Utilizzo di microarray per interrogare l'impatto microambientale sui fenotipi cellulari nel cancro

Riepilogo

Lo scopo del metodo qui presentato è quello di mostrare come i microarray di microambiente (MEMA) possono essere fabbricati e utilizzati per interrogare l'impatto di migliaia di semplici microambienti combinatori sul fenotipo delle cellule coltivate.

Abstract

Comprendere l'impatto del microambiente sul fenotipo delle cellule è un problema difficile dovuto alla complessa miscela di fattori di crescita solubili e proteine associate a matrici nel microambiente in vivo. Inoltre, i reagenti prontamente disponibili per la modellazione di microambienti in vitro in genere utilizzano complesse miscele di proteine che sono incompletamente definite e soffrono di variabilità in lotti. La piattaforma microarray microambiente (MEMA) consente la valutazione di migliaia di semplici combinazioni di proteine microambientali per il loro impatto sui fenotipi cellulari in un unico test. I MEMA sono preparati in piastre di pozzo, che consente l'aggiunta di singoli ligandri per separare pozzi contenenti proteine a matrice extracellulare (ECM) suddivise. La combinazione del ligando solubile con ogni ECM stampato forma una combinazione unica. Un tipico test MEMA contiene più di 2.500 microambienti combinatori unici a cui le cellule sono esposte in un unico test. Come test case, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata placcata sulla piattaforma MEMA. L'analisi di questo analisi ha identificato i fattori che migliorano e inibiscono la crescita e la proliferazione di queste cellule. La piattaforma MEMA è altamente flessibile e può essere estesa per l'uso con altre questioni biologiche al di là della ricerca sul cancro.

Introduzione

La raccolta di linee cellulari tumorali su plastica in monostrati bidimensionali (2D) rimane uno dei principali cavalli di battaglia per i ricercatori oncologici. Tuttavia, il microambiente è sempre più riconosciuto per la sua capacità di impatto sui fenotipi cellulari. Nel cancro, il microambiente tumorale è noto per influenzare più comportamenti cellulari, tra cui la crescita, sopravvivenza, invasione, e la risposta alla terapia^1,2. Le colture cellulari monostratore tradizionali in genere mancano di influenze microambientali, il che ha portato allo sviluppo di analisi tridimensionali più complesse (3D) per far crescere le cellule, compresi gli estratti di membrana seminterrato purificati disponibili in commercio. Tuttavia, queste matrici purificate sono in genere complicate da usare e soffrono di problemi tecnici come la variabilità del lotto³ e le composizioni complesse³. Di conseguenza, può essere difficile assegnare la funzione a specifiche proteine che possono avere un impatto sui fenotipi cellulari³.

Per affrontare queste limitazioni, abbiamo sviluppato la tecnologia microarray microambiente (MEMA), che riduce il microambiente fino a semplici combinazioni di matrice extracellulare (ECM) e proteine solubili del fattore di crescita^4,5 . La piattaforma MEMA consente l'identificazione di fattori microambientali dominanti che influenzano il comportamento delle cellule. Utilizzando un formato di matrice, migliaia di combinazioni di fattori di microambiente possono essere tese in un unico esperimento. La MEMA qui descritta interroga 2.500 diverse condizioni di microambiente unico. Le proteine ECM stampate in lastre di pozzo formano pastiglie di crescita su cui le cellule possono essere coltivate. I ligandi solubili vengono aggiunti ai singoli pozzi, creando microambienti combinatori unici (ECM e ligando) su ogni punto diverso a cui sono esposte le cellule. Le cellule vengono coltivate per diversi giorni, quindi fisse, colorate e imagete per valutare i fenotipi cellulari come risultato dell'esposizione a queste specifiche combinazioni di microambienti. Poiché i microambienti sono semplici combinazioni, è semplice identificare le proteine che guidano i principali cambiamenti fenotipici nelle cellule. I MEMA sono stati utilizzati con successo per identificare i fattori che influenzano più fenotipi cellulari, compresi quelli che guidano le decisioni del destino cellulare e la risposta alla terapia^{4 ,5,6,7}. Queste risposte possono essere convalidate in semplici esperimenti 2D e possono quindi essere valutate in condizioni che riassumono più pienamente la complessità del microambiente tumorale. La piattaforma MEMA è altamente adattabile a una varietà di tipi di cellule ed endpoint, a condizione che siano disponibili buoni biomarcatori fenotipici.

