Die Galleria Mellonella Waxworm Infektionsmodell für verbreitet Candidiasis

Zusammenfassung

Galleria Mellonella dient als ein Wirbellosen Modell für disseminierter Candidiasis. Hier beschreiben wir die Infektion Protokoll und unterstützende Daten für das Modell Wirksamkeit.

Zusammenfassung

Candida -Spezies sind häufige Pilzinfektionen Kommensalen des Menschen besiedeln, Magen-Darm-Trakt, Haut und Schleimhaut-Oberflächen. Unter bestimmten Bedingungen kann Candida überwuchern ihre natürliche Nischen wodurch schwächenden Schleimhaut Infektionen als auch lebensbedrohliche systemische Infektionen, sind ein wichtiger Schwerpunkt der Untersuchung wegen der damit verbundenen hohen Sterblichkeitsraten. Tiermodelle der disseminierten Infektion gibt es für Fortschreiten der Krankheit zu studieren und die Merkmale der Candida Pathogenität seziert. Von diesen bietet die Galleria Mellonella Waxworm Infektionsmodell ein kostengünstige experimentelles Werkzeug für Hochdurchsatz-Untersuchungen der systemischen Virulenz. Vielen anderen bakteriellen und Eukaryoten Krankheitserregern sind effektiv in G. Mellonella , Pathogenität, verstehen untersucht worden, so dass es eine weithin akzeptierte Modellsystem. Jedoch kann Variation in der Methode verwendet, um G. Mellonella infizieren verändern phänotypischen Ergebnisse und Interpretation der Ergebnisse erschweren. Hier beschreiben wir die vor- und Nachteile des Modells Waxworm zu studieren systemischen Candida -Pathogenese und detail einen Ansatz zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit. Unsere Ergebnisse markieren Sie den Bereich der Sterblichkeit Kinetik in G. Mellonella und beschreiben Sie die Variablen, die diese Kinetik modulieren können. Schließlich steht diese Methode als eine ethische, schnelle und kostengünstige Ansatz zur Virulenz in einem Modell von disseminierter Candidiasis zu studieren.

Einleitung

Candida -Spezies sind gemeinsame menschliche Kommensalen, die in der Lage als opportunistische Krankheitserreger in Schwellenländern sind stark immungeschwächten und Dysbiotic Patienten. Obwohl viele Candida -Spezies Krankheit verursachen können, ist C. Albicans die am weitesten verbreitete Ursache von disseminierter Candidose^1,2. Systemische Erkrankung ergibt sich aus C. Albicans Zugriff auf den Blutkreislauf durch entweder direkte Penetration der bisher restriktiven Host Barrieren oder Einführung in chirurgischen Websites und andere Verstöße gegen die Körper-³. Candida -Spezies nutzen eine Reihe von pathogenen Prozessen, systemische Erkrankung innerhalb des Hosts, einschließlich Filamentierung, Biofilmbildung Immunzelle ausweichen und entkommen und Eisen⁴Aufräumvorgang zu verursachen. In-vitro- Methoden existieren um individuelle pathogenen Mechanismen zu untersuchen, aber Tiermodellen weiterhin die beste Option, um die Gesamtheit der Krankheit Ergebnis^5,6untersuchen. Die bisherige Forschung hat viele Instanzen der vielversprechenden in-vitro- Untersuchungen der Virulenz zu reproduzieren in Vivo^7,8detaillierte. So, Tiermodelle sind erforderlich, um die Virulenz zu bewerten in-vivo. Die meisten Krankheitsmodelle setzen auf Mäuse, als Surrogat für Infektionen beim Menschen trotz C. Albicans Unfähigkeit, natürlich murinen Systeme besiedeln als Kommensalen⁹dienen. Wirbellosen Modelle von disseminierter Candidiasis gehören der Fadenwurm Caenorhabditis Elegans, die Frucht zu fliegen, Drosophila Melanogasterund Waxworm Galleria Mellonella, obwohl Bedenken über grundsätzliche Unterschiede in grundlegende Physiologie haben Host Körpertemperaturen und Expositionswege ihre breite Akzeptanz^10,11. behindert

