Эти мобилизовал сигналы являются скорее всего важными компонентами инфекции суда, поскольку FE значительно увеличивает скорость инфекции¹⁶, помимо влаги, необходимых для инфекции происходят. Кроме того они представляют более естественное состояние, как цветочные стимуляции могут быть вымыты всей пологом течение увлажнения событий, как отмечалось ранее в голубики и других культур систем^14,16. На основе хлороформ цветочные экстракции (ch-FE) также предоставляют ценную информацию, касающуюся возбудителя ответ на поверхности узла воски^17,18, разъяснение на ранних стадиях роста конидий, однажды на хранение на восприимчивы принимающих органов (т.е. цветы, яичников и развивающегося плода). Возбудитель ответ на сезонные изменения в узел поверхности воски также может контролироваться с помощью этого протокола. Соответственно bioassays приспособлены для работы с FE на водной основе или на основе хлороформ FE для смягчения присущи различия между этими двумя материалами.

Данные, полученные от bioassays показал, что на водной основе экстракции стимулировать более высокие уровни вторичных conidiation чем на основе хлороформ извлечений где окончательное appressorial ответ, поэтому о причастности нескольких соединений в FE. Интересно, что оба этих ответов роста наблюдались, когда использование дождевой воды, бежал прочь черники и клюквы цветы, указав несколько стимулирующее соединений могут быть вымыты с поверхности цветов. Таким образом мониторинг для цветочные стимуляции даст понимание вероятности успеха возбудителя в сельскохозяйственной системы.

Конечной целью настоящего Протокола является представить методологию для создания базовых биологическая информация о возбудителей грибковых растений в ответ на цветочные химические сигналы, а также вызывающей методологий, которые могут использовать этот цветочные информации для оказания помощи в процессы управления и принятия решений конкретных заболеваний.

протокол

1. грибковые изолятов и суспензий спор

1. Изолируйте Colletotrichum fioriniae от естественно зараженных принимающей¹⁹. Затем Храните чистых культур на скошенный агар (CMA) кукурузной муки. Поместите вилку культуры (от CMA наклонная) на стандартные пластиковые клетки культуры блюдо (9 см в диаметре) содержащий либо уточнить V8 сок агар (cV8A) (с изменениями от 1955 Миллер), или не уточнил V8 сок агар (V8A)²⁰. Когда колонии начинают sporulate, полоса конидий (оранжевый конидиальная массы) на другой cV8A или V8A содержащие клетки культуры блюдо (с стандартного цикла стерильные) производить высокой плотности аэроб культуры.
   Примечание: Любой протокол шаги с грибов должны выполняться в Ламинарный шкаф для уменьшения вероятности заражения грибковых культур и/или bioassays.
2. После того, как 7 дней роста, с помощью стандартного цикла стерильные собрать небольшое количество конидий из высокой плотности культуры (, слегка касаясь цикла конидиальная массы) и перемешать это в 15 мл пластиковых пробирок, содержащие 10 мл стерильной деонизированной воды (ТБО). Вихревой этот пример для 10 s, а затем с помощью стандартной пипетки окунуться вверх и вниз несколько раз далее смесь образца.
3. Затем поместите каплю vortexed образца на Горяева и оценки концентраций спор. Фото 5-10 поля на Горяева, получить среднее и умножить средний коэффициент соответствующие разрежения (т.е. 10 000), таким образом получение конидиальная концентрации на мл ТБО.
4. Затем с помощью объем (V) / концентрации (C) уравнение (V₁● [₁C] = V₂● [₂C]) отрегулируйте (с ТБО) до 1,0 X 10⁵ конидий мл ТБО с 5 мл окончательный объем. Это называется споро подвеска и производится только непосредственно перед использованием в любом биопроб.

2. активное, на водной основе цветочных экстрактов (активных -FE)^15,16

Примечание: См. дополнительная цифра 1, дополнительная цифра 2, дополнительная цифра 3и Дополнительные фильм 1.

