Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

Resumo

O objetivo do método apresentado aqui é mostrar como Microarrays microambiente (MEMA) pode ser fabricado e usado para interrogar o impacto de milhares de microambientes combinatórios simples sobre o fenótipo de células cultivadas.

Resumo

Compreender o impacto do microambiente no fenótipo das células é um problema difícil devido à complexa mistura de fatores de crescimento solúvel e proteínas associadas à matriz no microambiente in vivo. Além disso, os reagentes prontamente disponíveis para a modelagem de microambientes in vitro utilizam tipicamente misturas complexas das proteínas que são definidas incompletamente e sofrem da variabilidade do grupo à lote. A plataforma do microarray do microambiente (Mema) permite a avaliação de milhares de combinações simples de proteínas do microambiente para seu impacto em fenótipos celulares em um único ensaio. Os MEMAs são preparados em placas de poço, o que permite a adição de ligantes individuais para separar os poços contendo proteínas de matriz extracelular (ECM) dispostas. A combinação do ligante solúvel com cada ECM impresso dá forma a uma combinação original. Um ensaio típico MEMA contém mais de 2.500 microambientes combinatórios únicos que as células são expostas em um único ensaio. Como um caso de teste, a linha celular MCF7 do cancro da mama foi chapeada na plataforma de MEMA. A análise deste ensaio identificou fatores que aumentam e inibem o crescimento e a proliferação dessas células. A plataforma MEMA é altamente flexível e pode ser estendida para uso com outras questões biológicas além da pesquisa de câncer.

Introdução

A cultura de linhagens de células cancerosas em plástico em monocamadas bidimensional (2D) continua sendo um dos principais cavalos de trabalho para pesquisadores de câncer. No entanto, o microambiente está sendo cada vez mais reconhecido por sua capacidade de impactar os fenótipos celulares. No câncer, o microambiente tumoral é conhecido por influenciar múltiplos comportamentos celulares, incluindo crescimento, sobrevida, invasão e resposta à terapia^1,2. As culturas tradicionais da pilha do monocamada faltam tipicamente influências do microambiente, que conduziu ao desenvolvimento de uns ensaios tridimensionais (3D) mais complexos para crescer pilhas, incluindo extratos purificados comercialmente disponíveis da membrana do porão. No entanto, essas matrizes purificadas são tipicamente complicadas de usar e sofrem de problemas técnicos, como a variabilidade do lote³ e composições complexas³. Como resultado, pode ser difícil atribuir a função a proteínas específicas que podem estar afetando os fenótipos celulares³.

Para abordar essas limitações, desenvolvemos a tecnologia microarray (Mema), que reduz o microambiente até combinações simples de matriz extracelular (ECM) e proteínas de fator de crescimento solúvel^4,5 . A plataforma MEMA possibilita a identificação de fatores microambientais dominantes que impactam o comportamento das células. Usando um formato de matriz, milhares de combinações de fatores de microambiente podem ser testadas em um único experimento. O MEMA descrito aqui interroates ~ 2.500 diferentes condições únicas de microambiente. As proteínas ECM impressas em placas de poço formam almofadas de crescimento sobre as quais as células podem ser cultivadas. Os ligantes solúveis são adicionados aos poços individuais, criando os microambientes combinatória originais (ECM + ligand) em cada ponto diferente a que as pilhas são expostas. As células são cultivadas por vários dias, em seguida, fixo, manchado, e imaged para avaliar fenótipos celulares como resultado da exposição a estas combinações específicas de microambiente. Desde que os microambientes são combinações simples, é direto identificar as proteínas que conduzem mudanças fenotípicas principais nas pilhas. As memas têm sido utilizadas com sucesso para identificar fatores que influenciam vários fenótipos celulares, incluindo aqueles que impulsionam as decisões de destino da célula e a resposta à terapia^4,5,6,7. Essas respostas podem ser validadas em experimentos 2D simples e, em seguida, podem ser avaliadas em condições que recapitulam mais plenamente a complexidade do microambiente tumoral. A plataforma MEMA é altamente adaptável a uma variedade de tipos de células e endpoints, desde que estejam disponíveis bons biomarcadores fenotípicos.

