갤러리아 mellonella Waxworm 감염 모델 전파 칸디 다에 대 한

요약

갤러리아 mellonella 전파 칸디 다에 대 한 무척 추 동물 모델 역할을 합니다. 여기, 우리는 감염 세부 프로토콜 및 모델의 효과 대 한 지원 데이터를 제공.

초록

칸디 다 종은 피부, 점 막 표면 및 위장을 식민지 화 하는 인간의 일반적인 버섯 모양 공생 이다입니다. 특정 조건에서 칸디 다 잘으로 생명이 조직의 감염, 있는 그들의 관련 된 높은 사망률으로 인해 조사의 주요 초점으로 점 막 감염을 쇠 약의 결과로 그들의 자연적인 틈새 자라 다 수 있습니다. 동물 모델 전파 감염의 질병의 진행을 공부 하 고 해 부 Candida pathogenicity의 특성에 대 한 존재 합니다. 이들의 갤러리아 mellonella waxworm 감염 모델 조직 독성의 높은 처리량 조사에 대 한 비용 효율적인 실험 도구를 제공합니다. 다른 많은 세균과 진 핵 전염 성 요원 되어 효과적으로 공부 했다 G. mellonella pathogenicity, 이해 하기에 널리 허용된 모델 시스템을 만들기. 아직, G. mellonella 감염 하는 데 사용 하는 방법에 변화는 phenotypic 결과 변경 하 고 결과의 해석을 복잡 하 게 수 있습니다. 여기, 우리는 장점과 단점은 조직의 칸디 다 병 인을 연구 하 고 재현성을 향상 하는 방법을 자세히 waxworm 모델의 개요. 우리의 결과 G. mellonella 에서 사망률 속도의 범위를 강조 표시 하 고 이러한 활동을 조절 수 있는 변수를 설명. 궁극적으로,이 방법을 전파 칸디 다의 모델에서 독성 연구 윤리, 빠르고, 비용 효율적인 방식으로 서 있다.

서문

칸디 다 종에 기회 주의 병원 체로는 일반적인 인간의 공생은 심하게 immunocompromised 및 dysbiotic 환자. 많은 칸디 다 종의 질병을 일으킬 수 있습니다, 비록 C. albicans 전파 칸디 다 증^1,2의 가장 널리 퍼진 원인이 다. 조직의 질환 C. albicans 의 이전 제한 호스트 장벽 중 직접 침투 또는 외과 사이트 및 몸³의 다른 위반에 대 한 소개를 통해 혈 류를 액세스에서 발생 합니다. 칸디 다 종 다양 한 filamentation, biofilm 형성, 면역 세포 회피 및 탈출, 그리고 철⁴청소를 포함 하 여 호스트 내에서 조직의 질환을 일으키는 병원 성 프로세스를 활용 합니다. 개별 병원 성 기계 장치를 조사 하기 위해 존재 하는 생체 외에서 접근 하지만 동물 모델 질병 결과^5,6의 전체를 조사 하기 위해 최상의 옵션을 제공 하기 위해 계속. 이전 연구는^7,8 vivo에서재현 하는 데 실패 하는 독성의 생체 외에서 조사 약속의 많은 경우 자세한 있다. 따라서, 동물 모델은 여전히 독성을 평가 하는 데 필요한 vivo에서. 대부분 질병 모델 생쥐 C. albicans 자연스럽 게 공생⁹murine 시스템을 식민지로 무 능력에도 불구 하 고 인간의 감염에 대 한 대리 모 역할을 사용 합니다. 무척 추 동물 모델 전파 칸디 다의 선 충 류 꼬마 선 충, 비록 열매 Drosophila melanogaster, 그리고 waxworm 갤러리아 mellonella, 비행 근본적인 차이 대 한 우려 기본 생리학, 호스트 몸 온도 및 노출 경로 방해 그들의 광범위 한 수용^10,11.