1. Тщательно ручной сбор черники (апрель-май) и клюквы (июнь-июль) цветы во время их соответствующих пик цветения в поле (Дополнительные рис. 1). Носите и изменить нитриловые перчатки местоположениях (сортов/сорта/физического расположения) выборки подавляют кожи человека нефтяного загрязнения, а также перекрестного загрязнения между цветочных сортов. Место черники или клюквы цветы (от одного источника) в пластиковые мешки (заполнить мешок 100 x 150 мм) и сразу же хранить в холодильнике при температуре 4 ° C после того, как цветы собраны.
   Примечание: Добыча - активно изменяется от Леандро и др. (2003) ¹⁶.
2. До извлечения удалите любые ухудшилось, поврежденные, пораженные цветы, а затем с помощью здорового цветы Удаление яичников, Чашелистики и плодоножек с щипцы изогнутые (45о пинцет) и отменить. Используйте только остальные органы (corolla, стигма, стиль и тычинки) для активных - экстракции. Вырезать марлю (150 x 150 мм) и место в воронку 7 x 7 мм, поместить в чистой 50 мл пластиковых пробирок и отложите в сторону.
3. Смешайте 1 часть обработана цветы на 9 частей ТБО (1 Вт: 9 соотношение vol) в ступке. Осторожно растереть с пестиком для 30 s (Позаботьтесь, чтобы распылить не полностью образцы). Штамм результате пульпы через подготовленный марлю/воронку и собирать в пластиковых пробирок (50 мл). Очистить или использовать новый раствор/пестиком между каждой добыча с 95% EtOH и теплой проточной водой.
4. Подготовьте аппарат вакуумной фильтрации: собрать Buchner воронка, вакуумный фильтр колбу Эрленмейера (объемом до 1000 мл), 55 мм круг фильтровальная бумага и вакуумный шланг/источник. Добавление соответствующего размера Buchner воронка фильтровальная бумага и место на вершине колбу, а затем подключить аппарат к воде / всасывания источника через вакуумный шланг и отложите в сторону.
5. Дальнейшего уточнения цветочных экстрактов черники центрифугированием 10 мин на 8,055 x g. Слить супернатант в подготовленный фильтр Вакуумный аппарат, включите источник вакуума, фильтр супернатанта, затем вылить содержимое колбы в новых пластиковых пробирок (50 мл). Очистите все компоненты аппарата между каждой фильтрации 95% EtOH и теплой проточной водой. Дальнейшее фильтр через шприц адаптирована с 0,22 мкм размер поры, ацетат стерилизации, фильтр в новом пластиковых пробирок (50 мл).
   1. Клюква цветочные экстракты только вакуум фильтр через фильтровальную бумагу и залить содержимое колбы в новых пластиковых пробирок (50 мл).
6. Результате подготовка называется активной- цветочные экстракт (Активный -FE). Храните все на водной основе цветочные экстракты (Активные-, пассивный-, дождевой) при-20 ° C в 5-50 мл аликвоты до экспериментального использования. Повторите экстракции с несколько образцов (по крайней мере 3 извлечения каждого образца типа) для предоставления реплицирует.

3. пассивный , на водной основе цветочных экстрактов ( пройти -FE) ¹⁶

Примечание: Смотрите Дополнительные фильм 2.

1. Ручной сбор всей голубики цветы (50 g) выше и хранить в холодильнике после сбора. До извлечения удалите любые ухудшилось, поврежденные, пораженные цветы и только цветоносах в нетронутыми цветок. Охладите подготовленных образцов, до тех пор, пока пассивно - вытяжной системы, описанные ниже, находится в месте.
2. Промойте все компоненты до использования с 95% этанола (EtOH) и теплой проточной водой для предотвращения загрязнения (пластиковые сетки листа, две корзины пластиковые сетки, стеклянные ёмкости и туман бутылка насоса). Также подготовьте 4 слоя Марли/трубы/50 мл пластиковых пробирок для каждого извлечения как описано выше (на шаге 2.2) и отложите.
3. Подготовьте сито: место пластиковые сетки листа (ака ясно бар матирования) в корзину одной пластиковой сетки (114 x 102 мм). Переверните второй, идентичные, Сетка корзины (перевернутый) в стеклянных хлеб Пан (127 x 229 мм) (чтобы избежать цветы, сидя в ТБО) и место сетки листа содержащие корзины на вершине. Добавьте 50 г подготовленных цветов в сито.
   Примечание: в качестве альтернативы, небольшой тест трубки [чистки] корзины может использоваться вместо первоначально используется пластиковая Сетка корзины (старый, зеленый, клубника Сетка корзины пинта зачастую трудно источника).
4. Равномерно туман цветы с 250 мл с помощью насоса туман бутылки и захвата стока в стеклянные ёмкости. Затем процедите фильтрата через подготовленный марлю/воронку в чистых пластиковых пробирок. Результате подготовка называется пассивным- цветочные экстракт (перевал -FE); хранить как за выше (шаг 2.6).
5. Очистите все компоненты между каждой добыча с 95% EtOH и теплой проточной водой. Повторите экстракции с несколькими образцами предоставлять реплицирует (по крайней мере 3 каждого образца типа).

4. на основе хлороформ цветочные экстракты (ch-FE) ¹⁷

1. Сбор черники и клюквы цветы согласно выше (шаг 2.1) и подготовить цветы для извлечения (шаг 2,2, без подготовки марлю/воронку). Держите подготовлен цветы, охлажденный до использования.
   1. Любые работы с хлороформом должны быть выполнены в вытяжной шкаф по соображениям безопасности. Это включает подготовку материалов / посуда, процедуры извлечения и биопроб проводимости (шаги с помощью ch-FE).
2. Очистить все компоненты с 95% EtOH дважды, а затем дважды с хлороформом для предотвращения загрязнения для каждого извлечения: резьбовых стеклянных трубок культуры, 2 стеклянные стаканы, экран маленький из нержавеющей стали и выпускник цилиндр [стекла]. Отложите в сторону для сухой вверх вниз. Промойте политетрафторэтилена (ПТФЭ) выстроились шапки дважды с 95% EtOH только (хлороформ будет повреждения наружных материалов крышку) и отложите в сторону для просушки.
3. Смешайте 1 часть обработана цветы на 9 частей хлороформа (1 wt: 9 соотношение vol) в стакан (цветы затем хлороформ), аккуратно водоворот для 30 s и процедить через сито из нержавеющей стали в второй стакан. Налить ch-FE от второй стакан в культуре стеклотрубки (10-15 мл) и прикрепите крышку PTFE. Заверните крышку с парафина для предотвращения испарения.
4. Этот препарат является хлороформ цветочные экстракт (ch-FE). Магазин образец в темноте (для уменьшения света деградации) при 4 ° C до экспериментального использования. Повторите экстракции с несколькими образцами предоставлять реплицирует (по крайней мере 3 каждого образца типа).