Protocollo

NOT: Una panoramica dell'intero processo MEMA, incluso il tempo stimato, è descritta nel diagramma di flusso illustrato nella Figura 1. Questo protocollo descrive in dettaglio la fabbricazione di MEMA in lastre a 8 pozze. Il protocollo può essere adattato per altre piastre o diapositive.

1. Preparazione di buffer proteici, diluenti e coloranti

1. Fiale di ECMs Equilibrat ligando, e citochine a temperatura ambiente (RT) e centrifuga brevemente. Aggiungere il volume appropriato del buffer RT appropriato come indicato nella scheda dati del prodotto. Seguire la raccomandazione del produttore per le concentrazioni di scorte.
   NOT: Un elenco completo dei ligandi e degli EPER con le loro scorte e le loro concentrazioni finali è riportato nelle tabelle 1 e nella tabella 2. Sia i ligandi che gli EMM sono tipicamente utilizzati alla più alta concentrazione della gamma raccomandata dal produttore che suscita un effetto biologico nei saggi di coltura standard di 2 giorni. Maneggiare le proteine delicatamente e in armadietti di biosicurezza sotto il flusso laminare per evitare la contaminazione.
2. Incubare fiale con dondolo delicato a RT per 1 h. Non vortice proteine in quanto ciò può causare loro la denatura.
3. Proteine aliquote per lo stoccaggio a lungo termine in modo che tutti gli usi siano monouso solo per evitare la degradazione con cicli di congelamento/scongelamento ripetuti. Conservare le proteine lofilizzate a -80 gradi centigradi (se non diversamente specificato) fino a quando necessario. Fare attenzione a raccogliere tutti i metadati per riferimento futuro, ad esempio: (i) nome della proteina, (ii) data preparata, (iii) numero di lotto/batch, (iv) fornitore, (v) numero di catalogo, concentrazione (vi), volume (vii) e (viii) preparatore.
4. Preparare il buffer diluente contenente 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7.2 e sterilizzare il filtro. Mantenere questo buffer sterile e memorizzare in RT.
5. Preparare il buffer di colorazione contenente 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl₂e 0,02% NaN₃ in pbx (Phosphate-buffered). Filtrare e conservare a 4 gradi centigradi.

2. Preparazione di una piastra sorgente ECM

1. Rimuovere gli stock di proteine ECM da stampare e scongelare sul ghiaccio. Registrare tutti i numeri di lotto per il rilevamento dei metadati.
2. I tubi di proteine scongerate pulivano delicatamente per garantire una corretta sospensione e spin giù in una centrifuga.
3. Crea miscele di stampa ECM (EPM) e un fiduciario fluorescente da utilizzare da un robot a movimentazione liquida che creerà le lastre casuali di 384 pozze.
   NOTA: Le lastre di origine 384-well verranno utilizzate da una stampante di serie di pin touch per creare gli array stampati in 8 lastre ben.
   1. Etichettare i tubi di microcentrifuga da 1,5 ml per ogni EPM e fiduciario.
   2. Preparare ogni EPM combinando 125 l di buffer diluente (vedere il punto 1.4) con il volume appropriato del brodo ECM e portare la miscela fino a un volume totale di 250 gradi con PBS. Le concentrazioni finali in ogni tubo EPM saranno 1x proteina ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol e 100 mM Tris.
   3. Preparare un fiduciario fluorescente sciogliendolo nell'appropriato buffer specificato dal produttore e trasferire 250 l in un tubo fiduciario etichettato.

3. Creazione della piastra di origine utilizzando un gestore di liquidi

1. Progettare un layout a lamiera a 384 pozze che perlizzi le posizioni degli ECC ed è ottimizzato per la testa del pin della stampante di array utilizzata. Progettare il posizionamento del fiduciario in modo che venga stampato nella riga 1, colonna 1 posizione di ogni bene per facilitare l'orientamento della matrice.
   NOT: Per garantire dati affidabili, vengono utilizzati un totale di 14-15 repliche di ogni ECM. Includere repliche aggiuntive di collagene o di un altro ECM che produce un robusto attaccamento per la valutazione dell'uniformità della legatura. Il layout potrebbe dover utilizzare più lastre di 384 pozze a seconda del numero di ECC di interesse.
2. Trasferire i tubi EPM a un gestore liquido, mantenendo i tubi a 4 gradi centigradi con un rack di tubi raffreddati o utilizzando un robot per la movimentazione del liquido situato in una stanza fredda.
3. Utilizzando il software del gestore liquido, eseguire un programma per trasferire 15 l- di ogni EPM e il fiducialo ai pozzi predesignati all'interno delle 384-well targhe di origine.
4. Pipet PBS in qualsiasi pozzi inutilizzati per aumentare l'umidità e proteggere contro la disidratazione durante il processo di stampa.
   NOT: Vedere Figura 2 per un esempio di un set di piastra di origine 384-well che è ottimizzato per una testa di pin 4 x 7 e include un collagene I blocco e PBS.
5. Sigillare le lastre e tenere a 4 gradi centigradi fino a quando non è pronto per la stampa.