가장 최근에, G. mellonella waxworm 감염 모델은 다양 한 세균과 곰 팡이 병원 균^12,,1314의 모델 pathogenicity에 채택 되었습니다. 이 모델의 장점, 사용의 용이성 및 murine 모델에 비해 동물 선행에 대하여 윤리적인 관심사를 감소의 상대적으로 저렴 한 비용, 증가 처리량을 포함 됩니다. 연구원에 대 한이 여러 변수, 강한 자신감을 간격, 더 빠른 실험 및 동물 프로토콜의 바이패스 테스트 증가 수로 변환 합니다. G. mellonella 빠르게 임상 격리^{11,15에서 biofilm 형성, filamentation, 및 유전자 규칙에 필요한 유전자의 섭 동을 따라 하는 C. albicans 독성을 평가 하기 위해 플랫폼을 역임 했다 ,16}. 최근 연구 조사 G. mellonella 를 사용 하 여 마약 활동 및 저항 설정 아래에서 vivo에서 , 그렇지 않으면 도전 및 시간이 걸리는 ^{의 약 동학을 평가 하기 위해 항진균 효능의 통합 17,18}. 그러나, G. mellonella 에서 C. albicans 독성의 연구 되어 복잡 한 실험과 다른 독성 고기를 생산 하는 연구 그룹 간의 일관성 프로토콜 내에서 변이의 소문에 하면 높은 수준에 의해 마우스 및 waxworms^{11,13,19,,2021}사이. 여기, 우리는 C. albicans 감염, 증가 재현성 독성 실험에서 표준화 murine에 독성의 앞에서 설명한 연구와 일관성을 입증 하는 G. mellonella 프로토콜 개요 모델입니다.

이전 학문 C. albicans 짝짓기 염색체 5에 유형 같은 (MTL) 로커 스 셀 정체성과 짝짓기 능력 Saccharomyces cerevisiae 와 다른 Ascomycete 균 류²²와 유사한 규제를 설명 했다. C. albicans 격리의 대다수는 MTL는 MTLα 대립 유전자의 (MTL가/α), 각각의 하나를 인코딩 MTL 로커 스 heterozygous은 되며 따라서 살 균^{15, 23 , 24}. heterozygosity (LOH) 또는 돌연변이의 손실을 통해 MTL 대립 유전자 중의 손실 homozygous MTL는 또는 MTLα 종자 살 균 '화이트' 상태에서 phenotypic 스위치를 받을 수 있는 지도 유능한 '불투명' 상태²⁵짝짓기. 이전 작업 MTL heterozygosity의 손실 또한 다른 스트레인 배경²⁶에 걸쳐 조직의 감염의 murine 모델에서 독성을 줄일 것을 강조 했다. 여기, 우리는 MTL heterozygosity G. mellonella에서 독성에의 기여를 묘사 하기 위해 유전으로 유사한 실험 세트를 사용 하 여 전파 칸디 다에 대 한 G. mellonella 모델 선발. 우리가 보여 MTL 구성 C. albicans pathogenicity 영향을 MTLα 긴장 했다 적은/α에 MTL및 MTL는 셀 결과 비슷한 악성 murine 감염 모델²⁶내.

프로토콜

설명 하는 모든 메서드는 무척 추 동물 호스트의 사용에 의존 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 승인 필요 하지 않습니다.

1. 갤러리아 mellonella Waxworm 애벌레

1. 도매 및 공급 업체는 호르몬, 항생제, 또는 다른 치료는 애벌레를 소개 하지 않습니다 및 배 고 라이브 표본 수에서 애벌레를 주문.
   1. 실험의 과정에서 동일한 모든 애벌레를 구입 해야 합니다. 온도 30 ° C를 초과 감소 애벌레 생존 능력으로 여름 동안 애벌레를 주문 시 주의 해야 합니다.
   2. 예상된 배송 경로 걸쳐 온도 모니터링 및 운송 및 배달 따라 계획 또는 환경 조건에 그들의 노출을 최소화 하기 위해 신속한 배송을 선택.
2. 애벌레 도착할 때, 가능한, 건강 한 애벌레는 되도록 각 컨테이너를 확인 합니다. 건강 한 애벌레 이동, 침대 아래 완전히 빠져들 것입니다 그리고 검은 자국이 나 얼룩이 시체 따라 포함 된 몇 가지 애벌레와 빛 노란색/탄 색을 소유.
3. 주위 온도 (25 ° C)에 통풍이 공간에 그들의 컨테이너에 애벌레를 저장 합니다. 애벌레의 초기 상태에 따라 그들은 최대 2 주 동안 사용할 수 있습니다.

2. 문화 갤러리아 mellonella 감염에 대 한 준비

참고: 적절 한 실험실 복장 장갑, 안전 안경, 연구실 코트 등 프로토콜의이 부분에 걸쳐 착용 되어야 한다.

