לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ

Summary

Mellonella גלריה (galleria) משמש מודל הגעה עבור המופץ קנדידה. כאן, אנחנו מפרטים את הזיהום פרוטוקול ולספק נתונים התומכים לאפקטיביות של הדגם.

Abstract

המינים קנדידה commensals פטרייתי הנפוץ של בני האדם colonizing את העור משטחים הרירית, מערכת העיכול. בתנאים מסוימים, קנדידה יכולה והדבר נישות הטבעי שלהם וכתוצאה מכך מתישה זיהומים הרירית כמו טוב כמו סכנת חיים זיהומים מערכתית, המהווים מוקד מרכזי של החקירה בשל שיעורי התמותה גבוהים המשויך שלהם. מודלים חייתיים של זיהום המופץ קיימות עבור הלומדים התקדמות המחלה, לנתח את המאפיינים של קנדידה פתוגניות. אלה, המודל זיהום waxworm mellonella גלריה (galleria) מספק כלי ניסיוני חסכונית עבור תפוקה גבוהה חקירות של התקפה אלימה מערכתית. רבים אחרים בקטריאליים ו האיקריוטים מדבקים ביעילות נחקרו ב mellonella ג להבין פתוגניות, שהופך אותו מערכת מודל נפוצה ומקובלת. ובכל זאת, וריאציה של השיטה שבה נעשה שימוש כדי להדביק את mellonella ג יכול לשנות תוצאות פנוטיפי ומסבכים פרשנות של התוצאות. כאן, אנחנו חלוקה לרמות את היתרונות והחסרונות של המודל waxworm ללמוד פתוגנזה קנדידה מערכתית ואף פירוט גישה לשיפור הפארמצבטית. התוצאות שלנו להאיר את הטווח של קינטיקה התמותה ב mellonella ג , לתאר את המשתנים אשר יכול לווסת קינטיקה אלה. בסופו של דבר, שיטה זו ניצבת גישה אתית, מהירה וחסכונית ללמוד התקפה אלימה במודל של קנדידה המופץ.

Introduction

קנדידה המינים נפוצים commensals אדם המסוגלים מתעוררים כמו פתוגנים אופורטוניסטים ב immunocompromised קשות ומטופלים dysbiotic. למרות קנדידה מינים רבים יכולים לגרום למחלות, ג אלביקנס הוא הגורם הנפוץ ביותר של קנדידה המופץ^1,2. מחלה מערכתית נובעת אלביקנס ג גישה לזרם הדם דרך גם חדירה ישירה של מחסומי מארח קודם לכן מגבילים או מבוא-אתרי כירורגי ולפרצות אחרות של גוף³. קנדידה מינים לנצל מגוון של תהליכים פתוגניים לגרום למחלה מערכתית בתוך המארח כולל filamentation, ביופילמים, התחמקות תא החיסון ואת הבריחה של ברזל ניקוי⁴. גישות במבחנה לחקור מנגנונים פתוגניים בודדים, אך מודלים חייתיים לספק את האפשרות הטובה ביותר לחקור את מכלול של המחלה התוצאה^5,6. מחקרים קודמים מפורטות מקרים רבים של המבטיח במבחנה חקירות של התקפה אלימה נכשל להתרבות ויוו^7,8. לפיכך, מודלים בעלי חיים נדרשים עדיין להעריך התקפה אלימה ויוו. רוב הדגמים המחלה להסתמך על עכברים לשמש פונדקאית עבור זיהומים האדם למרות חוסר אלביקנס ג ליישב באופן טבעי מערכות מאתר כמו commensal⁹. הגעה מודלים של קנדידה המופץ כוללים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans, הפרי לטוס דרוזופילה melanogaster, את waxworm mellonella גלריה (galleria), למרות חששות לגבי ההבדלים הבסיסיים ב. אנדרופינים, חום הגוף המארח והנתיבים של חשיפה יש הקשו שלהם הסכמה רחבה^10,11.