Protocolo

Nota: Uma visão geral de todo o processo MEMA, incluindo o tempo estimado, é descrita no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. Este protocolo detalha a fabricação de MEMAs em placas de 8 poços. O protocolo pode ser adaptado para outras placas ou lâminas.

1. preparação de buffers de proteína, diluente e coloração

1. Equilibrar frascos de ECMs, ligantes e citocinas à temperatura ambiente (RT) e centrifugar brevemente. Adicione o volume apropriado do buffer RT apropriado, conforme indicado na folha de dados do produto. Siga a recomendação do fabricante para concentrações de ações.
   Nota: Uma lista completa dos ligantes e ECMs com suas ações e concentrações finais são fornecidas na tabela 1 e na tabela 2. Os ligantes e os ECMs são usados tipicamente na concentração a mais elevada da escala recomendada pelo fabricante que provoca um efeito biológico em ensaios padrão da cultura de 2 dias. Manuseie as proteínas suavemente e em armários de biossegurança fluxo laminar para evitar a contaminação.
2. Incubar frascos com balanço suave em RT para 1 h. Não vórtice proteínas como isso pode causar-lhes a desnaturar.
3. Proteínas alíquotas para armazenamento de longo prazo para que todas as alíquotas sejam de uso único apenas para evitar a degradação com ciclos repetidos de congelamento/descongelação. Armazene as proteínas liofilizadas a-80 ° c (salvo indicação em contrário) até que seja necessário. Tome cuidado para coletar todos os metadados para referência futura, tais como: (i) nome da proteína, (II) data preparada, (III) número lote/lote, (IV) fornecedor, (v) número do catálogo, (vi) concentração, (VII) volume, e (VIII) preparador.
4. Prepare o tampão diluente contendo 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 e esterilizar filtro. Mantenha este tampão estéril e armazene em RT.
5. Prepare o tampão de coloração contendo 2% (p/v) BSA, 1 mM MgCl₂e 0, 2% Nan₃ em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Filtrar e armazenar a 4 ° c.

2. preparação de uma placa de origem ECM

1. Remova estoques aliquotados de proteínas ECM a serem impressos e descongelar no gelo. Registre todos os números de lote para rastreamento de metadados.
2. Flick tubos de proteínas descongelados suavemente para garantir a ressuspensão adequada e girar para baixo em uma centrífuga.
3. Faça misturas de impressão ECM (EPMs) e uma fonte fluorescente para ser usada por um robô de manuseio de líquidos que criará as placas de origem 384-well aleatórias.
   Nota: as placas de fonte 384-well serão usadas por uma impressora da disposição do pino do toque para criar as matrizes impressas em 8 placas do poço.
   1. Rotule tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada EPM e o
   2. Prepare cada EPM combinando 125 μL de tampão diluente (ver passo 1,4) com o volume adequado de estoque de ECM e leve a mistura até um volume total de 250 μL com PBS. As concentrações finais em cada tubo EPM serão 1x proteína ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol, e 100 mM Tris.
   3. Prepare uma solução fluorescente, dissolvendo-a no tampão apropriado especificado pelo fabricante e transfira 250 μL para um tubo de transmissão rotulado.

3. criação da placa de origem usando um manipulador de líquidos

1. Projete um layout de placa 384-well que randomize as posições dos ECMs e seja otimizado para a cabeça do pino da impressora matriz que está sendo usada. Projete a colocação do material de forma que ele será impresso na linha 1, coluna 1 posição de cada poço para auxiliar na orientação da matriz.
   Nota: Um total de 14 − 15 repetições de cada ECM é usado para assegurar dados robustos. Inclua réplicas adicionais de colágeno ou outro ECM que produz um acessório robusto para avaliação da uniformidade de ligação. O layout pode precisar utilizar várias placas 384-well, dependendo do número de ECMs de interesse.
2. Transfira tubos EPM para um manipulador líquido, mantendo os tubos a 4 ° c com um rack de tubo resfriado ou usando um robô de manuseio de líquidos localizado em uma sala fria.
3. Usando o software do manipulador de líquidos, execute um programa para transferir 15 μL de cada EPM e a base para os poços pré-designados dentro da placa de origem 384-well (s).
4. Pipet PBS em qualquer poços não utilizados para aumentar a umidade e proteção contra a dessecação durante o processo de impressão.
   Nota: Consulte a Figura 2 para obter um exemplo de um conjunto de placas de origem 384 bem otimizado para uma cabeça de pino de 4 x 7 e inclui um bloco de colágeno I e PBS.
5. Placa (s) de vedação e mantenha a 4 ° c até estar pronto para imprimir.