1. 효 모 펩 포도 당 (YPD) 액체와 한 천 격판덮개를 확인 합니다. 1 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 70% 에탄올 솔루션을 준비 합니다.
2. C. albicans 긴장 3 ml 신선한 YPD 중간 속도 30 ° C에서 회전 드럼에 표준 문화 관에서의 하룻밤 주입 성장
3. 탁상 원심 분리기에 5 분 동안 2500 x g에서 셀 아래로 회전 합니다. 상쾌한, 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 되 고 떨어져 부 어.
   1. 1 x PBS의 5 mL에 완전히 셀 반복 pipetting 또는 vortexing resuspend. 원심 분리와 모든 문화 미디어의 제거를 확인을 두 번 더 PBS에 셀의 물의 resuspension 반복 합니다.
4. 최종 세척 후 1 mL의 PBS에 셀 resuspend 하 고 microcentrifuge 튜브에 그들을 전송 합니다.
5. PBS 생성 1: 100, 1:1, 000, 직렬 희석의 집합을 수행 하 고 1:100,000 희석 시리즈.
   참고: 대체 희석 원하는 셀 수를 도달 하는 데 필요한 수 있습니다.
   1. hemocytometer를 사용 하는 1: 100 또는 1:1,000 희석에서 셀 계산. 가장 자주, 1:1,000 희석 C. albicans 문화에 대 한 적절 한 셀 계산을 제공 합니다.
   2. 중앙 5 x 5 격자에 계산을 30-300 셀 사이 목표로 hemocytometer의 눈금 수학 사용 하 여 초기 문화 내의 셀의 총 농도 계산 합니다. 자동된 셀 카운터; 대신 사용할 수 있습니다. 그러나, 셀 카운트 셀 형태 (크기, 모양, 등)로 낙담 결정 광학 밀도의 사용의 정확성에 영향을 크게 수 있습니다.
6. 측정된 셀 수를 사용 하 여, microcentrifuge 튜브에 1 x PBS에 2.5x10⁷ 셀/mL의 새로운 희석을 확인 합니다. C. albicans와 G. mellonella 의 각 접종에 대 한 기준으로이 희석 될 것입니다. 각 주입이이 inoculum의 10 µ L 250000 C. albicans 세포의 감염 복용량 필요 합니다.
7. 감염에 사용 되는 각 문화에 대 한 한 천 YPD에 100 콜로 니 형성 단위 (CFUs)에 대 한 1:100,000 희석의 올바른 볼륨을 도금 하 여 전염 하는 복용량의 정확성을 확인 합니다.
8. 30 ° C에서 48 시간 (h) 단계 2.7에서에서 셀 수 번호판을 품 어 고 접시 당 식민지의 수를 계산. 80와 120 식민지 사이 inoculum 정확도 대 한 허용 범위를 구성합니다.

3. 감염 Candida 문화 갤러리아 mellonella 애벌레의

참고: 적절 한 실험실 복장 장갑, 안전 안경, 연구실 코트 등 프로토콜의이 부분에 걸쳐 착용 되어야 한다.