לאחרונה, המודל זיהום mellonella ג waxworm אומץ כדי דגם פתוגניות של מגוון רחב של חיידקים ופטריות פתוגנים^12,13,14. היתרונות של מודל זה כוללים שלה בעלות נמוכה יחסית, עלתה התפוקה, להקל על השימוש, להפחית חששות אתיים לגבי בעלי חיים בחסד לעומת מודלים מאתר. לחוקרים, זה מיתרגם יכולת מוגברת כדי לבדוק מרובות משתנים מרווחי ביטחון חזקה יותר, מהירה יותר ניסויים, מעקף של פרוטוקולים בעלי חיים. Mellonella ג שימש כפלטפורמה להעריך במהירות אלביקנס ג התקפה אלימה בעקבות ההפרעות של גנים הדרושים עבור biofilm היווצרות filamentation, ג'ין רגולציה על פני מבודד קלינית^{11,15 ,16}. מחקרים שנעשו לאחרונה שילבו החקירה של פטריות יעילות שימוש mellonella ג כדי להעריך את פרמקוקינטיקה של פעילות סמים והתנגדות תחת ויוו הגדרות, שהן מאתגרת אחרת, ^{זמן רב 17,18}. ובכל זאת, מחקרים של התקפה אלימה אלביקנס ג ב mellonella ג יש כבר מורכב על ידי רמות גבוהות הדיווחים של וריאציה בתוך ניסויים ופרוטוקולים לא עקביים בין קבוצות המחקר המייצרים פנוטיפים התקפה אלימה שונות בין עכברים, waxworms^{11,13,19,20,21}. פה, אנו מכינים mellonella ג פרוטוקול לתקנן אלביקנס ג זיהומים, עלייה הפארמצבטית בניסויים התקפה אלימה, ומדגימים עקביות עם מחקרים שתואר לעיל של התקפה אלימה ב מאתר מודלים.

מחקרים קודמים הראו כי אלביקנס ג ההזדווגות, כמו סוג לוקוס (MTL) בכרומוזום 5 מסדיר תא זהות, הזדווגות כשירות הדומה האפייה ו פטריות אחרות Ascomycete²². הרוב המכריע של אלביקנס ג מבודד משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים- MTL מיקומה, קידוד אחד מכל סוג של MTL ו- MTLα אללים (MTL/α), והם סטרילי כתוצאה מכך^{15, 23 , 24}. אובדן אחד אללים MTL דרך אובדן של heterozygosity (LOH) או מוטציה מוביל homozygous MTL או שמקודדים α MTLיכולות לעבור מתג פנוטיפי מהמדינה 'לבן' סטרילי ההזדווגות המוסמכת המדינה 'אטום'²⁵. העבודות הקודמות הדגישה כי אובדן הטרוזיגוטיות MTL גם מקטין התקפה אלימה במודלים מאתר של זיהום סיסטמי על פני רקעים זן שונה²⁶. כאן, אנו מפרטים לדוגמא קנדידה המופץ באמצעות ערכה ניסוי דומה גנטית כדי לתאר את התרומה הטרוזיגוטיות MTL לאלימות ולגרימת ב mellonella ג mellonella ג . אנחנו מראים MTL תצורה השפיעו אלביקנס ג פתוגניות, איפה MTLα זנים היו פחות ארסית ביחס MTL/αוהן MTL תאים, בדומה לממצאי בתוך זיהום מאתר דגם²⁶.

Protocol

כל השיטות המתוארות מסתמכים על שימוש של המארחים הגעה, אינם דורשים טיפול בעלי חיים מוסדיים אישור ועדת להשתמש (IACUC).

1. הזחלים Waxworm גלריה (galleria) mellonella

1. סדר הזחלים סיטונאים וספקים זה לא להציג את הורמונים, אנטיביוטיקה או טיפולים אחרים לזחלים, אשר מסוגלים יצורים חיים כאלה עושים משלוחים.
   1. הקפד לרכוש כל הזחלים מאותו הספק במהלך הקורס של ניסויים. היה זהיר בעת הזמנת הזחלים בחודשי הקיץ כפי בטמפרטורה גבוהה מ- 30 מעלות צלזיוס להקטין את הכדאיות הזחלים.
   2. לפקח על הטמפרטורות על פני המסלול המשלוח הצפוי, בהתאם לתוכנית משלוחים או לבחור משלוח מזורז כדי לצמצם את חשיפתם לתנאי הסביבה.
2. כאשר הזחלים מגיעים, לבדוק לכל מכולה כדי להבטיח הזחלים קיימא, בריא נוכחים. הזחלים בריא לגמרי מתחת לפני המים מתחת המצעים, זז, ושולט על הגיוון אור צהוב/טאן עם הזחלים כמה כתמים שחורים או כתמי לאורך הגוף הכוללת.
3. לאחסן הזחלים שלהם מיכל בחלל מאוורר בטמפרטורת החדר (25 ° C). תלוי במצבו הראשוני של הזחלים, הם עשויים לשמש עד שבועיים.