5. сбор дождевой воды из черники цветы (BB rw-FE)¹⁶

Примечание: Блуберри цветочные дождевой воды коллекции устройство состоит из воздуха распылителем одноразовые краска спрей Кубка с адаптер (Кубок: Внутренняя резьба, адаптер: мужчины к мужчине поток), 50 мл пробирок (полипропилен), парафина и пластиковые покрытием провода ( стандартные телефонные провода, отдельные внутренние провода нити содержимое).

1. Выберите несколько мест в пределах Буш Черника захватить запустить офф цветы до создания устройства для сбора дождевой воды. К ним относятся непосредственно под соцветия (цветок) в самом фундаменте Буша (Корона). Запись диаметр стволов (начиная от 1-5 см) в отдельных местах, как это будет диктовать размер отверстия для крепления устройства, описанные ниже.
2. Для каждого выбранного местоположения создайте устройство коллекции. Сначала просверлите отверстие в нижней части спрей Кубка (где Кубок кривые направлении резьбовое отверстие) для соответствующего диаметра ствола, с небольшим шагом, придает сверлильный станок. Затем вырежьте прямую линию от верхней части thehole до устья Кубок спрей. Просверлить 4 равноотстоящих (достаточно большой, чтобы поток пластиковые проволока с покрытием,) в устье спрей Кубок и подключите один конец пластиковые покрытием провода, оставляя один конец бесплатно.
3. Просверлите отверстие достаточно большой, чтобы поток краски опрыскиватель Кубок адаптер в крышка крышка центрифуги 50 мл. Уплотнение адаптер потоков с парафина для предотвращения утечки. Приложите это Крышка центрифуги и резьбовой части распылителя Кубка. Прикрепите растяжением 50 мл пластиковых пробирок.
4. Повторите шаги 5.3-5.4 для создания нескольких устройств согласно выбранных местоположений, минимум 4 коллекции устройств на месте отбора проб.
5. Развертывание устройств в отдельных местах, разминая чашки распылителя помещается на стеблях. Ориент стороне вырезать спрей Кубка вверх используя пластиковым покрытием проводов прилагаемом к другим стебли (застраховать, что захвачен воды, проходя над Цветы). Аффикс парафина всех отверстий, которые могут протекать дождевой воды. (Дополнительная цифра 3, дополнительная цифра 4, дополнительная цифра 5и Дополнительные рис. 6).
6. Метки коллекции трубок с развертыванием Дата / время. После дождя события, удалить и заменить часть нижней (трубка) пластиковых пробирок (метку даты / времени сбора). Принесите стока коллекций (упоминаемый как цветочные экстракт черники дождевой воды (BB rw-FE)) внутри и вакуумный фильтр (фильтрации, описанные в шагах 2,4-2,5). Магазин как выше (шаг 2.6), до тех пор, пока используется в биопроб на водной основе.

6. сбор дождевой воды из клюквы цветы (CB rw-FE)

1. Устройство сбора цветочные дождевой воды в Клюква состоит из 7 X 7 cm полипропиленовые воронки, 50 мл пробирок (полипропилен), парафина, и 4 стандарта, пластиковые покрытием перевязку (на устройство).
2. Во-первых тепло прокол 8 равноотстоящих отверстия (диаметром перевязку) вокруг устья воронки, используя металлический зонд. Вставьте перевязку в 4 отверстия. Прикрепите Другие концы к противоположной местоположение этого отверстия, формируя шаблон аккуратно пересечения. Оберните воронкой вниз стебель с парафина и отложите в сторону.
3. Просверлите отверстие достаточно большой, чтобы вставить воронкой вниз стволовых в 50 мл центрифуги колпачок с небольшим шагом. Вставьте подготовленных воронка Крышка центрифуги. Повторите шаги 6.2-6.3 для создания нескольких устройств, минимум 4 коллекции устройств на месте отбора проб.
4. Развертывание устройства помечены (Дата/время) в выбранных клюквенный болота. Аккуратно прижмите два соцветия подшипник цветок (известный как стоек) под скрещенных пластиковые перевязку. Затем по вертикали ориентации устройства, пирсинг пластиковых пробирок в клюквенный навесом (дополнительные цифры 7-8, дополнительные 3 фильма).
5. После дождя или накладные полива удалить и заменить часть нижней (трубка) пластиковых пробирок (метку даты / времени сбора). Принесите стока (упоминаемый как цветочные экстракт клюквы дождевой воды (CB rw-FE)) внутри и вакуумный фильтр (фильтрации, описанные в шагах 2,4-2,5). Магазин как выше (шаг 2.6), до тех пор, пока используется в биопроб на водной основе.