4. Stampa meMBR utilizzando un robot di stampa array

NOT: La parte seguente del protocollo descrive specificamente la preparazione e l'uso di MEMA per studiare l'impatto di diverse proteine microambientali sulla crescita e la proliferazione delle cellule MCF7. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente adattato per utilizzare diversi ligando, EMM e cellule per studiare altre linee cellulari e punti finali di interesse.

1. Utilizzando una stampante touch pin, stampare EPM e punti fiduciari in 8 lastre di pozzo. Stampare più repliche di ogni condizione ECM per garantire la riproducibilità.
   NOTA: per ottenere una formazione ottimale dei punti è possibile utilizzare altri formati di lamiera o diapositive, ma potrebbe essere necessaria l'ottimizzazione del buffer per ottenere una formazione ottimale dei punti.
   1. Stampare gli ECU per il MEMA utilizzando perni di 350 m di diametro disposti in una configurazione della testina di stampa 4 x 7. Stampare le matrici nelle lastre 8-well come 20 colonne per 35 righe, per un totale di 700 punti. Array più grandi sono possibili in queste piastre, ma sono dotati di un compromesso di maggiori effetti di bordo sia in legare cellulare e colorazione.
2. Dopo la stampa, conservare le lastre in un desiccatore per un minimo di 3 giorni prima dell'uso.

5. Creazione di piastre di trattamento ligando

1. Progetta un layout a lamiere da 96 po' che include i ligandi di interesse. Per facilitare il trattamento di molte piastre MEMA contemporaneamente, progettare questa piastra con spaziatura che consente l'uso di un tubo multicanale con 4 punte distanziate per trasferire liquidi tra i pozzi di 8-well MEMA e una piastra di 96 pozzetti.
   NOT: In questo protocollo viene utilizzato il set completo di ligandi elencati nella tabella 2.
2. Scongela i ligogi sul ghiaccio. Brevemente scorrere e girare verso il basso ogni tubo.
3. Diluire i ligandi a un magazzino di lavoro 200x utilizzando il buffer consigliato dal produttore (in genere PBS).
4. Tubo 10 l di ogni 200x ligand brodo nel pozzo corrispondente all'interno della piastra 96-pozze.
5. Sigillare e conservare le piastre a -20 gradi centigradi.
   NOT: Crea piastre di trattamento del ligando in lotti, catturando tutti i metadati per l'analisi a valle.

