Uso de microarrays para interrogar el impacto microambiental en fenotipos celulares en cáncer

Resumen

El propósito del método presentado aquí es mostrar cómo los microarrays de microambiente (MEMA) pueden ser fabricados y utilizados para interrogar el impacto de miles de microambientes combinatorios simples en el fenotipo de las células cultivadas.

Resumen

Comprender el impacto del microambiente en el fenotipo de las células es un problema difícil debido a la compleja mezcla de factores de crecimiento solubles y proteínas asociadas a la matriz en el microambiente in vivo. Además, los reactivos fácilmente disponibles para el modelado de microambientes in vitro suelen utilizar mezclas complejas de proteínas que están incompletamente definidas y sufren de variabilidad lote a lote. La plataforma de microarray (MEMA) permite evaluar miles de combinaciones simples de proteínas de microambiente por su impacto en los fenotipos celulares en un solo ensayo. Los MEMA se preparan en placas de pozos, lo que permite la adición de ligandos individuales para separar los pocillos que contienen proteínas de matriz de matriz extracelular (ECM). La combinación del ligando soluble con cada ECM impreso forma una combinación única. Un ensayo MEMA típico contiene más de 2.500 microambientes combinatoriales únicos a los que las células están expuestas en un solo ensayo. Como caso de prueba, la línea celular de cáncer de mama MCF7 estaba chapada en la plataforma MEMA. El análisis de este ensayo identificó factores que mejoran e inhiben el crecimiento y la proliferación de estas células. La plataforma MEMA es altamente flexible y se puede ampliar para su uso con otras cuestiones biológicas más allá de la investigación del cáncer.

Introducción

El cultivo de líneas celulares cancerosas en plástico en monocapas bidimensionales (2D) sigue siendo uno de los principales caballos de batalla para los investigadores del cáncer. Sin embargo, el microambiente está siendo cada vez más reconocido por su capacidad para afectar a los fenotipos celulares. En el cáncer, se sabe que el microambiente tumoral influye en múltiples comportamientos celulares, incluyendo el crecimiento, la supervivencia, la invasión y la respuesta a la terapia^1,2. Los cultivos celulares monocapa tradicionales suelen carecer de influencias en el microambiente, lo que ha llevado al desarrollo de ensayos tridimensionales (3D) más complejos para cultivar células, incluidos los extractos de membrana de sótano purificados disponibles comercialmente. Sin embargo, estas matrices purificadas suelen ser complicadas de usar y sufren de problemas técnicos como la variabilidad de lotes³ y composiciones complejas^3. Como resultado, puede ser difícil asignar la función a proteínas específicas que pueden estar afectando a los fenotipos celulares³.

Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado la tecnología de microarray (MEMA), que reduce el microambiente a combinaciones simples de matriz extracelular (ECM) y proteínas de factor de crecimiento soluble^4,5 . La plataforma MEMA permite identificar factores microambientales dominantes que afectan el comportamiento de las células. Mediante el uso de un formato de matriz, se pueden analizar miles de combinaciones de factores de microambiente en un solo experimento. El MEMA descrito aquí interroga 2.500 condiciones únicas de microambiente diferentes. Las proteínas ECM impresas en placas de pozos forman almohadillas de crecimiento sobre las cuales se pueden cultivar células. Los ligandos solubles se añaden a los pozos individuales, creando microambientes combinatorias únicos (ECM + ligando) en cada punto diferente al que están expuestas las células. Las células se cultivan durante varios días, luego se fijan, manchan e imágenes para evaluar los fenotipos celulares como resultado de la exposición a estas combinaciones específicas de microambiente. Dado que los microambientes son combinaciones simples, es sencillo identificar proteínas que impulsan cambios fenotípicos importantes en las células. Los MEMA se han utilizado con éxito para identificar factores que influyen en múltiples fenotipos celulares, incluyendo aquellos que impulsan las decisiones del destino celular y la respuesta a^laterapia⁴,^5,6,7. Estas respuestas se pueden validar en experimentos 2D simples y luego se pueden evaluar en condiciones que recapitulan más plenamente la complejidad del microambiente tumoral. La plataforma MEMA es altamente adaptable a una variedad de tipos de células y puntos finales, siempre que estén disponibles buenos biomarcadores fenotípicos.