4. imprimindo MEMAs usando um robô de impressão de matriz

Nota: A parte seguinte do protocolo descreve especificamente a preparação e o uso de MEMA para investigar o impacto de diferentes proteínas do microambiente no crescimento e proliferação de células MCF7. No entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para usar diferentes ligantes, ECMs e células para estudar outras linhas celulares e pontos de extremidade de interesse.

1. Usando uma impressora de pinos de toque, imprima EPMs e pontos de identificação em 8 placas de poços. Imprima várias repetições de cada condição de ECM para garantir a reprodutibilidade.
   Nota: outros formatos de chapa ou lâminas podem ser usados para impressão, mas a otimização de buffer pode ser necessária para alcançar a formação ideal do ponto.
   1. Imprima os ECMs para o MEMA usando pinos do diâmetro de 350 μm arranjados em uma configuração da cabeça de cópia 4 x 7. Imprima as matrizes nas placas de 8 poços como 20 colunas por 35 linhas, para um total de ~ 700 pontos. As matrizes maiores são possíveis nestas placas mas vêm com um trade-off de efeitos aumentados da borda na ligação e na mancha da pilha.
2. Após a impressão, guarde as chapas num dessecador durante um período mínimo de 3 dias antes da utilização.

5. criação de placas de tratamento de ligantes

1. Projete uma disposição da placa do 96-well que inclui ligantes do interesse. Para facilitar o tratamento de muitas placas MEMA ao mesmo tempo, projetar esta placa com espaçamento que permite o uso de um Pipet multi-canal com 4 pontas espaçadas para transferir líquidos entre os poços de 8-bem MEMAs e uma placa 96-well.
   Nota: Neste protocolo, são utilizados o conjunto completo de ligandos listados na tabela 2 .
2. Thaw ligantes no gelo. Momentaneamente Flick e gire para baixo cada tubo.
3. Diluir os ligantes para um estoque de trabalho de 200x usando o buffer recomendado pelo fabricante (tipicamente PBS).
4. Pipet 10 μL de cada estoque do ligante 200x no poço correspondente dentro da placa 96-well.
5. Selar e armazenar chapas a-20 ° c.
   Nota: Faça placas de tratamento de ligantes em lotes, capturando todos os metadados para análise a jusante.

6. cultivando células em MEMAs

1. Bloco MEMAs por 20 min com 2 mL por poço de tampão de bloqueio não incrustante contendo 1% de agente de bloqueio não incrustante (tabela de materiais) em água destilada dupla (DDH₂O).
2. Aspirar o tampão de obstrução e os poços triplos da enxaguadura com PBS. Para evitar a dessecação, deixe o volume final de PBS em poços até estar pronto para a plaqueamento celular.
   Nota: É extremamente útil ter dois trabalhadores do banco para etapas da cultura da pilha em MEMAs. Um trabalhador do banco pode executar etapas da aspiração, quando o segundo executar etapas da adição. Recomenda-se usar um Pipet multicanal de 1 mL com pontas espaçadas para coincidir com a placa de 8 poços para pipetagem e um divisor de Y com duas pipetas Pasteur para aspirar vários poços de uma só vez.
3. Sementes 2 x 10⁵ MCF7 células por poço em 2 ml de Dulbecco ' s modificado médio de Eagle ' s médio (DMEM) contendo 10% soro fetal bovino (FBS).
   Nota: Antes de um experimento MEMA completo, realize uma experiência de titulação de célula para otimizar números de células, de forma que os pontos MEMA tenham números de células altas (mas não são confluentes) no final da duração experimental desejada.
4. Após 2 − 18 h de adesão, aspirado a meio e substituir com 2 mL de meio de crescimento reduzido (DMEM com 0,1% FBS).
   Nota: Soro reduzido (por exemplo, 0,1% FBS) ou condições de fator de crescimento empobrecido podem ser usados neste momento para isolar o impacto estimulatório de ligantes específicos.
5. Descongelar uma placa de tratamento de ligantes no gelo. Placa de centrifugação descongelada a 200 x g durante 1 min.
6. Transferir 200 μL de meio de cada poço na placa de cultura para o poço adequado na placa de tratamento. Pipet para cima e para baixo para misturar o volume do ligante com o meio e para transferir esta mistura de volta ao poço apropriado na placa de Mema.
7. Levemente rocha à mão e devolva as placas MEMA à incubadora. Cultura para a duração do experimento na presença da combinação ligand/ECM a 37 ° c e 5% CO₂.
   Nota: Um experimento MEMA típico é executado por 72 h; os experimentos de longa duração podem requerer a reposição de meio e retratamento com ligantes.
8. Os poços MEMA do pulso em 71 h com 100x 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) para uma concentração final de 10 μM. Incubar em condições experimentais com EdU para 1 h em 37 ° c e 5% CO₂.
   Nota: Outros tratamentos de células ao vivo também podem ser usados neste momento.