7. биопроб, используя воды на основе цветочные экстракты^,1516 (активных-FE, пройти-FE, rw-FE)

Примечание: Смотрите Рисунок 1.

1. Этот bioassay готовится в Ламинарный шкаф. Подготовка материалов: тройной промыть стекло coverslips с 95% EtOH и воздух сухой, затем отложить в сторону. Отрезные диски бумаги полотенце на внутренний диаметр стандартные пластиковые клетки культуры блюд (9 см). Место 2 слоев бумажных дисков в пределах культуры блюда и замочить с 2 мл ТБО.
2. Подготовьте по крайней мере 5 мл на 1,0 X 10 конидий⁵ мл ТБО споро подвески (C. fioriniae) согласно выше (шаг 1.2-1.4), отложите в сторону. Далее смесь равных объемов ТБО и водной основе цветочные экстракт в 2 мл microcentrifuge трубы. Затем, добавьте равное количество споро подвеска трубы microcentrifuge подготовленный 2 мл (ТБО плюс FE); результате подготовка называется смесь водного лечения. Для элемента управления опустить часть FE и заменить с ТБО, чтобы сохранить согласованность конидиальная концентрации.
   Примечание: размер порции зависит количество реплицирует и моменты времени. Как правило части не превышает 500 мкл. После того, как сочетаются конидий и FE биопроб началось, 0 h после прививки.
3. Место coverslips предварительно очищенного стекла на вершине пропитанной бумажные полотенца в пределах клетки культуры блюдо. Положите капельку 40 мкл водного лечения смеси на центр coverslip. Повторите для желаемого лечения, включая контроль, закройте клетки культуры блюдо. Повторите в отдельную ячейку культуры блюда для репликаций (по крайней мере 3) и моменты времени (каждое блюдо для 1 момент времени). После того, как все процедуры и реплицирует было обойтись, поместите все реплицированные клетки культуры блюда в запечатанный пластиковый контейнер (30 x 13 x 7 мм) и инкубировать при 25° C в темноте.
4. На заранее время очки, добавить 10 мкл фиксатором как lactophenol хлопок синий (20,0 г фенола кристаллы, 20,0 мл 2,5% молочной кислоты, 40.0 мл глицерина, голубой хлопок 0,05 г) капельки, остановка роста и частично сохраняя горе.
   1. Подождите 2 h, чтобы собирать точки время 0 h, как это позволяет конидиальная адгезии к поверхности стекла, но не достаточно долго, для проращивания конидиальная. Для всех других точек время добавьте фиксатором в соответствующее время.
5. После добавления фиксатором, тщательно Инвертируйте coverslips, помещая их капелька стороной вниз на стекло микроскопа для упрощения микроскопическом исследовании (1 coverslip на слайд). Когда все coverslips на стеклянных скольжениях микроскопа, оставить им селиться и частично сухой в капот потока за 20 мин.
6. Граф все конидий (всего конидий) представить на coverslip (первичный конидий проросшие конидий и вновь образованного среднего конидий), а также appressoria или 400 X увеличение (считая 16 полей) или 200 X (считая 4 поля), общей площадью 3.808 мм ². повторить весь биопроб для статистического анализа. Для анализов с использованием водной основе FE анализа данных, как описано в Уоллер и др. 2017¹⁶, обычно показано как среднее/мм² (всего конидий или appressoria).

8. биопроб, используя на основе хлороформ цветочных экстрактов (ch-FE)¹⁷

Примечание: Смотрите Рисунок 2.

1. Подготовка материалов и клеточной культуры блюда согласно выше (шаги 7.1). Кроме того, промойте равное количество Ван Tieghem (вант клетки) (8 мм OD, ID 6 мм) в coverslips, а также стеклянные пипетки (1 мл с шагом в 1 мкл) внутри Зонта, (дважды с 95% EtOH затем дважды с хлороформ) и отложите в сторону.
2. В Ламинарный шкаф, используя 2-мл пробирку microcentrifuge добавить два равных объемах (по крайней мере 500 мкл части) ТБО и 1 объем споро подвеска, а затем отложите в сторону. Это смесь водного лечения для ch-FE bioassays.
3. В Зонта место вант. ячейка на стекло coverslip в рамках подготовленного пластиковые клетки культуры блюдо. Лунки (с стеклянной пипетки) 33 мкл желаемого ch-FE в центр ячейки т. Ван (не касайтесь стен вант. Ячейка; для контроля лечения, добавить девственной хлороформ) и дайте высохнуть. Повторите в отдельную ячейку культуры блюда для репликаций (по крайней мере 3).
4. После того, как ch-FE сушеные, лунки 99 мкл подготовленный водного лечения смеси с стандартной пипетки в центр вант. ячейки, а затем закрыть все клеточные культуры блюда. После того, как смесь водного лечения вступают в контакт с процедурами сушеные ch-FE, биопроб началось, 0 h после прививки.
5. После того, как все процедуры и реплицирует было обойтись, поместите все блюда (закрытое) клетки культуры в запечатанный пластиковый контейнер (30 x 13 x 7 мм) и инкубировать при 25° C в темноте.
6. В заранее определенных моментов времени мкл 15 фиксатором (lactophenol хлопок синий) для вант. ячейки и пусть сидят по крайней мере 5 минут для обеспечения адекватного грибковые окраски. После этого времени осторожно удалите вант. ячейки и выполните coverslip данных и инверсии приобретение выше (шаги 7,5-7,6). Для анализа данных следуйте методы, описанные в 2015 году замерщика¹⁷, обычно отображение данных в виде формирования Аппрессории, который представляет собой отношение общего конидий appressoria насчитал в этом районе наблюдается (3.808 мм²).