2. תרבות לקראת זיהום Galleria mellonella

הערה: מעבדת נכונה הלבוש לענידה לאורך כל חלק זה של הפרוטוקול כולל כפפות, חלוק המעבדה של בטיחות משקפיים.

1. להפוך שמרים peptone דקסטרוז פלטות אגר של נוזלים (YPD). להכין 1-פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ו- 70% אתנול פתרונות.
2. גדלים זנים אלביקנס ג כדי להיות מוזרק ללון ב- 3 מ"ל של טרי YPD צינורות תרבות רגיל על תוף מסתובב במהירות בינונית ו 30 ° C.
3. ספין תאים למטה-2,500 g x עבור 5 דקות ומפרידה שולחן. יוצקים את תגובת שיקוע, נזהר שלא להפריע בגדר התא.
   1. Resuspend התאים באופן מלא ב- 5 מ של PBS 1 x על-ידי pipetting חוזרות או vortexing. חזור על צנטריפוגה ו resuspension של תאים ב- PBS עוד פעמיים, כדי להבטיח הסרה של כל תרבות המדיה.
4. לאחר שטיפה סופית, resuspend תאים 1 מ"ל של PBS ומעבירים אותם אל צינור microcentrifuge.
5. לנהל קבוצה של דילולים סדרתי ב- PBS לייצר בטחונות, 1:1, 000, וסדרות דילול כוללות.
   הערה: דילולים אלטרנטיבית עשוי להיות צורך להגיע ספירת הרצוי.
   1. שימוש של hemocytometer, לספור תאים של בטחונות או דילול 1:1,000. לרוב, דילול 1:1,000 מספק שהתא המתאים נחשב אלביקנס ג תרבויות.
   2. חישוב ריכוז מוחלט של תאים בתוך התרבות הראשונית באמצעות המתמטיקה רשת של hemocytometer, מכוון בין 30-300 תאים להיספר ברשת 5 x 5 מרכזי. מונה הניתן תא אוטומטיות עשוי לשמש כחלופה; עם זאת, השימוש צפיפות אופטית כדי לקבוע תא ספירת אינה מומלצת, כמו מורפולוגיה תאים (גודל, צורה, וכו ') יכולים להשפיע באופן משמעותי על רמת הדיוק שלה.
6. שימוש הסעיפים תא נמדד, גורם לדילול חדש 2.5x10⁷ תאים למ"ל ב- PBS x 1 צינור microcentrifuge. דילול זה ישמש כבסיס עבור כל חיסון של mellonella ג עם ג אלביקנס. כל זריקה ידרוש 10 µL של inoculum זה עבור מנה זיהומיות של 250,000 אלביקנס ג תאים.
7. לאשר דיוק המינון זיהומיות על ידי ציפוי הנפח הנכון של דילול כוללות עבור 100 יחידות ויוצרים מושבה (CFUs) על אגר YPD עבור כל תרבות שיש להשתמש בה זיהום.
8. תקופת דגירה תא לוחות ספירת מהשלב 2.7 של 48 שעות (h) ב 30 מעלות צלזיוס, לספור את מספר מושבות לכל צלחת. בין 80 ל-120 מושבות מהווה טווח מקובל על רמת הדיוק inoculum.

3. זיהום של הזחלים Galleria mellonella עם תרבויות קנדידה

הערה: מעבדת נכונה הלבוש לענידה לאורך כל חלק זה של הפרוטוקול כולל כפפות, חלוק המעבדה של בטיחות משקפיים.