Vor kurzem wurde die G. Mellonella Waxworm Infektionsmodell, Modell Pathogenität einer Vielzahl von bakteriellen und pilzlichen Krankheitserregern^12,13,14übernommen. Vorteile dieses Modells sind die relativ geringen Kosten, erhöhter Durchsatz, Benutzerfreundlichkeit und ethische Bedenken bezüglich tierischen Wohltätigkeit gegenüber murinen Modellen reduziert. Für Forscher bedeutet dies höhere Fähigkeit, mehrere Variablen, stärkere Konfidenzintervalle, schnellere experimentieren und Umgehung des tierischen Protokolle zu testen. G. Mellonella diente als Plattform, um schnell beurteilen, C. Albicans Virulenz nach Störung der Gene, die erforderlich für Biofilm-Bildung, Filamentierung und gen-Verordnung über klinische Isolate^{11,15 ,16}. Jüngste Studien haben Untersuchung antimykotische Wirksamkeit mit G. Mellonella bewerten die Pharmakokinetik von Drogetätigkeit und Widerstand unter in-Vivo -Einstellungen, die sonst schwierig und zeitaufwendig ^{sind integriert 17,18}. Jedoch haben Studien von C. Albicans Virulenz in G. Mellonella kompliziert durch angeblich hohe Variation innerhalb Experimente und inkonsistente Protokolle zwischen Forschungsgruppen, die unterschiedliche Virulenz Phänotypen erzeugen zwischen Mäusen und Waxworms^{11,13,19,20,21}. Hier beschreiben wir eine G. Mellonella Protokoll zur Standardisierung von C. Albicans Infektionen, Erhöhung der Reproduzierbarkeit in Virulenz Experimente, und Übereinstimmung mit den zuvor beschriebenen Studien der Virulenz in Murine zu demonstrieren Modelle.

Frühere Studien gezeigt, dass die Paarung Typ-wie (MTL) Locus auf Chromosom 5 C. Albicans Zelle Identität und Kompetenz ähnlich Saccharomyces Cerevisiae und andere Ascomycete Pilze²²Paarung regelt. Die Mehrheit der C. Albicans Isolate sind heterozygot MTL Locus, Codierung eines jeden der MTLein und MTLα Allele(MTL/α), und sind folglich steril^{15, 23 , 24}. Verlust eines MTL Allele durch Verlust der Heterozygotie (LOH) oder Mutation führt zu homozygoten MTLein oder MTL-α-Stämme, die einen phänotypischen Wechsel von der sterilen "weiße" Zustand zu unterziehen, können die Paarung zuständigen "undurchsichtig" Staat²⁵. Bisherigen Arbeit hat hervorgehoben, dass Verlust der Heterozygotie MTL Virulenz in murinen Modellen einer systemischen Infektion über anderen Stamm Hintergründe²⁶reduziert. Hier zeigen wir das G. Mellonella Modell für disseminierter Candidose mit genetisch ähnliche experimentelle können Sie den Beitrag der MTL Heterozygotie, Virulenz in G. Mellonelladarzustellen. Wir zeigen, dass MTL Konfiguration beeinflusst C. Albicans Pathogenität, wo MTLα Stämme waren weniger virulenten sowohl in Bezug auf MTL/α MTLein Zellen, ähnlich wie Erkenntnisse in murinen Infektion Modell²⁶.

Protokoll

Alle beschriebene Methoden setzen auf Einsatz von Wirbellosen Gastgeber und bedürfen keiner Zustimmung der institutionellen Animal Care und verwenden Committee (IACUC).

1. Galleria Mellonella Waxworm Larven

1. Bestellen Sie Larven von Großhändlern und Lieferanten, die nicht einzuführen, Hormone, Antibiotika oder andere Behandlungen für die Larven und die sind in der Lage zu versenden und liefern lebende Exemplare.
   1. Achten Sie darauf, alle Larven vom gleichen Lieferanten im Laufe des Experimentierens zu erwerben. Seien Sie vorsichtig wenn Sie Larven während der Sommermonate zu bestellen, als Temperaturen über 30 ° C Larven Rentabilität verringern.
   2. Überwachen von Temperaturen über der erwarteten Versandweg und Versand- und Lieferbedingungen entsprechend zu planen oder wählen Sie Expressversand ihrer Exposition gegenüber Umweltbedingungen zu minimieren.
2. Wenn Larven ankommen, überprüfen Sie jedes Containers um sicherzustellen, dass tragfähige, gesunde Larven vorhanden sind. Gesunde Larven werden unter das Bettzeug, Umzug, völlig untergetaucht werden und besitzen eine helle gelb/rote Färbung mit wenigen Larven mit schwarzen Flecken oder Verfärbungen am Körper entlang.
3. Larven in ihren Behälter in einem belüfteten Raum bei Raumtemperatur (25 ° C) aufbewahren. Je nach dem ursprünglichen Zustand der Larven können sie bis zu zwei Wochen verwendet werden.

(2) Kultur Vorbereitung auf Galleria Mellonella Infektion

Hinweis: Richtige Lab Kleidung sollte während dieser Teil des Protokolls darunter Handschuhe, Kittel und Schutzbrille getragen werden.