9. клюквенный основе Фенология извлечений¹⁷

1. Ручной сбор клюквы цветы (в июне; 100 g), незрелые плоды (дважды; Июль и Август; 200 g) и зрелые Клюква плоды урожая (Октябрь; 200 g), место в размера пластиковые мешки и хранить в холодильнике при температуре 4 ° C сразу же после сбора. Используйте загрязнения меры предосторожности, описанные выше (шаг 2.1).
   Примечание: Там будет дополнительных растительного материала, собранных на каждый раз, но эти суммы остерегаться извлечение очевидно грибковых зараженных яичников и фрукты (показывая симптомы и признаки болезни).
2. До извлечения удалите любые ухудшилось, поврежденные, пораженные цветы, а затем используя только здоровые цветы, удалите чашелистиков, плодоножек, венчики, рыльца, стили и тычинки с щипцы изогнутые (45 ° пинцет) и отбросить все, но яичников. После того, как собраны яичников, выполнить извлечение хлороформ основанные на 1 Вт: 9 коэффициент vol (подробные шаги 4.2-4.4, используя только яичников). Хранить образцы до тех пор, пока все другие извлечений являются полными, т.е. до биопроб проводимости.
3. Как только фрукты собраны, выполнять на основе хлороформ извлечения (шаги 4.2-4.4, используя собранные плоды вместо цветов), но добавляют 10 г фруктов до 90 мл хлороформа и однажды извлечены, Дайте раствору испарился 9 мл (в результате wt 9 мл 10 g: : vol раствор).
4. Сделайте фрукты извлечений сразу же после сбора в июле, августе и октябре. Хранить как за выше (шаг 4.4) до тех пор, пока все извлечений собираются. После последнего извлечения на основе хлороформ фруктов, поставить все на основе пенологии хлороформ экстрактов, собранные для этот assay биопроб на основе хлороформе и анализировать соответственно (шаги 8.1-8,6).

Результаты

Результаты, представленные здесь приведено несколько примеров многочисленных анализов, которые могут быть выполнены с использованием этой методологии. Рисунок 1 является иллюстрированное руководство по помощи биопроб FE на водной основе и дополняется Рисунок 2 , который следует к биопроб FE на основе хлороформ. Рисунок 3 обеспечивает наглядное руководство к чего можно ожидать на микроскопической оценке C. fioriniae на 24 ч, в обоих bioassays на основе воды и хлороформе (по сравнению ТБО элементы управления). Рисунок 4 подробности 24 h-курс исследование с C. fioriniae присутствии клюквенный сорт «Стивенс» ch-FE и дает визуальную ссылку на импорт результат этого исследования: FE сократилось время, необходимое для формы инфекции структур по сравнению с ТБО. Figure 5 пример данных, собранных от coverslip биопроб, используя клюквенный цветочные дождевой сток (CB «Цветочный» rw-FE). Рисунок 6 представляет собой еще один важный результат: цветочные завязи ch-FE была гораздо более стимулирующий характер, чем фрукты ch-FE, указывая значение Блум в жизненном цикле C. fioriniae. Дополнительные фотографии и фильмы предоставляют важные визуальные эффекты цветов, используемых в экстракции и цветочные дождевой воды коллекции устройства/развертывания, в дополнение к кино, которые визуализировать (извлечения активных и пассивных- процессы, основанные на воде).