Protocolo

NOTA: En el diagrama de flujo que se muestra en la Figura 1se describe una descripción general de todo el proceso MEMA, incluido el tiempo estimado. Este protocolo detalla la fabricación de MEMAs en placas de 8 pocillos. El protocolo puede adaptarse a otras placas o portaobjetos.

1. Preparación de tampones de proteínas, diluyentes y tinción

1. Equilibrar viales de EME, ligandos y citoquinas a temperatura ambiente (RT) y centrífuga brevemente. Agregue el volumen adecuado del búfer RT adecuado como se indica en la hoja de datos del producto. Siga las recomendaciones del fabricante para las concentraciones de stock.
   NOTA: En el Cuadro 1 y en el Cuadro 2se ofrece una lista completa de los ligandos y eFEC con sus existencias y concentraciones finales. Tanto los ligandos como los EME se utilizan típicamente en la concentración más alta de la gama recomendada por el fabricante que provoca un efecto biológico en los ensayos de cultivo estándar de 2 días. Manipule las proteínas suavemente y en los gabinetes de bioseguridad bajo flujo laminar para evitar la contaminación.
2. Incubar viales con balanceo suave a RT durante 1 h. No vórtice proteínas, ya que esto puede hacer que desnaturalicen.
3. Proteínas aliquot para almacenamiento a largo plazo de modo que todas las alícuotas sean de un solo uso para evitar la degradación con ciclos repetidos de congelación/descongelación. Almacene las proteínas liofilizadas a -80 oC (a menos que se especifique lo contrario) hasta que sea necesario. Tenga cuidado de recopilar todos los metadatos para futuras referencias, tales como: (i) nombre de proteína, (ii) fecha preparada, (iii) número de lote/lote, (iv) proveedor, (v) número de catálogo, (vi) concentración, (vii) volumen y (viii) preparador.
4. Prepare el tampón diluente que contenga 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7.2 y esterilizar filtro. Mantenga este búfer estéril y guárdelo en RT.
5. Prepare el tampón de tinción que contenga 2% (p/v) de BSA, 1 mM MgCl₂y 0,02% NaN₃ en solución salina tamponada de fosfato (PBS). Filtrar y almacenar a 4oC.

2. Preparación de una placa de origen ECM

1. Retire las existencias alícuotas de proteínas ECM que se imprimirán y descongelarán en hielo. Registre todos los números de lote para el seguimiento de metadatos.
2. Flick tubos de proteínas descongeladas suavemente para asegurar la resuspensión adecuada y girar hacia abajo en una centrífuga.
3. Haga mezclas de impresión ECM (ECM) y un fiduciario fluorescente para ser utilizado por un robot de manipulación de líquidos que creará las placas de fuente aleatorias de 384 pocillos.
   NOTA: Las placas de origen de 384 pocillos serán utilizadas por una impresora de matriz de pines táctiles para crear las matrices impresas en 8 placas de pozo.
   1. Etiquetar tubos de microcentrífuga de 1,5 ml para cada EPM y el fiduciario.
   2. Preparar cada EPM combinando 125 l de tampón diluyente (ver paso 1.4) con el volumen adecuado de stock de ECM y llevar la mezcla hasta un volumen total de 250 l con PBS. Las concentraciones finales en cada tubo EPM serán 1x proteína ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol y 100 mM Tris.
   3. Preparar un fiducial fluorescente disolviéndolo en el tampón apropiado especificado por el fabricante y transferir 250 l a un tubo fiduciario etiquetado.

3. Creación de la placa de origen mediante un manipulador de líquidos

1. Diseñe un diseño de placa de 384 pocillos que aleatore las posiciones de los EME y esté optimizado para el cabezal de pasador de impresora de matriz que se está utilizando. Diseñe la colocación del fiducial para que se imprima en la fila 1, columna 1 posición de cada pozo para ayudar en la orientación de la matriz.
   NOTA: Se utilizan un total de 14 a 15 réplicas de cada ECM para garantizar datos robustos. Incluya réplicas adicionales de colágeno u otro ECM que produzca un accesorio robusto para evaluar la uniformidad de la unión. El diseño puede necesitar utilizar varias placas de 384 pocillos dependiendo del número de ECM de interés.
2. Transfiera los tubos EPM a un manipulador de líquidos, manteniendo los tubos a 4 oC, ya sea con un bastidor de tubo refrigerado o utilizando un robot de manipulación de líquidos ubicado en una cámara fría.
3. Usando el software del controlador de líquidos, ejecute un programa para transferir 15 l de cada EPM y el fiduciario a los pozos predesignados dentro de la(s) placa(s) fuente(es) de 384 pocillos.
4. Pipet PBS en cualquier pozo no utilizado para aumentar la humedad y proteger contra la desecación durante el proceso de impresión.
   NOTA: Vea la Figura 2 para ver un ejemplo de un conjunto de placas de origen de 384 pocillos que está optimizado para una cabeza de 4 x 7 pines e incluye un bloque de colágeno I y PBS.
5. Sellar la(s) placa(s) y mantenerla a 4oC hasta que esté lista para imprimir.