6. Coltivare le cellule sulle MEMA

1. Bloccare meME per 20 min con 2 mL per pozzo di buffer di blocco non incrostato contenente 1% agente di blocco non incrostazione (Tabella dei materiali) in acqua a doppia distillazione (ddH₂O).
2. Aspirati buffer di blocco e triplo risciacquo pozzi con PBS. Per evitare l'idratazione, lasciare il volume finale di PBS in pozze fino a quando non è pronto per la placcatura cellulare.
   NOT: È estremamente utile avere due bench worker per le fasi di coltura cellulare sulle MEMA. Un banco può eseguire passaggi di aspirazione, mentre il secondo esegue passaggi di addizione. Si consiglia di utilizzare un pipet multicanale da 1 mL con punte distanziate per abbinare la piastra di 8 pozzetti per la pipettatura e uno splitter Y con due pipette Pasteur per aspirare più pozzi contemporaneamente.
3. Seme 2 x 10^{5 cellule} MCF7 per pozzo in 2 mL del mezzo medio di Eagle (DMEM) modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS).
   NOT: Prima di un esperimento MEMA completo, eseguire un esperimento di titolazione cellulare per ottimizzare il numero di celle in modo che i punti MEMA abbiano numeri di cella elevati (ma non siano confluenti) alla fine della durata sperimentale desiderata.
4. Dopo 2-18 h di adesione, aspirare medio e sostituire con 2 mL di mezzo a crescita ridotta (DMEM con 0.1% FBS).
   NOT: Siero ridotto (ad esempio, 0,1% FBS) o condizioni di esaurimento del fattore di crescita in questo momento può essere utilizzato per isolare l'impatto stimolatore di specifici ligandi.
5. Scongelare una piastra di trattamento del ligando sul ghiaccio. Centrifuga scongelata piastra a 200 x g per 1 min.
6. Trasferire 200 l di mezzo da ogni pozzo nella piastra di coltura al pozzo appropriato nella piastra di trattamento. Pipet su e giù per mescolare il volume di ligando con medio e trasferire questa miscela di nuovo al pozzo appropriato nella piastra MEMA.
7. Roccia leggermente a mano e riportando le lastre MEMA all'incubatrice. Coltura per la durata dell'esperimento in presenza della combinazione ligand/ECM a 37 e 5% di CO₂.
   NOT: Un tipico esperimento MEMA dura 72 h; esperimenti di maggiore durata possono richiedere la sostituzione del mezzo e il ritrattamento con legamento.
8. Pulse MEMA pozzi a 71 h con 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridina (EdU) per una concentrazione finale di 10 M. Incubare in condizioni sperimentali con EdU per 1 h a 37 s C e 5% CO₂.
   NOT: Altri trattamenti con cellule vive possono anche essere utilizzati in questo momento.

7. Fissaggio e colorazione delle MEMA

1. Dopo 72 h e tutti i trattamenti a cellule vive, aspirate pozzi. Fissare MEMAs in 2 mL per pozzo di 2% paraformaldeide (PFA) per 15 min a RT.
2. AspiraTo PFA. Permeabilizzare con 2 mL per pozzo dello 0,1% surfactant nonionico per 15 min.
3. Aspirata il surfactant nonionico e lavare con 2 mL per pozzetto di PBS. PbS di Aspirate. Lavare con 2 mL di PBS con 0,05% di polisoromatto 20 (PBS-T).
   NOT: La superficie MEMA è idrofobica, e il mancato lavaggio con PBS-T prima dell'incubazione di macchie e anticorpi comporterà la formazione di vuoti nei pozzi durante le fasi di incubazione e darà origine a manufatti di colorazione.
4. Aspira TOPB-T. Aggiungere reagenti di reazione di rilevamento EdU. Incubare per 1 h a RT, a dondolo e protetto dalla luce. Dopo 1 h incubazione, spegnire la reazione con il buffer di slittamento commerciale fornito.
   NOT: Il rilevamento EdU e la colorazione/anticorpo possono essere eseguiti in 1,5 mL per pozzo per ridurre i costi.
5. Aspirare il tampone di tintura e lavare con PBS-T prima dell'incubazione con macchie o anticorpi.
6. Incubare pozzi MEMA con anticorpi contro l'istone H3K9me3 (1:1,000) e fibrillarin (1:400) in buffer di colorazione contenente 2% (w/v) siero albumina bovina (BSA), 1 mM MgCl₂ e 0.02% NaN₃ per la notte a 4 gradi centigradi.
   NOT: Eseguire titrations anticorpale per determinare le concentrazioni ottimali prima di utilizzarle su un set MEMA completo.
7. Dopo l'incubazione primaria di anticorpi o macchie, lavare i pozzi 2x con PBS e una volta con PBS-T.
8. Aggiungere gli anticorpi secondari (IgG anti-tono d'asino e IgG anti-coniglio d'asino, entrambi 1:300) e 0,5 g/mL 4' 6-diamidino-2-fenillindole (DAPI). Incubare per 1 h a RT al buio.
9. Lavare i pozzi 2x con 2 mL per pozzetto di PBS, lasciandoli negli ultimi 2 mL PBS.
10. Procedere con l'imaging o conservare i MEMA macchiati per l'imaging successivo in PBS a 4 gradi centigradi protetti dalla luce.

8. Imaging di MEMA

1. Immagine MEMA su un sistema di imaging automatizzato con canali di rilevamento fluorescente appropriati.
2. Output dei dati immagine risultanti in un sistema di gestione delle immagini. Segmentare le celle e calcolare i livelli di intensità utilizzando CellProfiler⁸.