Рисунок 1 : Общий обзор на водной основе цветочные экстракт (FE) биопроб. Этот assay использовался для водной основе цветочных экстрактов черники и клюквы цветами: Активные -цветочные экстракты (активных-FE), пассивный -цветочные экстракты (пройти-FE) и цветочные дождевой сток (rw-FE). FE часть обычно представляет собой экспериментальный/переменный фактор. И наоборот - FE часть может оставаться постоянной и время точек/часов после прививки могут быть оценены. Предпочтение достигнут 4 анализ поля на 200 крат. Сокращения: Стерильные деионизированной воды, ТБО; Область в поле зрения, а. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Общий обзор на основе хлороформ цветочные экстракт (ch-FE) биопроб. Этот assay, была использована для черники и клюквы (цветы, яичники и фрукты). Только один тип смеси водного лечения был использован в этот assay, 1 часть spore подвеска с 2 части ТБО (чтобы держать конидиальная концентрации последовательным из-за испарения ch-FE). Этот assay может использоваться для сравнения нескольких ch-FE (воски из различных растений поверхности), или несколько время точек/часов после вакцинации с использованием единого ch-FE. Сокращения: Стерильные деионизированной воды, ТБО; Ван Tieghem [стекла] клетки, вант. ячейка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Визуальное сравнение Colletotrichum fioriniae присутствии FE на водной основе и ch-FE. В этом пробирного голубики «Bluecrop» (активных-FE, на водной основе) (грибковых изолировать: BB #10) и клюквенный «Стивенс» на основе хлороформ (ch-FE) (грибковых изолировать: CB-PMAP182) цветочные экстракты были по сравнению с управления ТБО. Резкое увеличение среднего conidiation (кольца) и формирование Аппрессории (стрелок) были замечены при сравнении конидий присутствии ТБО (управления) (A) для активных-FE (B) на 24 ч после прививки. Однако вторичные conidiation был не столь очевидным, когда сравнение элемента хлороформом управления ТБО биопроб (C) с ch-FE (D); скорее C. fioriniae роста смещается в сторону образования appressorial. Показан общий ответ для каждого типа добычи, на водной основе и на основе хлороформ, независимо от видов хост/цветочные описал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Исследование (24 ч)-курс с Colletotrichum fioriniae присутствии ch-FE. В этот assay управления ТБО (A-D) и клюквенный «Стивенс» ch-FE (E-F) были визуально проверены на 0, 6, 12 и 24 ч после прививки (пример переменной времени точек вместо сравнения нескольких FE). Аппрессории формирования (стрелок) начал в 6 ч в ch-FE и неуклонно увеличивалось время последующих пунктов. Это результаты ускользает в важный фактор биологии патогена в период цветения: Цветы сократить время, необходимое для структуры формы инфекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : Графическое отображение данных, собранных с помощью rw-FE в биопроб. Дождевой воды запустить офф клюквенный цветы (CB «Цветочный» rw-FE) и девственные дождевой воды, которая не коснулся любой клюквенный растительных тканей («Земля» rw-FE) от одиночного смачивания события плюс стандартный Активный, на водной основе цветочные экстракт клюквы (CB активных -FE) (положительный контроль) и ТБО (отрицательный контроль) были подвергнуты биопроб на водной основе coverslip и оцениваются для роста C. fioriniae . CB «Цветок» rw-FE имел тот же уровень среднего conidiation и Аппрессории формирования как стандарт CB активных-FE на 24 ч после прививки, указывающее, что коллекция устройств были эффективными в цветочные стимуляторов, выпущенный во время захвата смачивания событие. Общая конидий состоит из первичного (хранение), конидий и вновь образованного среднего конидий. Буквы указывают, что существенные различия в p < 0,05 согласно наименее значимого различия Фишер тест (ЛСД); прописные, Общая конидий; строчные, appressoria. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6 : Клюквенный основе Фенология ch-FE биопроб, визуального осмотра. Управление болезни для фруктов, гниение грибов часто включает Блум время фунгицид приложений. Здесь клюквенный метилхлороформа на основе экстрактов (ch-FE) из нескольких стадиях роста клюквы («Стивенс») визуально оценивали эффект поверхности воска на C. fioriniae на 24 ч после прививки. Яичники, собранные в июне (A), незрелые плоды, собранные в июле и августе (B, C), собранные плоды, собранные в октябре (D), и элемент управления ТБО (E) были проверены для формирования appressorial (стрелок). Завязь ch-FE была наибольшая величина формирования appressorial, указывающий, что этот завод фенологии (Блум) является критически важным для жизненного цикла от C. fioriniae. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные рисунок 1: Блуберри соцветие. Блуберри цветы были собраны для извлечения во время полного цветения (апрель-май Нью-Джерси, США) (показано «Bluecrop»). Обратите внимание, перекрытие венчики/яичников из соседних цветов и общей архитектуры соцветия, по сравнению с дополнительная цифра 2 (Клюква вертикально). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные рисунок 2: клюквенный чистосердечно. Клюква цветы были собраны для извлечения во время полного цветения (июнь-июль в Нью-Джерси, США) (показано «Стивенс»). Обратите внимание, разнообразные цветочные этапов на одной клюквенный соцветия (вертикально) и подключили, капли воды, сохраняя форму corolla. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительная цифра 3: Блуберри дождевой воды развертывания (цветок). Завершены голубики цветочные дождевой воды сбора устройство, непосредственно под кластер соцветия. Обратите внимание пластиковым покрытием провода, используемые для вертикальной ориентации устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные рисунок 4: Блуберри дождевой воды развертывания (стебель). Завершенные голубики цветочные дождевой воды коллекции устройство, на полпути вниз стебель между соцветие и Корона Буша. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительная цифра 5: Блуберри дождевой воды развертывания (Корона). Завершены голубики цветочные дождевой воды сбора устройство, на базе Буша (Корона). Примечание пластиковые покрытием провода могут быть удалены, если нет необходимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные рисунок 6: Блуберри дождевой воды развертывания (земля). Завершено устройство коллекции девственной дождевой воды, помещены рядом кусты черники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительная цифра 7: развертывание клюквенный дождевой воды (крупный план). Завершены клюквенный цветочные дождевой сбора устройство, с двумя стойками, скрываются под аккуратно скрещенных проводов связей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительная цифра 8: клюквенный дождевой воды развертывания. Несколько завершено устройства клюквенный цветочные дождевой развернутых в болоте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные фильм 1: активная, на водной основе цветочные экстракты (Активные -FE). Дополнительная поддержка видео следующие шаги 2.3-2.5.1. Блуберри «Bluecrop» цветы были использованы. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Дополнительные фильм 2: пассивный, на водной основе цветочные экстракты (пройти-FE). Дополнительная поддержка видео следующие шаги 3.3-3.4. Блуберри «Bluecrop» цветы были использованы. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Дополнительные фильм 3: развертывание устройства для сбора клюквы цветочные дождевой воды. Следующим шагом 6,4 Дополнительная поддержка видео. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Обсуждение