7. fixação e coloração MEMAs

1. Após 72 h e quaisquer tratamentos de células ao vivo, aspiram poços. Fix MEMAs em 2 mL por poço de 2% paraformaldeído (PFA) por 15 min em RT.
2. Aspirar a PFA. Permeabilize com 2 mL por o poço do surfactante nonionic de 0,1% por 15 minutos.
3. Aspirar o surfactante não iônico e lavar com 2 mL por poço de PBS. Aspirar PBS. Lave com 2 mL de PBS com 0, 5% de polissorbato 20 (PBS-T).
   Nota: A superfície de MEMA é hidrofóbica, e a falha lavar com PBS-T antes que a incubação da mancha e do anticorpo conduzirá à formação de vazios nos poços durante etapas da incubação e dê origem aos artefatos de coloração.
4. Aspirar PBS-T. Adicionar reagentes de reação de detecção EdU. Incubar por 1 h em RT, balançando e protegido da luz. Após 1 h incubação, saciar a reação com o tampão de têmmata comercial fornecido.
   Nota: A deteção de EdU e as etapas da mancha/anticorpo podem ser executadas em 1,5 mL por o poço para reduzir o custo.
5. Aspirar o tampão de têmmata e lavar com PBS-T antes de incubação com manchas ou anticorpos.
6. Incubar os poços de MEMA com anticorpos contra a histona H3K9me3 (1:1000) e fibrillarina (1:400) em tampão de coloração contendo 2% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA), 1 mM MgCl₂ e 0, 2% Nan₃ durante a noite a 4 ° c.
   Nota: Realize titulações de anticorpos para determinar as concentrações ideais antes de usá-las em um conjunto MEMA completo.
7. Após a incubação preliminar do anticorpo ou da mancha, lave os poços 2x com PBS e uma vez com PBS-T.
8. Adicionar anticorpos secundários (asno anti-rato IgG e asno anti-coelho IgG, ambos 1:300) e 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Incubar por 1 h na RT no escuro.
9. Lave os poços 2x com 2 mL por poço de PBS, deixando-os no final 2 mL PBS.
10. Proceda à imagem ou armazene MEMAs manchadas para a imagem latente mais atrasada no PBS em 4 ° c protegido da luz.

8. imagem latente de MEMAs

1. Imagem MEMA em um sistema automatizado da imagem latente com os canais de deteção fluorescentes apropriados.
2. Saída de dados de imagem resultante para um sistema de gerenciamento de imagem. Segmentar células e calcular níveis de intensidade usando o CellProfiler⁸.

