El modelo de infección de Waxworm Galleria mellonella para la Candidiasis diseminada

Resumen

Galleria mellonella sirve como un modelo de invertebrado para la candidiasis diseminada. Aquí detallamos la infección el protocolo y proporcionar datos de apoyo para la efectividad del modelo.

Resumen

Las especies de Candida son comensales hongos comunes de los seres humanos colonizando la piel, superficies mucosas y tracto gastrointestinal. Bajo ciertas condiciones, la Candida puede cubran sus nichos naturales dando por resultado debilitante mucosas infecciones como infecciones sistémicas así como peligrosa para la vida, que son un foco importante de la investigación debido a su alta mortalidad asociada. Modelos animales de infección diseminada existen para estudiar la progresión de la enfermedad y las características de patogenicidad de Candida de disección. De estos, el modelo de infección de waxworm Galleria mellonella proporciona una rentable herramienta experimental para investigaciones de alto rendimiento de virulencia sistémica. Muchos otros agentes infecciosos bacterianos y eucariotas han sido efectivamente estudiados en g. mellonella para entender patogenicidad, convirtiéndolo en un sistema modelo ampliamente aceptado. Sin embargo, variación en el método utilizado para infectar a g. mellonella puede alterar los resultados fenotípicos y complicar la interpretación de los resultados. Aquí describiremos las ventajas e inconvenientes del modelo waxworm estudiar patogenia de Candida sistémica y un enfoque para mejorar la reproducibilidad del detalle. Nuestros resultados destacan la gama de la cinética de mortalidad en g. mellonella y describen las variables que pueden modular la cinética de estos. En última instancia, este método se erige como un enfoque ético, rápido y rentable para el estudio de virulencia en un modelo de candidiasis diseminada.

Introducción

Las especies de Candida son comensales humanos comunes que son capaces de emerger como patógenos oportunistas en severamente inmunocomprometidos y pacientes disbiotica. Aunque muchas especies de Candida pueden causar enfermedad, C. albicans es la causa más frecuente de candidiasis diseminada^1,2. Enfermedad sistémica resulta de C. albicans de acceso a la circulación sanguínea a través de cualquier penetración directa de las barreras del huésped previamente restrictivas o introducción en sitios quirúrgicos y otros incumplimientos del cuerpo³. Las especies de Candida utilizan una gama de procesos patógenos para causar enfermedad sistémica en el host incluyendo filamentación, formación de biopelículas, evasión inmune celular, escape y plancha limpieza⁴. Existen enfoques in vitro para investigar los mecanismos patogénicos, pero modelos animales continúan proporcionando la mejor opción para investigar la totalidad de la enfermedad resultado^5,6. La investigación anterior ha detallado muchas instancias de prometedoras investigaciones en vitro de virulencia pudiendo reproducir en vivo^7,8. Por lo tanto, se requiere evaluar virulencia modelos animales en vivo. Más modelos de la enfermedad dependen de ratones para servir como un sustituto para las infecciones humanas a pesar de la incapacidad de C. albicans coloniza naturalmente sistemas murinos como un comensal⁹. Los modelos invertebrados de candidiasis diseminada incluyen el nematodo elegans de Caenorhabditis, la fruta la mosca Drosophila melanogastery waxworm Galleria mellonella, aunque preocupaciones acerca de las diferencias fundamentales en fisiología básica, las temperaturas del cuerpo anfitrión y las rutas de exposición han obstaculizado su amplia aceptación^10,11.

Más recientemente, se ha adoptado el modelo de infección de g. mellonella waxworm a patogenicidad de modelo de una amplia gama de bacterias y hongos patógenos^12,13,14. Ventajas de este modelo son su relativamente bajo costo, mayor rendimiento, facilitan de uso y reducción preocupaciones éticas sobre beneficencia animal comparado con modelos murinos. Para los investigadores, esto se traduce en mayor capacidad de prueba de múltiples variables, intervalos de confianza más fuerte, más rápida experimentación y derivación de protocolos animal. G. mellonella ha servido como una plataforma para evaluar rápidamente la virulencia de C. albicans después de perturbación de los genes necesarios para biofilm formación, filamentación y gene regulación a través de aislamientos clínicos de^{11,15 ,16}. Estudios recientes han incorporado la investigación de la eficacia antifúngica utilizando g. mellonella para evaluar la farmacocinética de la droga actividad y resistencia en vivo en configuración, que son otra manera desafiante y ^{mucho tiempo 17,18}. Sin embargo, estudios de virulencia de C. albicans en g. mellonella han sido complicados por presuntamente altos niveles de variación dentro de los experimentos y protocolos incompatibles entre grupos de investigación que producen distintos fenotipos de virulencia entre ratones y waxworms^{11,13,19,20,21}. Aquí, describimos un protocolo de g. mellonella para normalizar la reproducibilidad de aumento de infecciones, C. albicans en experimentos de virulencia y demostrar coherencia con estudios previamente descritos de virulencia en murine modelos.