Bioassays, обнаружения C. fioriniae ответ на цветочных экстрактов (FEs) были разработаны для плодов черники и клюквы гниль pathosystems, но может быть легко адаптирована для других садовых культур. Протокол, подробно изложенных выше был ценным в приобретении многие важные наборы данных включая, но не ограничиваясь: FE эффекты на нескольких изолятов многочисленных патогенных микроорганизмов, время курс информацию, касающуюся микоз этапов в присутствии различных Фес, Сравнение методов извлечения, проверки отдельных химических веществ на C. fioriniae роста и дифференцировки, оценки отдельных цветок органа экстрактов, влияние температуры на C. fioriniae присутствии FE, эффекты Фенология зависимых воск экстракции, и цветочные дождевой воды эффектов. Используя эти методы полученные данные предоставила также более четкое представление о жизни C. fioriniae стадий и частично разъясняет, почему Блум период столь важное значение для контроля за много фруктов, гниение патогенов.

Первоначально, все цветы были обработаны одинаково активно-FE, но процесс извлечения перешла к использованию всего цветы. Цветочные вскрытие было много времени и имел очень мало влияет на биологическую результате FEs. Однако, отдельные цветочные органы могут и должны были оцененные используя этот протокол, но большую осторожность должны быть приняты для вымачивать не полностью цветочные ткани (Дополнительные фильм 1, с техникой, подробно описанные в шаге 2.3), это может привести к выпустила грибы токсичных/статических соединений в FE, которые могут исказить микроскопических оценок. Менее инвазивные извлечений например перевал -FE (Дополнительные фильм 2) и rw-FE теперь являются более благоприятными, из-за их легкости приобретения. Кроме того эти методы извлечения требуется только вакуумной фильтрации для получения биологически активных цветочные химические сигналы.

Цветы, использованы в всех зубов обычно были в холодильнике 0-3 дня до приготовления экстракта. Задача настоящего Протокола является управление временем FE оборота (коллекцию полей путем хранения экстрактов). Это усугублялось многочисленные образцы из многочисленных источников и дат. Замороженные цветы не были оценены в любой реальной степени, как талой цветки появляются ухудшилось и бесцветные. Однако после того, как были подготовлены Феса на водной основе, повторил замораживания и оттаивания показал не влияет на биологическую FE, так до тех пор, как FE быстро размораживают после подготовки биопроб (жизнеспособные 3-летний FE).

На основе хлороформ извлечения позволяет расследование возбудителя ответы на поверхности воски трехмерные цветные/фрукты в двумерной плоскости через испарение ch-FE на стекло coverslips. Однако маловероятно, что фактические кристаллических структур воски на хранение от ch-FE идентичны к поверхности, из которого они были собраны. Смысл, дополнительные методы должны быть реализованы, если грибковых ответ на конкретные воск структур в vivo являются основным направлением следствия. Хлороформ-на основе экстрактов нужно больше хранения обслуживания чем экстракции на водной основе. Помимо поддержания ch-FE экстрактов в темноте, PTFE выстроились клеточной культуры труба шапки и парафина, герметизации необходимо обернуть регулярно проверяться для испарения утечек и заменить при необходимости.