1. Stellen Sie Hefe Pepton Traubenzucker (YPD) Flüssigkeit und Agar-Platten. 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 70 % Ethanol Lösungen vorzubereiten.
2. Wachsen Sie C. Albicans -Stämme in 3 mL frische YPD in standard Kultur Röhren auf einer rotierenden Trommel mit mittlerer Geschwindigkeit und 30 ° c über Nacht injiziert werden
3. Drehen Sie Zellen mit 2.500 x g für 5 min in einer Tischplatte Zentrifuge nach unten. Überstand, wobei Sie darauf achten, nicht zu stören das Zelle-Pellet abgießen.
   1. Aufschwemmen Sie Zellen vollständig in 5 mL 1 X PBS durch wiederholte Pipettieren oder aufschütteln. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Wiederfreisetzung Zellen in PBS zweimal mehr Entfernung aller Kultur Medien sicherzustellen.
4. Aufschwemmen Sie nach dem letzten Waschen Zellen in 1 mL PBS und übertragen Sie sie auf einem Microcentrifuge Schlauch.
5. Führen eine Reihe von seriellen Verdünnungen in PBS generieren eine 1: 100, 1:1 000 und 1: 100.000 Verdünnungsreihe.
   Hinweis: Alternative Verdünnungen möglicherweise notwendig, um gewünschte Zellenzahlen erreichen.
   1. Mit einem Hemocytometer, zählen Sie Zellen aus der 1: 100 oder die 1:1,000 Verdünnung. In den meisten Fällen bietet die 1:1,000 Verdünnung die entsprechende Zelle für C. Albicans Kulturen zählt.
   2. Berechnen Sie die Gesamtkonzentration von Zellen innerhalb der ursprünglichen Kultur über die Raster-Mathematik der Hemocytometer, mit dem Ziel, zwischen 30-300 Zellen in dem zentralen 5 x 5 Raster gezählt werden. Als Alternative kann ein automatisierter Zelle Zähler verwendet werden; Nutzung der optischen Dichte bestimmen Zellenzahlen wird abgeraten, als Zelle Morphologie (Größe, Form, etc.) kann jedoch deutlich seine Genauigkeit beeinflussen.
6. Mit der gemessenen Zellenzahlen stellen Sie eine neue Verdünnung der 2.5x10⁷ Zellen/mL in 1 X PBS in einem Microcentrifuge Schlauch. Diese Verdünnung dient als Grundlage für jede Impfung von G. Mellonella mit C. Albicans. Jeder Injektion benötigen 10 µL dieses Inokulum für eine infektiöse Dosis von 250.000 C. Albicans Zellen.
7. Bestätigen Sie die Richtigkeit der die infektiöse Dosis durch Ausplattieren das korrekte Volumen der Verdünnung 1: 100.000 für 100 Kolonie bildende Einheiten (KBE) auf YPD Agar für jede Kultur in Infektion verwendet werden.
8. Graf Zellplatten aus Schritt 2.7 für 48 Stunden (h) bei 30 ° C inkubieren und die Anzahl der Kolonien pro Platte. Zwischen 80 und 120 Kolonien bildet einen akzeptablen Bereich für Genauigkeit in das Inokulum.

3. Infektion der Galleria Mellonella Larven mit Candida Kulturen

Hinweis: Richtige Lab Kleidung sollte während dieser Teil des Protokolls darunter Handschuhe, Kittel und Schutzbrille getragen werden.