4. Impresión de MEMA utilizando un robot de impresión de matriz

NOTA: La siguiente parte del protocolo describe específicamente la preparación y el uso de MEMA para investigar el impacto de diferentes proteínas de microambiente en el crecimiento y proliferación de células MCF7. Sin embargo, el protocolo se puede adaptar fácilmente para utilizar diferentes ligandos, eCM y celdas para estudiar otras líneas de celda y puntos finales de interés.

1. Con una impresora de pasador táctil, imprima ECM y puntos fiduciarios en 8 placas de pozo. Imprima múltiples réplicas de cada condición de ECM para garantizar la reproducibilidad.
   NOTA: Otros formatos de placas o diapositivas se pueden utilizar para la impresión, pero puede ser necesaria la optimización del búfer para lograr una formación de puntos óptima.
   1. Imprima los ECM para el MEMA utilizando pasadores de 350 m de diámetro dispuestos en una configuración de cabezal de impresión de 4 x 7. Imprima las matrices en las placas de 8 pocillos como 20 columnas por 35 filas, para un total de 700 puntos. Las matrices más grandes son posibles en estas placas, pero vienen con un equilibrio de efectos de borde aumentados en la unión celular y la tinción.
2. Después de imprimir, guarde las placas en un desecador durante un mínimo de 3 días antes de su uso.

5. Creación de placas de tratamiento de ligadas

1. Diseñe un diseño de placa de 96 pocillos que incluya ligandos de interés. Para facilitar el tratamiento de muchas placas MEMA a la vez, diseñe esta placa con espaciado que permita el uso de un pipeta multicanal con 4 puntas espaciadas para transferir líquidos entre los pocillos de los MEMA de 8 pocillos y una placa de 96 pocillos.
   NOTA: En este protocolo, se utiliza el conjunto completo de ligandos enumerados en el Cuadro 2.
2. Descongelar los ligandos en el hielo. Pase brevemente y gire por cada tubo.
3. Diluir los ligandos a un stock de trabajo 200x utilizando el búfer recomendado por el fabricante (normalmente PBS).
4. Pipet 10 l de cada lintíqueta de 200x en el pozo correspondiente dentro de la placa de 96 pocillos.
5. Sellar y almacenar las placas a -20 oC.
   NOTA: Haga placas de tratamiento de ligandos en lotes, capturando todos los metadatos para el análisis posterior.