Концепция контроля цветочные дождевой сток коренится в идею продвижения инструменты мониторинга конкретных заболеваний. Устройства для сбора дождевой воды может быть адаптирована к много других архитектур завод, до тех пор, пока коллекция устройство захватывает дождевой воды, запускаемый офф цветы. Этот подход предоставляет информацию о ли или не цветочные стимуляции в поле присутствует в любой момент времени и может контролироваться на протяжении всего сезона. Кроме того коллекция устройств могут быть развернуты в нескольких местах навесом, чтобы определить, насколько цветочный подсказки были вымыты в любой заданной смачивания событие. В будущем эксперименты, rw-FE будет диктовать, когда следует начинать фунгицид приложений и когда они могут безопасно конец. Кроме того осуществляя мониторинг фенологии зависимых воск экстракции (протокол раздел 9), значение периода цветения биологии патогена стало еще более очевидным. Этот раздел также включены продемонстрировать гибкость этих bioassays, предоставляя методы, которые позволяют бок о бок сравнения принимающей поверхности воска, которые временно разделены. Данные, полученные с использованием методов цветочные добычи и bioassays представляют ощутимых показателей возбудителя стимуляции, конкретных химических классов биологии патогена, и цели для будущих стратегий.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm pore size, acetate sterilizing filter	VWR	101102-280	Blueberry floral extract (FE) clarification
200-1000 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
40-200 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
5-40 µl pipette with tips	-	-	Equipment, any make within range will be adequate
Air spray gun disposable paint spray cup with connection adapter	Harbor Freight	97098	Blueberry rainwater (rw-)FE collection
Autoclave	Amsco	3011	Equipment, media preparation
Bar mesh matting (plastic mesh sheet)	Winco	BL-240	Passive (pass)-FE collection
Benchtop timer	Fisher Scientific	06-662-47	Equipment, FE preparation
Black pressure/vacuum hose	VWR	62994-795	Vacuum filter component
Buchner funnel	Coors USA	60240	Vacuum filter component, accepts 55 mm filter paper disks
Bunsen burner	-	-	Equipment
Calcium carbonate	Fisher Scientific	C64-500	Media component
Centrifuge	Sorvall	RC 5B Plus	Equipment
Centrifuge tubes (15 ml)	Fisher Scientific	05-527-90	Equipment
Centrifuge tubes (50 ml)	VWR	10025-694	Equipment, rw-FE collection
Cheesecloth (grade 50)	Fisher Scientific	AS240	Equipment, FE preparation
Chloroform	VWR	JT9175-3	Chemical, trichloromethane: assay grade, ≥ 99% pure, for molecular biology, peroxide-free
Corn Meal Agar (CMA)	Fisher Scientific	B11132	Pre-mix media, isolate storage on slants
Cotton-blue stain	Sigma-Aldrich	61335	Lactophenol cotton-blue stain
Difco Agar	VWR	90004-032	Media component
Drill-press	Delta	-	Equipment, rw-FE collection
EASYpure LF Ultrapure water	Barnstead	D738	Equipment, deionized water source
Ethanol (95%)	-	-	Chemical
Filter flask (500 ml)	Pyrex	No. 5340	Vacuum filter component
Fume hood	Hamilton	-	Equipment, chloroform usage
Funnel (7 X 7 cm)	VWR	60820-110	Cranberry rw-FE collection, FE preparation
Generic glass slide	Fisher Scientific	22-038-101	Bioassay conductance
Generic plastic pump spray bottle	VWR	16126-454	pass-FE collection, at least 250 ml capacity
Glass cell culture tubes	-	-	Storage of ch-FE
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542B	Bioassay conductance
Glass Van Tieghem cells (hand cut glass tubes)	-	-	Chloroform (ch)-FE bioassay, (8 mm OD 6 mm ID)
Glass-pipette (1-100 µl)	Hamilton Co. Inc.	#710	ch-FE bioassay
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Lactophenol cotton-blue stain
Hemocytometer	Bright-Line	5971R10	Equipment
Lactic acid	Sigma-Aldrich	W261106	Lactophenol cotton-blue stain
Laminar flow hood	Labconco	3730400	Equipment, sterile work environment
Metal probe (generic)	-	-	Equipment
Microcentrifuge tubes (2 ml)	Fisher Scientific	05-408-138	Aqueous treatment mixture storage and preparation
Microscope, Leica DMLB	Leica	020-519.010	Equipment
Mortar (ceramic)	Coors USA	60313	Vacuum filter component
Nitrile gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D	Flower collection
Paper disks (cut paper towels)	Office Basics	KCC01510	humidity control in bioassay
Parafilm	Bemis	PM-996	Plastic paraffin film
Pestle (ceramic)	Coors USA	60314	Vacuum filter component
Phenol crystals	Fisher Scientific	A92-100	Lactophenol cotton-blue stain
Plastic bags (~100 mm X 152 mm)	Uline	S1294	Equipment, flower refrigeration
Plastic cell culture dishes (9 cm diameter)	Fisher Scientific	FB0875712	(Petri dish), bioassay conductance
Polytetrafluoroethylene (PTFE) lined caps	VWR	60927-228	Storage of ch-FE
Pyrex beakers (100 ml)	Pyrex	No. 1000	Preparation of ch-FE
Pyrex bread-pan	-	-	pass-FE collection
Pyrex graduated cylinder	-	-	Equipment, FE preparation
Sealed plastic container (30 mm X 13 mm X 7 mm)	-	-	Bioassay conductance
Sharp-pointed dissecting scissors	Fisher Scientific	8940	Equipment, to cut cheese-cloth and paper disks
Stainless steel mesh strainer	VWR	470149-756	Preparation of ch-FE
Step drill bit (step-bit)	Dewalt	-	Equipment, rw-FE collection
Sterile loop (combi-loop)	Fisher Scientific	22-363-602	Culture preparation
Telephone wire (internal wires)	-	-	Blueberry rw-FE collection
Test tube basket	VWR	470137-792	Readily available substitution for plastic mesh [strawberry] basket
V8 Juice	Campbell's Soup Company	-	Fungal media component
Vintage plastic mesh [strawberry] baskets	Donation	-	pass-FE collection, can substitute for test tube basket (470137-792)
Vortex Genie (Vortex)	Fisher Scientific	12-812	Spore suspension preparation
Whatman No. 1 Qualitative 55 mm circles	Whatman	1001-055	Vacuum filter component
White plastic twist ties (100 mm)	Uline	S-566W	Cranberry rw-FE collection