1. 두 개의 별도 microcentrifuge 튜브를 1 mL 100% 에탄올 및 1 x PBS의 1 mL를 추가 합니다. 에탄올과 PBS 씻어 감염 사이 주입 바늘 사용 됩니다.
2. 빈, 각 독립 스트레인에 대 한 접종을 다음 애벌레 집 100 x 15 m m 무 균 배양 접시에서에서 waxworm 침구의 작은 금액을 확산. 침구 추가 제한 준수의 페 트리 접시 표면에 G. mellonella 애벌레.
3. 26 G, 70% 에탄올 1 x PBS의 10 µ L로 세 세척 뒤 세 번의 10 µ L를 expunging 여 10 µ L 주사기 소독. C. albicans 및 문화의 10 µ L 차지 접종 희석 소용돌이. 공기의 주입 죽음을 촉진 하 고 다운스트림 분석을 복잡 하 게 주사기 내 공기 거품 없는 인지 확인 합니다.
4. G. mellonella 애벌레를 보유 하는 컨테이너를 열고 애벌레를 밝히기 위해서 손가락으로 침구를 뒤집어 신중 하 게 합니다. 활성 운동, 연한 노란색/탄 색, 그리고 유 충 몸에 검은 착 색의 부족에 의해 발견으로 좋은 건강에 있는 애벌레를 선택 합니다. 이 애벌레 수 실험 전체에 걸쳐 비슷한 크기의 설정 해야 합니다.
5. 하나의 애벌레를 선택 하 고 그것을 잡고 부드럽게 인덱스/가운데 손가락과 엄지 사이 연필 들고 비슷하십시오. 그래서 다리 직면 하 고 그것의 뒤에 애벌레를 롤. 애벌레는 컬 또는 주사 멀리 당길 수 없습니다를 손가락과 엄지 사이 바디의 전체 길이 잡습니다.
   참고: 원하는 경우, 100% 에탄올에 배어 면봉을 사용 하 여 사출 사이트 소독.
6. 주사기 바늘의 경사가 위를 향하도록 회전 하 고 천천히 경계의 뒤쪽 왼쪽된 다리와 교차점에서 몸으로 빗면의 길이 포함 하 여 바늘 끝을 삽입 합니다. 바늘은 신체를 관통 하 고 애벌레 안쪽의 시체를 단순히 밀어 하지 않습니다 확인 합니다. 힘을 사용 하지 마십시오 바늘 애벌레를 통해 신속 하 게 완전히 관통할 수 있습니다 대로 시체를 관통에서. 부드럽게 바늘 해제 적절 한 침투를 확인할 것 이다. 전체 10 µ L Candida inoculum을 삽입 하 고 바늘을 추출 합니다.
7. 각 애벌레에 대 한 3.3-3.5 단계를 반복 합니다. 정착, 소용돌이 칸디 다 세포를 방지 하기 위해 모든 3 주사 후 접종에 대 한 문화. 컨트롤, 1 X PBS의 10 µ L로 G. mellonella 집합 주사.
8. 접종을 다음 각 100 x 15 mm 페 트리 접시에 같은 칸디 다 문화에서 주입 하는 공동 집 10 애벌레 8 일, 죽음을 모니터링할 애벌레 마다 24 시간 검사에 대 한 37 ° C에서 애벌레를 품 어.
   1. 어두운된 착 색, 블랙 패치 또는 시체의 형성에 의해 처음 사망률 평가 및 운동 부족. 사망 확인, 부드럽게 죽어가는 애벌레 그들의 뒤에 고 가볍게는 핀셋으로 애벌레의 밑면을 찌를 핀셋을 사용 합니다. 비-응답 보이는 바디 또는 다리 운동의 부족에 의해 관찰로 죽음으로 득점 하 고 애벌레 배양 접시에서 제거 됩니다.
9. 시간에 걸쳐 애벌레 사망률을 기록 합니다. 애벌레 나 방으로 pupate를 시작 하는 분석에 포함 될 수 있습니다 하지만 그들은 털 갈이를 시작 하는 경우 제거 해야 합니다. 용 애벌레 애벌레와 번데기의 독성 차이점은 분명 끝점 분석에서 검열 될 수 있다.
10. 벽난로-콕스 통계 테스트를 사용 하 여 통계적 의미를 평가 합니다.

결과

여기, G. mellonella waxworms 조사 C. albicans를 사용 하 여 감염의 전파 칸디 다 모델의 사용에 대 한 재현 방법을 보여 줍니다. 보관, 유지 관리 및 감염에 대 한 애벌레의 선택 G. mellonella 사망 (그림 1A)에 재현성을 보험사의 중요 한 구성 요소입니다. 활성, 건강 한 애벌레 연한 노란색/탄 색, 그리고이 시스템은 일반적으로 ?...

토론

G. mellonella waxworm 모델 C. albicans 독성의 신속 하 고 재현성 분석을 위한 효과적인 도구로 서 있다. 이 상세한 프로토콜 애벌레의 일괄 처리에서 동일한 사이트에 정의 된 감염 복용량의 일관 된 납품에 의존합니다. 감염 복용량 애벌레 그들의 초기 도착 및 영수증을 다음 10 일 사이 사용 하 여 비슷한 결과 생산 하는 반면 G. mellonella 사망률에 지대한 영향을 있다. MTLα 대립 ...

자료

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10 uL, Model 1701 N SYR Cemented needle, 26G, type 2 syringe	Hamilton	80000
Petri dish, 100X15 mm, 500 pack	Fisher	FB0875712
Microcentrifuge tube, 1.7 mL, 500 pack	VWR	87003-294
Phosphate Buffered Saline (Biotechnology grade), 500 mL	VWR	97062-818
Ethanol absolute, ≥99.5% pure, 500 mL	Millipore Sigma	EM-EX0276-1S
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