6. Células de cultivo en MEMa

1. Bloquee los MEMA durante 20 min con 2 ml por pozo de tampón de bloqueo sin inserción que contenga un 1% de agente de bloqueo sin incrustantes (Tablade materiales)en agua destilada doble (ddH₂O).
2. Búfer de bloqueo de aspiración y pozos de enjuague triple con PBS. Para evitar la desecación, deje el volumen final de PBS en pozos hasta que esté listo para el revestimiento celular.
   NOTA: Es extremadamente útil tener dos trabajadores de banco para los pasos de cultivo celular en MEMa. Un trabajador de banco puede realizar pasos de aspiración, mientras que el segundo realiza pasos de adición. Se recomienda utilizar una tubería multicanal de 1 ml con puntas espaciadas para que coincida con la placa de 8 pocillos para pipeteo y un divisor Y con dos pipetas Pasteur para aspirar múltiples pozos a la vez.
3. Semilla 2 x 10⁵ Células MCF7 por pozo en 2 ml del medio medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene 10% suero bovino fetal (FBS).
   NOTA: Antes de un experimento COMPLETO de MEMA, realice un experimento de valoración celular para optimizar los números de celda de modo que los puntos MEMA tengan números de celda altos (pero no confluentes) al final de la duración experimental deseada.
4. Después de 2 a 18 h de adherencia, aspirar medio y reemplazar con 2 mL de medio de crecimiento reducido (DMEM con 0,1% FBS).
   NOTA: En este momento se puede utilizar en este momento un suero reducido (p. ej., 0,1% FBS) o condiciones agotadas por factores de crecimiento para aislar el impacto estimulante de ligandos específicos.
5. Descongelar una placa de tratamiento de ligando en hielo. Placa descongelación centrífuga a 200 x g durante 1 min.
6. Transfiera 200 ml de medio de cada pocal de la placa de cultivo al pozo adecuado de la placa de tratamiento. Pipet hacia arriba y hacia abajo para mezclar el volumen de ligando con medio y transferir esta mezcla de nuevo al pozo apropiado en la placa MEMA.
7. Ligeramente roca a mano y devolver las placas MEMA a la incubadora. Cultivo durante la duración del experimento en presencia de la combinación de ligando/ECM a 37oC y 5% de CO2.
   NOTA: Un experimento MEMA típico se ejecuta durante 72 h; experimentos de mayor duración pueden requerir la sustitución de medio y re-tratamiento con ligando.
8. Pulse pozos MEMA a 71 h con 100x 5-etil-2'-desoxiuridina (EdU) para una concentración final de 10 m. Incubar en condiciones experimentales con EdU durante 1 h a 37oC y 5% CO₂.
   NOTA: Otros tratamientos de células vivas también se pueden utilizar en este momento.

7. Fijación y tinción de MEMa

1. Después de 72 h y cualquier tratamiento celular vivo, aspirar pozos. Fijar MEMA en 2 mL por pozo de 2% paraformaldehído (PFA) durante 15 min en RT.
2. Aspirar PFA. Permeabilizar con 2 ml por pozo de tensioactivo no iónico 0,1% durante 15 min.
3. Aspirar el tensioactivo no iónico y lavar con 2 mL por pozo de PBS. Aspirar PBS. Lavar con 2 ml de PBS con 0,05% de polisorbato 20 (PBS-T).
   NOTA: La superficie MEMA es hidrófoba, y el no lavarse con PBS-T antes de la incubación de manchas y anticuerpos dará lugar a la formación de vacíos en pozos durante las etapas de incubación y dará lugar a artefactos de tinción.
4. Aspirar PBS-T. Agregue reactivos de reacción de detección de EdU. Incubar durante 1 h a RT, balanceándose y protegido de la luz. Después de 1 h de incubación, atemple la reacción con el tampón de temple comercial proporcionado.
   NOTA: Los pasos de detección y tinción/anticuerpos de EdU se pueden realizar en 1,5 ml por pozo para reducir el coste.
5. Aspirar el tampón de temple y lavar con PBS-T antes de incubar con manchas o anticuerpos.
6. Incubar pozos MEMA con anticuerpos contra la histona H3K9me3 (1:1.000) y la fibrilarina (1:400) en tampón de tinción que contenga un 2% (p/v) de albúmina sérica bovina (BSA), 1 mM MgCl₂ y 0,02% NaN₃ durante la noche a 4oC.
   NOTA: Realice valoraciones de anticuerpos para determinar las concentraciones óptimas antes de usarlas en un conjunto completo de MEMA.
7. Después de la incubación primaria de anticuerpos o manchas, lave los pozos 2 veces con PBS y una vez con PBS-T.
8. Añadir anticuerpos secundarios (nelvón anti-ratón IgG y burro anti-conejo IgG, ambos 1:300) y 0.5 g/mL 4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI). Incubar durante 1 h a RT en la oscuridad.
9. Lavar los pozos 2veces con 2 mL por pozo de PBS, dejándolos en los últimos 2 ml de PBS.
10. Proceda a la toma de imágenes o almacene MEMA manchados para obtener imágenes posteriores en PBS a 4 oC protegidos de la luz.

8. Imágenes de MEMAs

1. Imagen MEMA en un sistema de imágenes automatizado con canales de detección fluorescentes adecuados.
2. Salida de datos de imagen resultantes a un sistema de gestión de imágenes. Segmente las celdas y calcule los niveles de intensidad utilizando CellProfiler⁸.