9. Analisi dei dati

NOT: L'analisi dei dati consiste nella normalizzazione, nella correzione delle variazioni e nel riepilogo dei dati derivati di CellProfiler non elaborati. In questo caso, l'ambiente R con codice personalizzato viene utilizzato per eseguire tutti i passaggi. Tuttavia, qualsiasi ambiente statistico o programma software può essere utilizzato per eseguire le azioni equivalenti. Un esempio del codice personalizzato open source per l'ambiente R per l'analisi è disponibile all'indirizzo: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

1. Pre-elaborare e normalizzare i dati immagine segmentati.
2. Determinare il numero di cellule spot utilizzando i nuclei macchiati DAPI.
3. Intensità EdU auto-gate per etichettare le celle come EdU^. Misurare la proliferazione utilizzando la proporzione di cellule EdU in ogni punto.
4. Mediani riassumono le macchie citoplasmatiche e le misurazioni della morfologia nucleare a livello spot.
5. Eseguire la rimozione della normalizzazione delle variazioni indesiderate (RUV) sui dati per migliorare la qualità dei dati⁹.
   NOT: Questo approccio viene applicato a ogni segnale di intensità e morfologia in modo indipendente come matrice con matrici che utilizzano le righe e le macchie come le colonne come descritto in precedenza⁹.
6. Applicare la normalizzazione di bivariate loess ai residui normalizzati RUV utilizzando la riga della matrice e la colonna della matrice come variabili indipendenti per correggere gli effetti spaziali o correlati all'intensità.
7. Una volta completata la normalizzazione, la mediana riepiloga le repliche per ogni condizione di microambiente per la creazione di report e un'ulteriore analisi.

Risultati

Per semplificare gli impatti microambientali sulla crescita e la proliferazione delle cellule e per identificare le condizioni che hanno promosso o inibito la crescita e la proliferazione cellulare, la linea cellulare del cancro al seno MCF7 è stata seminata su una serie di otto MEMA con 8 carri come descritto nel protocollo. Questo test ha esposto le cellule a 48 diversi EPER e 57 diversi ligandi, per un totale di 2736 condizioni microambientali combinatori. Dopo 71 h in coltura, le cellule sono state pulsate con EdU, ...