1. Zwei separate Mikrozentrifugenröhrchen 1 mL 100 % Ethanol und 1 mL 1 X PBS hinzufügen. Ethanol und PBS wird verwendet um die Injektionsnadel zwischen Infektionen zu waschen.
2. Verteilen Sie eine kleine Menge Waxworm Bettwäsche in einem leeren, sterile Petrischale 100 x 15 mm, die die Larven nach Impfung für jede unabhängige Belastung beherbergen wird. Ergänzung der Einstreu begrenzt Einhaltung der Toten G. Mellonella Larven an die Oberfläche der Petrischale.
3. Eine 26 G, 10 µL Spritze durch aufgreifen und expunging 10 µL 70 % Ethanol dreimal gefolgt von drei Wäschen mit 10 µL 1 X PBS zu sterilisieren. Wirbel der Inokulation Verdünnung von C. Albicans und nehmen 10 µL der Kultur. Sicherzustellen Sie, dass keine Luftblasen in der Spritze als Injektion von Luft Tod fördert und nachgelagerte Analyse zu erschweren.
4. Öffnen Sie einen Behälter mit G. Mellonella Larven und drehen Sie vorsichtig Bettwäsche mit einem Finger um Larven zu entdecken. Wählen Sie Larven, die bei guter Gesundheit sind, wie durch aktive Bewegung, eine gelb/rote Farbe und einen Mangel an schwarze Pigmentierung auf den Larven Körper identifiziert. Diese Larven sind von ähnlicher Größe über die volle experimentelle festzusetzen.
5. Nehmen Sie eine einzelne Larven und halten Sie ihn sanft zwischen den Index/Mittelfinger und Daumen ähnlich wie einen Stift halten. Rollen Sie die Larven auf den Rücken, so dass die Beine nach oben zeigt. Halten Sie die volle Länge des Körpers zwischen die Finger und Daumen, so dass die Larven ist nicht in der Lage, Rollen oder ziehen weg von der Injektion.
   Hinweis: Falls gewünscht, Sterilisieren der Injektionsstelle mit einem Wattestäbchen, getränkt in 100 % igem Ethanol.
6. Drehen Sie die Spritze so Abschrägung der Nadel nach oben zeigt, und fügen Sie langsam die Nadelspitze unter anderem die Länge der Fase in den Körper an der Kreuzung mit dem hintersten linken Bein. Stellen Sie sicher, dass die Nadel dringt in den Körper und nicht einfach den Körper der Larven nach innen drücken. Nicht mit Gewalt in den Körper eindringen, da die Nadel vollständig die Larven schnell durchdringen kann. Leichtes Anheben mit der Nadel werden entsprechende eindringen bestätigen. Injizieren Sie das volle 10 µL Candida Inokulum zu und extrahieren Sie die Nadel.
7. Wiederholen Sie Schritt 3.3-3.5 für jede Larven. Zelle, Abrechnung, Wirbel die Candida zu verhindern Kulturen für die Impfung nach jeder dritten Injektion. Als Kontrolle eine Reihe von G. Mellonella mit 10 µL 1 X PBS zu injizieren.
8. Co Haus 10 Larven aus der gleichen Candida -Kultur in jeder 100 x 15 mm Petrischale nach Inokulation eingespritzt. Acht Tage, die Larven alle 24 h zu überprüfen, um Tod zu überwachen inkubieren Sie Larven bei 37 ° C.
   1. Sterblichkeit zunächst durch dunkle Pigmentierung, die Bildung von schwarzen Flecken oder Einrichtungen, zu bewerten und ein Mangel an Bewegung. Um die Sterblichkeit zu bestätigen, benutzen Sie eine Pinzette sanft sterbende Larven auf den Rücken Rollen und leicht stecken die Larven Unterseite mit der Pinzette. Non-Reaktionsfähigkeit wie durch einen Mangel an sichtbaren Körper oder Bein Bewegung beobachtet wird bewertet, wie der Tod und die Larven sind aus der Petrischale entfernt.
9. Sterblichkeit der Larven über den zeitlichen Verlauf aufzeichnen. Larven, die beginnen in Motten verpuppen können in die Analyse einbezogen werden, aber sollte entfernt werden, wenn sie beginnen zu mausern. Verpuppung Larven können vom Endpunkt Analyse zensiert werden, da die Virulenz Unterschiede zwischen Larven und Puppen unklar sind.
10. Statistischen Signifikanz mit Mantel-Cox statistischen Test zu bewerten.

Ergebnisse

Hier zeigen wir eine reproduzierbare Methode für die Verwendung von G. Mellonella Waxworms ein disseminierter Candidiasis Modell einer Infektion mit C. Albicansuntersuchen. Die fachgerechte Lagerung, Wartung und Auswahl der Larven für eine Infektion sind wesentlicher Bestandteil der Versicherung Reproduzierbarkeit G. Mellonella Sterblichkeit (Abb. 1A). Gesunde Larven, die aktiv sind, haben eine helle Farbe gelb/ta...

Diskussion

G. Mellonella Waxworm Modell steht als ein wirksames Instrument für die schnelle und reproduzierbare Analyse von C. Albicans Virulenz. Dieses ausführliche Protokoll stützt sich auf konsistente Bereitstellung einer definierten infektiöse Dosis an der gleichen Stelle über einen Stapel von Larven. Infektiöse Dosis hat tiefgreifende Auswirkungen auf die G. Mellonella Mortalität während der Verwendung von Larven zwischen ihren ersten Ankunft und zehn Tagen nach Erhalt zu ähnlichen Ergebniss...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Galleria mellonella	Snackworms.com		Buy twice as many worms as expected to use
10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
autoclaved ddH2O