Estudios previos demostraron que C. albicans (MTL) de tipo-como locus en el cromosoma 5 de acoplamiento regula célula identidad y competencia similar a Saccharomyces cerevisiae y otros ascomiceto hongos²²de apareamiento. La mayoría de los aislamientos de C. albicans es heterocigoto en el locus MTL , codificación de cada uno de los MTLuna y MTLα alelos (MTLun/α) y es por lo tanto estéril^{15, 23 , 24}. pérdida de uno de los alelos MTL por la pérdida del heterocigoto (LOH) o mutación conduce a homocigótica MTLuna o MTLα cepas que pueden experimentar un cambio fenotípico desde el estado estéril 'blanco' a la apareamiento de estado 'opaco' competente²⁵. Trabajo previo ha puesto de manifiesto que la pérdida de heterocigoto MTL reduce también virulencia en modelos murinos de infección sistémica por cepa diferente fondos²⁶. Aquí detallamos el modelo de g. mellonella para candidiasis diseminada con un conjunto experimental genéticamente similar para representar la contribución de MTL heterocigoto a la virulencia en g. mellonella. Mostramos que la configuración de MTL influenciada patogenicidad de C. albicans , donde MTLα fueron menos virulenta con respecto aun/α MTLy MTLa las células, similares a resultados en modelo murino infección²⁶.

Protocolo

Todos los métodos descritos dependen del uso de hospedadores invertebrados y no requieren de aprobación institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC).

1. larvas de galleria mellonella Waxworm

1. Larvas del orden de mayoristas y proveedores que no introducen hormonas, antibióticos u otros tratamientos para las larvas y que son capaces de enviar y entregar a especímenes vivos.
   1. Asegúrese de comprar todas las larvas del mismo proveedor durante el curso de la experimentación. Tenga cuidado cuando ordene las larvas durante los meses de verano temperaturas superiores a 30 ° C disminuir la viabilidad de las larvas.
   2. Controlar las temperaturas en toda la ruta del envío previsto y planificar gastos de envío y entrega o elegir envío acelerado para minimizar su exposición a condiciones ambientales.
2. Cuando las larvas llegan, compruebe cada contenedor para asegurar las larvas viables y saludables están presentes. Larvas sanas serán completamente sumergidas debajo de las camas, en movimiento y poseen una coloración amarillo/tan ligera con pocas larvas que contienen marcas negras o manchas en el cuerpo.
3. Almacenar las larvas en su recipiente en un lugar ventilado a temperatura ambiente (25 ° C). Dependiendo de la condición inicial de las larvas, se pueden utilizar hasta dos semanas.

2. cultura preparación para la infección de Galleria mellonella

Nota: Se debe usar vestimenta de laboratorio adecuado a lo largo de esta parte del protocolo incluyendo guantes, bata y gafas de seguridad.

1. Hacer dextrosa peptona de levadura (YPD) líquido y agar las placas. Preparar 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y soluciones de etanol 70%.
2. Crecen las cepas de C. albicans que se inyecta durante la noche en 3 mL de YPD fresco en tubos de cultivo estándar en un tambor giratorio de velocidad media y 30 ° C.
3. Desactivación células a 2.500 x g durante 5 min en una centrífuga de mesa. Retirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento celulares.
   1. Resuspender las células en 5 mL de PBS 1 x por repetido pipeteo o vórtex. Repetir la centrifugación y la resuspensión de las células en PBS dos veces más para asegurar el retiro de todos los medios de cultivo.
4. Después de un lavado final, resuspender las células en 1 mL de PBS y transferirlos a un tubo de microcentrífuga.
5. Llevar a cabo una serie de diluciones seriadas en PBS para generar un 1: 100, 1:1, 000 y la serie de diluciones de 1: 100.000.
   Nota: Diluciones alternativas pueden ser necesarias para llegar a las cuentas de célula deseada.
   1. Utilizando un hemocitómetro, contar las células de la 1: 100 o la dilución de 1:1,000. Más a menudo, la dilución de 1:1,000 proporciona que el recuento apropiado para los cultivos de C. albicans .
   2. Calcular la concentración total de células dentro de la cultura inicial usando las matemáticas de la rejilla del hemocitómetro, con el objetivo de entre 30-300 células que se contará en la cuadrícula central de 5 x 5. Un contador de células automatizado puede ser utilizado como una alternativa; sin embargo, uso de densidad óptica para determinar un recuento se desaconseja como morfología de la célula (tamaño, forma, etc.) puede afectar considerablemente su precisión.
6. Usando las cuentas de célula medida, haga una nueva dilución de 2.5x10⁷ células/mL en 1 x PBS en un tubo de microcentrífuga. Esta dilución servirá como la base de cada inoculación de g. mellonella con C. albicans. Cada inyección requiere 10 μl de este inóculo para una dosis infecciosa de 250.000 células de C. albicans .
7. Confirmar la exactitud de la dosis infecciosa por platear el volumen correcto de la dilución de 1: 100.000 para 100 unidades formadoras de colonias (UFC) en agar YPD para cada cultivo ser utilizado en la infección.
8. Incube las placas de recuento de células de paso 2.7 durante 48 horas (h) a 30 ° C y contar el número de colonias por placa. Entre 80 y 120 colonias constituye un margen aceptable de exactitud en el inóculo.