9. Análisis de datos

NOTA: El análisis de datos consiste en la normalización, la corrección de variaciones y la integración de los datos derivados de CellProfiler sin procesar. En este caso, el entorno R con código personalizado se utiliza para realizar todos los pasos. Sin embargo, cualquier entorno estadístico o programa de software se puede utilizar para realizar las acciones equivalentes. Un ejemplo del código personalizado de código abierto para el entorno de R para el análisis está disponible en: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

1. Preprocesar y normalizar los datos de imagen segmentados.
2. Determine el recuento de células planas utilizando los núcleos manchados DAPI.
3. Auto-gate Intensidad EdU para etiquetar celdas como EdU⁺. Mida la proliferación usando la proporción de Células EDU⁺ en cada punto.
4. Mediana resumen las manchas citoplasmáticas y las mediciones de morfología nuclear a nivel de punto.
5. Realizar la eliminación de la normalización de variación no deseada (RUV) en los datos para mejorar la calidad de los datos⁹.
   NOTA: Este enfoque se aplica a cada señal de intensidad y morfología de forma independiente comouna matriz con matrices utilizando las filas y puntos como las columnas como se describió anteriormente 9.
6. Aplique la normalización de loess bivariados a los residuos normalizados del RUV utilizando la columna de fila y matriz de matriz como variables independientes para corregir los efectos espaciales o relacionados con la intensidad.
7. Una vez completada la normalización, la mediana resume las réplicas de cada condición de microambiente para la presentación de informes y análisis posteriores.

Resultados

Para simplificar los impactos microambientales en el crecimiento y la proliferación celular e identificar las condiciones que promovieron o inhibió el crecimiento celular y la proliferación, la línea celular de cáncer de mama MCF7 se sembraba en un conjunto de ocho MEMA de 8 pozos como se describe en el protocolo. Este ensayo expuso las células a 48 EME diferentes y 57 ligandos diferentes, para un total de 2736 condiciones microambientales combinatorias. Después de 71 h en cultivo, las células fueron pulsadas con...