Discussione

L'importanza della "dimensionalità" e del contesto è stata un fattore motivante nello sviluppo di sistemi di coltura in vitro come strumenti nella caratterizzazione delle cellule tumorali attraverso la loro interazione con il microambiente^11,e la capacità di in vitro sistemi di coltura per imitare l'ambiente in vivo è una forza trainante dietro la ricerca di migliorare quei sistemi di coltura. I sistemi in vitro, tuttavia, rimangono strumenti significativi di ricerca sul cancro proprio a causa...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aushon 2470	Aushon BioSystems		Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA	Nikon		High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler	BioTek		liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution	Sigma	T2069
EDTA	Invitrogen	15575-038
Glycerol	Sigma	G5516
Triton X100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P7949
Kolliphor P338	BASF	50424591
384-well microarray plate, cylindrical well	Thermo Fisher	ab1055
Nunc 8 well dish	Thermo Fisher	267062
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Science	15710
BSA	Fisher	BP-1600
Sodium Azide	Sigma	S2002
Cell Mask	Molecular Probes	H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor	Molecular Probes	C10357
DAPI	Promo Kine	PK-CA70740043
ALCAM	R & D Systems	656-AL	ECM
Cadherin-20 (CDH20)	R & D Systems	5604-CA	ECM
Cadherin-6 (CDH6)	R & D Systems	2715-CA	ECM
Cadherin-8 (CDH8)	R & D Systems	188-C8	ECM
CD44	R & D Systems	3660-CD	ECM
CEACAM6	R & D Systems	3934-CM	ECM
Collagen I	Cultrex	3442-050-01	ECM
Collagen Type II	Millipore	CC052	ECM
Collagen Type III	Millipore	CC054	ECM
Collagen Type IV	Sigma	C5533	ECM
Collagen Type V	Millipore	CC077	ECM
COL23A1	R & D Systems	4165-CL	ECM
Desmoglein 2	R & D Systems	947-DM	ECM
E-cadherin (CDH1)	R & D Systems	648-EC	ECM
ECM1	R & D Systems	3937-EC	ECM
Fibronectin	R & D Systems	1918-FN	ECM
GAP43	Abcam	ab114188	ECM
HyA-500K	R & D Systems	GLR002	ECM
HyA-50K	R & D Systems	GLR001	ECM
ICAM-1	R & D Systems	720-IC	ECM
Laminin	Sigma	L6274	ECM
Laminin-5	Abcam	ab42326	ECM
Lumican	R & D Systems	2846-LU	ECM
M-Cad (CDH15)	R & D Systems	4096-MC	ECM
Nidogen-1	R & D Systems	2570-ND	ECM
Osteoadherin/OSAD	R & D Systems	2884-AD	ECM
Osteopontin (SPP)	R & D Systems	1433-OP	ECM
P-Cadherin (CDH3)	R & D Systems	861-PC	ECM
PECAM1	R & D Systems	ADP6	ECM
Tenascin C	R & D Systems	3358-TC	ECM
VCAM1	R & D Systems	ADP5	ECM
Vitronectin	R & D Systems	2308-VN	ECM
Biglycan	R & D Systems	2667-CM	ECM
Decorin	R & D Systems	143-DE	ECM
Periostin	R & D Systems	3548-F2	ECM
SPARC/osteonectin	R & D Systems	941-SP	ECM
Thrombospondin-1/2	R & D Systems	3074-TH	ECM
Brevican	R & D Systems	4009-BC	ECM
Elastin	BioMatrix	5052	ECM
Fibrillin	Lynn Sakai Lab OHSU	N/A	ECM
ANGPT2	RnD_Systems_Own	623-AN-025	Ligand
IL1B	RnD_Systems_Own	201-LB-005	Ligand
CXCL8	RnD_Systems_Own	208-IL-010	Ligand
IGF1	RnD_Systems_Own	291-G1-200	Ligand
TNFRSF11B	RnD_Systems_Own	185-OS	Ligand
BMP6	RnD_Systems_Own	507-BP-020	Ligand
FLT3LG	RnD_Systems_Own	308-FK-005	Ligand
CXCL1	RnD_Systems_Own	275-GR-010	Ligand
DLL4	RnD_Systems_Own	1506-D4-050	Ligand
HGF	RnD_Systems_Own	294-HGN-005	Ligand
Wnt5a	RnD_Systems_Own	645-WN-010	Ligand
CTGF	Life_Technologies_Own	PHG0286	Ligand
LEP	RnD_Systems_Own	398-LP-01M	Ligand
FGF2	Sigma_Aldrich_Own	SRP4037-50UG	Ligand
FGF6	RnD_Systems_Own	238-F6	Ligand
IL7	RnD_Systems_Own	207-IL-005	Ligand
TGFB1	RnD_Systems_Own	246-LP-025	Ligand
PDGFB	RnD_Systems_Own	220-BB-010	Ligand
WNT10A	Genemed_Own	90009	Ligand
PTN	RnD_Systems_Own	252-PL-050	Ligand
BMP3	RnD_Systems_Own	113-BP-100	Ligand
BMP4	RnD_Systems_Own	314-BP-010	Ligand
TNFSF11	RnD_Systems_Own	390-TN-010	Ligand
CSF2	RnD_Systems_Own	215-GM-010	Ligand
BMP5	RnD_Systems_Own	615-BMC-020	Ligand
DLL1	RnD_Systems_Own	1818-DL-050	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	296-HR-050	Ligand
KNG1	RnD_Systems_Own	1569-PI-010	Ligand
GPNMB	RnD_Systems_Own	2550-AC-050	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	350-NS-010	Ligand
IL15	RnD_Systems_Own	247-ILB-005	Ligand
TNF	RnD_Systems_Own	210-TA-020	Ligand
IGFBP3	RnD_Systems_Own	675-B3-025	Ligand
WNT3A	RnD_Systems_Own	5036-WNP-010	Ligand
PDGFAB	RnD_Systems_Own	222-AB	Ligand
AREG	RnD_Systems_Own	262-AR-100	Ligand
JAG1	RnD_Systems_Own	1277-JG-050	Ligand
BMP7	RnD_Systems_Own	354-BP-010	Ligand
TGFB2	RnD_Systems_Own	302-B2-010	Ligand
VEGFA	RnD_Systems_Own	293-VE-010	Ligand
IL6	RnD_Systems_Own	206-IL-010	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	351-FS-010	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	378-SM	Ligand
IGFBP2	RnD_Systems_Own	674-B2-025	Ligand
SHH	RnD_Systems_Own	1314-SH-025	Ligand
FASLG	RnD_Systems_Own	126-FL-010	Ligand