3. infección de larvas de Galleria mellonella con cultivos de Candida

Nota: Se debe usar vestimenta de laboratorio adecuado a lo largo de esta parte del protocolo incluyendo guantes, bata y gafas de seguridad.

1. Añadir 1 mL de etanol al 100% y 1 mL de 1 x PBS a dos tubos de microcentrífuga separado. El etanol y PBS se utilizará para lavar la aguja de inyección entre las infecciones.
2. Esparza una pequeña cantidad de ropa de cama de waxworm en un vacío, estéril plato de Petri 100 x 15 mm, que albergará las larvas después de la inoculación para cada cepa independiente. Además de la ropa de cama limita la adherencia de muertos las larvas de g. mellonella a la superficie de la placa de Petri.
3. Esterilizar un 26 G, jeringa de μl 10 por tomar y eliminar 10 μl de etanol al 70% tres veces seguido de tres lavados con 10 μl de 1 x PBS. Vórtice de la dilución de inoculación de C. albicans y tomar 10 μl de la cultura. Asegurar que no existen burbujas de aire dentro de la jeringa de inyección de aire promueve muerte y complicará el análisis descendente.
4. Abra un contenedor de las larvas de g. mellonella y vuelta cama cuidadosamente con un dedo para descubrir las larvas. Seleccionar las larvas que están en buena salud por movimiento activo, color amarillo/tan claro y la falta de pigmentación negra en el cuerpo de las larvas. Estas larvas se deben de tamaño similar en el completo experimental establecer.
5. Recoger una sola de las larvas y manténgalo suavemente entre el dedo índice o corazón y el pulgar similar a sostener un lápiz. Rollo de las larvas en su parte trasera por lo que las patas queden hacia arriba. Mantenga toda la longitud del cuerpo entre los dedos y el pulgar para que las larvas es incapaz de enrollamiento o sepárelo de la inyección.
   Nota: Si lo desea, esterilizar el sitio de inyección con un hisopo de algodón empapado en etanol al 100%.
6. Gire la jeringa hasta que el bisel de la aguja quede hacia arriba y lentamente Inserte la punta de la aguja incluyendo la longitud del bisel en el cuerpo en el cruce con la pata izquierda trasera. Asegúrese de que la aguja penetra en el cuerpo y no simplemente empuja el cuerpo hacia dentro de las larvas. No haga fuerza en penetrar el cuerpo como la aguja puede perforar totalmente a través de las larvas rápidamente. Levantar suavemente con la aguja confirmará la adecuada penetración. El inóculo de Candida completo 10 μl de inyectar y extraer la aguja.
7. Repita el paso 3.3-3.5 para cada larvas. Para evitar asentamiento, vórtice de la Candida de la célula las culturas para la inoculación después de cada tercera inyección. Como control, se inyectan una serie de g. mellonella con 10 μl de 1 X PBS.
8. Casa Co 10 larvas inyectadas de la misma cultura de Candida en cada plato de Petri 100 x 15 mm después de la inoculación. Incubar larvas a 37 ° C durante ocho días, comprobando las larvas cada 24 h para monitorear la muerte.
   1. Evaluar la mortalidad inicialmente por la pigmentación oscura, la formación de manchas negras o cuerpos y la falta de movimiento. Para confirmar la mortalidad, utilice unas pinzas para rodar suavemente las larvas moribundas en la espalda y empujar ligeramente debajo de las larvas con las pinzas. No respuesta según lo observado por la falta de movimiento visible del cuerpo o la pierna se anotó como la muerte y las larvas se extraen de la caja Petri.
9. Registrar la mortalidad de las larvas a lo largo del tiempo. Larvas empiezan a pupar en las polillas pueden incluirse en el análisis pero deben eliminarse si empiezan a mudar. Pupating larvas pueden ser censuradas desde el análisis de punto final como las diferencias de virulencia entre las larvas y pupas no son claros.
10. Evaluar la significación estadística mediante el test estadístico de Mantel-Cox.

Resultados

Aquí, demostramos un método reproducible para el uso de g. mellonella waxworms investigar un modelo de candidiasis diseminada de la infección con C. albicans. El adecuado almacenamiento, mantenimiento y selección de larvas para la infección son componente fundamental de asegurar reproducibilidad en g. mellonella mortalidad (figura 1A). Larvas sanas que son activas, tienen un color amarillo/tan claro, y parches ...

Discusión

El modelo de g. mellonella waxworm se erige como una herramienta eficaz para el análisis rápido y reproducible de la virulencia de C. albicans . Este protocolo detallado se basa en una implementación consistente de una dosis infecciosa definida al mismo sitio a través de un lote de larvas. Dosis infecciosa tiene un profundo impacto sobre la mortalidad de g. mellonella mientras que uso de larvas entre su llegada inicial y diez días siguientes a la recepción produjo resultados similares. P?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O