9. análise de dados

Nota: A análise de dados consiste em normalização, correção de variação e compactação dos dados brutos do CellProfiler. Nesta instância, o R-Environment com código personalizado é usado para executar todas as etapas. No entanto, qualquer ambiente estatístico ou programa de software pode ser utilizado para executar as ações equivalentes. Um exemplo do código personalizado de fonte aberta para o ambiente de R para análise está disponível em: https://www.Synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

1. Pré-processar e normalizar os dados de imagem segmentada.
2. Determine a contagem de células Spot usando os núcleos corados DAPI.
3. Intensidade de EdU de porta automática para rotular células como EdU⁺. Medir a proliferação usando a proporção de células EdU⁺ em cada local.
4. A mediana resume as manchas citoplasmáticas e as medições da morfologia nuclear no nível Spot.
5. Realize a remoção da normalização indesejada de variação (RUV) nos dados para melhorar a qualidade dos dados⁹.
   Nota: Essa abordagem é aplicada a cada sinal de intensidade e morfologia independentemente como uma matriz com matrizes usando as linhas e pontos como as colunas como descrito anteriormente⁹.
6. Aplique a normalização de loess bivariada aos resíduos normalizados RUV usando a linha de matriz e a coluna de matriz como as variáveis independentes para corrigir efeitos espaciais ou de intensidade relacionados.
7. Uma vez que a normalização é terminada, a mediana resume as repetições para cada condição do microambiente para relatar e uma análise mais aprofundada.

Resultados

Para simplificar os impactos microambientais no crescimento e proliferação celular e identificar condições que promoveram ou inibiram o crescimento e proliferação celular, a linha celular de câncer de mama MCF7 foi semeada em um conjunto de oito MEMAs de 8 poços, conforme descrito no protocolo. Este ensaio expôs as células a 48 diferentes ECMs e 57 ligantes diferentes, para um total de 2736 condições microambientais combinatórias. Após 71 h na cultura, as pilhas foram pulsada com EdU, fixo, permeablized, e ...