Discusión

La importancia de la "dimensionalidad" y el contexto ha sido un factor motivador en el desarrollo de sistemas de cultivo in vitro como herramientas en la caracterización de las células cancerosas a través de su interacción con el microambiente^11,y la capacidad de in vitro sistemas de cultura para imitar el entorno in vivo es una fuerza impulsora detrás de la búsqueda de mejorar esos sistemas de cultivo. Los sistemas in vitro, sin embargo, siguen siendo herramientas significativas de la inves...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aushon 2470	Aushon BioSystems		Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA	Nikon		High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler	BioTek		liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution	Sigma	T2069
EDTA	Invitrogen	15575-038
Glycerol	Sigma	G5516
Triton X100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P7949
Kolliphor P338	BASF	50424591
384-well microarray plate, cylindrical well	Thermo Fisher	ab1055
Nunc 8 well dish	Thermo Fisher	267062
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Science	15710
BSA	Fisher	BP-1600
Sodium Azide	Sigma	S2002
Cell Mask	Molecular Probes	H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor	Molecular Probes	C10357
DAPI	Promo Kine	PK-CA70740043
ALCAM	R & D Systems	656-AL	ECM
Cadherin-20 (CDH20)	R & D Systems	5604-CA	ECM
Cadherin-6 (CDH6)	R & D Systems	2715-CA	ECM
Cadherin-8 (CDH8)	R & D Systems	188-C8	ECM
CD44	R & D Systems	3660-CD	ECM
CEACAM6	R & D Systems	3934-CM	ECM
Collagen I	Cultrex	3442-050-01	ECM
Collagen Type II	Millipore	CC052	ECM
Collagen Type III	Millipore	CC054	ECM
Collagen Type IV	Sigma	C5533	ECM
Collagen Type V	Millipore	CC077	ECM
COL23A1	R & D Systems	4165-CL	ECM
Desmoglein 2	R & D Systems	947-DM	ECM
E-cadherin (CDH1)	R & D Systems	648-EC	ECM
ECM1	R & D Systems	3937-EC	ECM
Fibronectin	R & D Systems	1918-FN	ECM
GAP43	Abcam	ab114188	ECM
HyA-500K	R & D Systems	GLR002	ECM
HyA-50K	R & D Systems	GLR001	ECM
ICAM-1	R & D Systems	720-IC	ECM
Laminin	Sigma	L6274	ECM
Laminin-5	Abcam	ab42326	ECM
Lumican	R & D Systems	2846-LU	ECM
M-Cad (CDH15)	R & D Systems	4096-MC	ECM
Nidogen-1	R & D Systems	2570-ND	ECM
Osteoadherin/OSAD	R & D Systems	2884-AD	ECM
Osteopontin (SPP)	R & D Systems	1433-OP	ECM
P-Cadherin (CDH3)	R & D Systems	861-PC	ECM
PECAM1	R & D Systems	ADP6	ECM
Tenascin C	R & D Systems	3358-TC	ECM
VCAM1	R & D Systems	ADP5	ECM
Vitronectin	R & D Systems	2308-VN	ECM
Biglycan	R & D Systems	2667-CM	ECM
Decorin	R & D Systems	143-DE	ECM
Periostin	R & D Systems	3548-F2	ECM
SPARC/osteonectin	R & D Systems	941-SP	ECM
Thrombospondin-1/2	R & D Systems	3074-TH	ECM
Brevican	R & D Systems	4009-BC	ECM
Elastin	BioMatrix	5052	ECM
Fibrillin	Lynn Sakai Lab OHSU	N/A	ECM
ANGPT2	RnD_Systems_Own	623-AN-025	Ligand
IL1B	RnD_Systems_Own	201-LB-005	Ligand
CXCL8	RnD_Systems_Own	208-IL-010	Ligand
IGF1	RnD_Systems_Own	291-G1-200	Ligand
TNFRSF11B	RnD_Systems_Own	185-OS	Ligand
BMP6	RnD_Systems_Own	507-BP-020	Ligand
FLT3LG	RnD_Systems_Own	308-FK-005	Ligand
CXCL1	RnD_Systems_Own	275-GR-010	Ligand
DLL4	RnD_Systems_Own	1506-D4-050	Ligand
HGF	RnD_Systems_Own	294-HGN-005	Ligand
Wnt5a	RnD_Systems_Own	645-WN-010	Ligand
CTGF	Life_Technologies_Own	PHG0286	Ligand
LEP	RnD_Systems_Own	398-LP-01M	Ligand
FGF2	Sigma_Aldrich_Own	SRP4037-50UG	Ligand
FGF6	RnD_Systems_Own	238-F6	Ligand
IL7	RnD_Systems_Own	207-IL-005	Ligand
TGFB1	RnD_Systems_Own	246-LP-025	Ligand
PDGFB	RnD_Systems_Own	220-BB-010	Ligand
WNT10A	Genemed_Own	90009	Ligand
PTN	RnD_Systems_Own	252-PL-050	Ligand
BMP3	RnD_Systems_Own	113-BP-100	Ligand
BMP4	RnD_Systems_Own	314-BP-010	Ligand
TNFSF11	RnD_Systems_Own	390-TN-010	Ligand
CSF2	RnD_Systems_Own	215-GM-010	Ligand
BMP5	RnD_Systems_Own	615-BMC-020	Ligand
DLL1	RnD_Systems_Own	1818-DL-050	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	296-HR-050	Ligand
KNG1	RnD_Systems_Own	1569-PI-010	Ligand
GPNMB	RnD_Systems_Own	2550-AC-050	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	350-NS-010	Ligand
IL15	RnD_Systems_Own	247-ILB-005	Ligand
TNF	RnD_Systems_Own	210-TA-020	Ligand
IGFBP3	RnD_Systems_Own	675-B3-025	Ligand
WNT3A	RnD_Systems_Own	5036-WNP-010	Ligand
PDGFAB	RnD_Systems_Own	222-AB	Ligand
AREG	RnD_Systems_Own	262-AR-100	Ligand
JAG1	RnD_Systems_Own	1277-JG-050	Ligand
BMP7	RnD_Systems_Own	354-BP-010	Ligand
TGFB2	RnD_Systems_Own	302-B2-010	Ligand
VEGFA	RnD_Systems_Own	293-VE-010	Ligand
IL6	RnD_Systems_Own	206-IL-010	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	351-FS-010	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	378-SM	Ligand
IGFBP2	RnD_Systems_Own	674-B2-025	Ligand
SHH	RnD_Systems_Own	1314-SH-025	Ligand
FASLG	RnD_Systems_Own	126-FL-010	Ligand