1. להוסיף 1 מ"ל אתנול 100% ו- 1 מ"ל של 1 x PBS שני צינורות microcentrifuge נפרדים. אתנול וביו -PBS ישמש כדי לשטוף את המחט הזרקת בין זיהומים.
2. מורחים כמות קטנה של waxworm מצעים בשנת ריקה, פטרי סטריליות 100 x 15 מ מ, שיכיל את הזחלים בעקבות חיסון עבור כל זן עצמאי. תוספת של המצעים מגביל את דבקותה של המלח mellonella ג הזחלים השטח פטרי.
3. לחטא G 26, מזרק µL 10 על-ידי לקיחת expunging µL 10 של אתנול 70% שלוש פעמים ואחריו שלושה שוטף עם µL 10 ל- 1 x PBS. מערבולת דילול חיסון אלביקנס ג ו תופסות 10 µL של התרבות. ודא כי ישנם אין בועות אוויר בתוך המזרק הזרקת אוויר מקדמת את המוות, תגרום לסיבוך בניתוח במורד הזרם.
4. פתח, מיכל הזחלים mellonella ג , בזהירות להתהפך מצעים עם אצבע לחשוף את הזחלים. בחר הזחלים שהם במצב בריאותי טוב כפי שזוהו פעיל תנועה, צבע צהוב/טאן אור ועל חוסר פיגמנטציה שחורה בגוף הזחלים. לרוות כאלה צריך להיות גודל דומה על פני המלא ניסיוני מוגדר.
5. לאסוף את הזחלים יחיד והחזק אותו בעדינות בין אינדקס/האצבע והאגודל דומה מחזיק בעיפרון. לגלגל את הזחלים על גבו אז הרגליים פונות מעלה. החזק באורך מלא של הגוף בין האצבעות והאגודל כך הזחלים אינו מסוגל קורל או. לעזוב הזריקה.
   הערה: אם רצונך בכך, לעקר את האתר של הזרקת באמצעות מקלון צמר גפן ספוג אתנול 100%.
6. לסובב את המזרק כך השיקוע של המחט פונה למעלה ולהוסיף לאט לאט את קצה המחט כולל את האורך של השיקוע לתוך הגוף בצומת עם רגל שמאל rearmost. ודא המחט חודר לתוך הגוף לא פשוט לוחצים על הגוף של פנימה הזחלים. ואל תשתמש בכוח לחדור לגוף כמו המחט עלולה לחדור לגמרי הזחלים במהירות. מרימים בעדינות עם המחט יאשר חדירה המתאים. להזריק את inoculum קנדידה µL מלא 10 ולחלץ את המחט.
7. חזור על צעד 3.3-3.5 כל הזחלים. כדי למנוע תא להתיישב, מערבולת קנדידה תרבויות עבור חיסון אחרי כל זריקה שלישית. כפקד, להחדיר ערכה של mellonella ג µL 10 ל- 1 X PBS.
8. 10 בית משותף הזחלים מוזרק מן התרבות קנדידה זהה בכל צלחת פטרי 100 x 15 מ"מ בעקבות חיסון. דגירה הזחלים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שמונה ימים, בדיקת הזחלים כל 24 שעות כדי לעקוב אחר המוות.
   1. להעריך את התמותה בתחילה על ידי פיגמנטציה החשוך, היווצרות של כתמים שחורים או גופים, וחוסר תנועה. כדי לאשר התמותה, השתמש פינצטה כדי לגלגל בעדינות אדעך הזחלים על הגב שלהם ולעקור בקלילות התחתון של הזחלים עם הפינצטה. אי-היענות כפי שנצפה על ידי חוסר תנועה הגוף או רגל גלוי סאמפלרים כמוות, הזחלים יוסרו הפטרי.
9. לתעד את הזחלים התמותה במרוצת הזמן. הזחלים להתחיל pupate לתוך עש ניתן לכלול הניתוח אך יש להסיר אם הם מתחילים הנשירה. יכול להיות צנזורה הזחלים מאבריה מניתוח נקודת הקצה כמו ההבדלים התקפה אלימה בין הזחלים גולם אינם ברורים.
10. להעריך מובהקות סטטיסטית באמצעות מבחן סטטיסטי האח-קוקס.

תוצאות

. הנה, נדגים שיטה ישימה עבור השימוש mellonella ג waxworms לחקור מודל קנדידה המופץ של זיהום באמצעות אלביקנס ג. האחסון המתאים, תחזוקה מבחר של הזחלים זיהום הינם המכריעים של מבטח הפארמצבטית בתמותה mellonella ג (איור 1א'). הזחלים בריא הפעילים, יש צבע צהו...

Discussion

המודל waxworm mellonella ג עומד ככלי יעיל עבור ניתוח לשחזור וברכבות של התקפה אלימה אלביקנס ג . פרוטוקול מפורט זה נשענת על משלוח עקבי של מנה זיהומיות מוגדר לאותו אתר ברחבי אוסף של הזחלים. מינון זיהומיות יש השפעה עמוקה על התמותה mellonella ג ואילו השימוש הזחלים שלהם ההגעה הראשונית בין 10 ימי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O