Discussão

A importância da "dimensionalidade" e do contexto tem sido um fator motivador no desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro como ferramentas na caracterização de células cancerosas através de sua interação com o microambiente¹¹, e a capacidade de in vitro sistemas de cultura para imitar o ambiente in vivo é uma força motriz por trás da busca para melhorar esses sistemas de cultura. No entanto, os sistemas in vitro continuam a ser instrumentos significativos de investigação do canc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aushon 2470	Aushon BioSystems		Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA	Nikon		High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler	BioTek		liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution	Sigma	T2069
EDTA	Invitrogen	15575-038
Glycerol	Sigma	G5516
Triton X100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P7949
Kolliphor P338	BASF	50424591
384-well microarray plate, cylindrical well	Thermo Fisher	ab1055
Nunc 8 well dish	Thermo Fisher	267062
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Science	15710
BSA	Fisher	BP-1600
Sodium Azide	Sigma	S2002
Cell Mask	Molecular Probes	H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor	Molecular Probes	C10357
DAPI	Promo Kine	PK-CA70740043
ALCAM	R & D Systems	656-AL	ECM
Cadherin-20 (CDH20)	R & D Systems	5604-CA	ECM
Cadherin-6 (CDH6)	R & D Systems	2715-CA	ECM
Cadherin-8 (CDH8)	R & D Systems	188-C8	ECM
CD44	R & D Systems	3660-CD	ECM
CEACAM6	R & D Systems	3934-CM	ECM
Collagen I	Cultrex	3442-050-01	ECM
Collagen Type II	Millipore	CC052	ECM
Collagen Type III	Millipore	CC054	ECM
Collagen Type IV	Sigma	C5533	ECM
Collagen Type V	Millipore	CC077	ECM
COL23A1	R & D Systems	4165-CL	ECM
Desmoglein 2	R & D Systems	947-DM	ECM
E-cadherin (CDH1)	R & D Systems	648-EC	ECM
ECM1	R & D Systems	3937-EC	ECM
Fibronectin	R & D Systems	1918-FN	ECM
GAP43	Abcam	ab114188	ECM
HyA-500K	R & D Systems	GLR002	ECM
HyA-50K	R & D Systems	GLR001	ECM
ICAM-1	R & D Systems	720-IC	ECM
Laminin	Sigma	L6274	ECM
Laminin-5	Abcam	ab42326	ECM
Lumican	R & D Systems	2846-LU	ECM
M-Cad (CDH15)	R & D Systems	4096-MC	ECM
Nidogen-1	R & D Systems	2570-ND	ECM
Osteoadherin/OSAD	R & D Systems	2884-AD	ECM
Osteopontin (SPP)	R & D Systems	1433-OP	ECM
P-Cadherin (CDH3)	R & D Systems	861-PC	ECM
PECAM1	R & D Systems	ADP6	ECM
Tenascin C	R & D Systems	3358-TC	ECM
VCAM1	R & D Systems	ADP5	ECM
Vitronectin	R & D Systems	2308-VN	ECM
Biglycan	R & D Systems	2667-CM	ECM
Decorin	R & D Systems	143-DE	ECM
Periostin	R & D Systems	3548-F2	ECM
SPARC/osteonectin	R & D Systems	941-SP	ECM
Thrombospondin-1/2	R & D Systems	3074-TH	ECM
Brevican	R & D Systems	4009-BC	ECM
Elastin	BioMatrix	5052	ECM
Fibrillin	Lynn Sakai Lab OHSU	N/A	ECM
ANGPT2	RnD_Systems_Own	623-AN-025	Ligand
IL1B	RnD_Systems_Own	201-LB-005	Ligand
CXCL8	RnD_Systems_Own	208-IL-010	Ligand
IGF1	RnD_Systems_Own	291-G1-200	Ligand
TNFRSF11B	RnD_Systems_Own	185-OS	Ligand
BMP6	RnD_Systems_Own	507-BP-020	Ligand
FLT3LG	RnD_Systems_Own	308-FK-005	Ligand
CXCL1	RnD_Systems_Own	275-GR-010	Ligand
DLL4	RnD_Systems_Own	1506-D4-050	Ligand
HGF	RnD_Systems_Own	294-HGN-005	Ligand
Wnt5a	RnD_Systems_Own	645-WN-010	Ligand
CTGF	Life_Technologies_Own	PHG0286	Ligand
LEP	RnD_Systems_Own	398-LP-01M	Ligand
FGF2	Sigma_Aldrich_Own	SRP4037-50UG	Ligand
FGF6	RnD_Systems_Own	238-F6	Ligand
IL7	RnD_Systems_Own	207-IL-005	Ligand
TGFB1	RnD_Systems_Own	246-LP-025	Ligand
PDGFB	RnD_Systems_Own	220-BB-010	Ligand
WNT10A	Genemed_Own	90009	Ligand
PTN	RnD_Systems_Own	252-PL-050	Ligand
BMP3	RnD_Systems_Own	113-BP-100	Ligand
BMP4	RnD_Systems_Own	314-BP-010	Ligand
TNFSF11	RnD_Systems_Own	390-TN-010	Ligand
CSF2	RnD_Systems_Own	215-GM-010	Ligand
BMP5	RnD_Systems_Own	615-BMC-020	Ligand
DLL1	RnD_Systems_Own	1818-DL-050	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	296-HR-050	Ligand
KNG1	RnD_Systems_Own	1569-PI-010	Ligand
GPNMB	RnD_Systems_Own	2550-AC-050	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	350-NS-010	Ligand
IL15	RnD_Systems_Own	247-ILB-005	Ligand
TNF	RnD_Systems_Own	210-TA-020	Ligand
IGFBP3	RnD_Systems_Own	675-B3-025	Ligand
WNT3A	RnD_Systems_Own	5036-WNP-010	Ligand
PDGFAB	RnD_Systems_Own	222-AB	Ligand
AREG	RnD_Systems_Own	262-AR-100	Ligand
JAG1	RnD_Systems_Own	1277-JG-050	Ligand
BMP7	RnD_Systems_Own	354-BP-010	Ligand
TGFB2	RnD_Systems_Own	302-B2-010	Ligand
VEGFA	RnD_Systems_Own	293-VE-010	Ligand
IL6	RnD_Systems_Own	206-IL-010	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	351-FS-010	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	378-SM	Ligand
IGFBP2	RnD_Systems_Own	674-B2-025	Ligand
SHH	RnD_Systems_Own	1314-SH-025	Ligand
FASLG	RnD_Systems_Own	126-FL-010	Ligand