마이크로어레이를 사용하여 암 세포 표현형에 대한 미세 환경적 영향을 심문

요약

여기에 제시된 방법의 목적은 미세 환경 마이크로어레이(MEMA)가 배양된 세포의 표현형에 대한 수천 개의 간단한 조합 미세 환경의 영향을 심문하기 위해 제조되고 사용될 수 있는 방법을 보여주는 것입니다.

초록

미세 환경이 세포의 표현형에 미치는 영향을 이해하는 것은 생체 내 미세 환경에서 수용성 성장 인자와 매트릭스 관련 단백질의 복잡한 혼합물로 인해 어려운 문제입니다. 또한, 시험관 내 미세 환경의 모델링을 위해 쉽게 사용할 수 있는 시약은 일반적으로 불완전하게 정의되고 배치 가변성으로 고통받는 단백질의 복잡한 혼합물을 이용합니다. 미세 환경 마이크로어레이(MEMA) 플랫폼은 단일 분석에서 세포 표현형에 미치는 영향에 대해 수천 가지의 미세 환경 단백질 조합을 평가할 수 있습니다. MEMA는 배열된 세포외 매트릭스(ECM) 단백질을 포함하는 우물을 분리하기 위해 개별 리간드를 첨가할 수 있는 웰 플레이트에 제조됩니다. 각 인쇄 된 ECM과 수용성 리간드의 조합은 독특한 조합을 형성한다. 전형적인 MEMA 분석은 세포가 단 하나 분석에서 드러내는 2,500의 유일한 조합 마이크로환경을 포함합니다. 시험 사례로서, 유방암 세포주 MCF7은 MEMA 플랫폼에서 도금되었다. 이 분석법의 분석은 이 세포의 성장 그리고 증식을 강화하고 억제하는 둘 다 인자를 확인했습니다. MEMA 플랫폼은 매우 유연하며 암 연구 를 넘어 다른 생물학적 질문과 함께 사용하기 위해 확장 될 수 있습니다.

서문

2차원(2D) 단층에서 플라스틱에 암 세포주를 배양하는 것은 암 연구자들의 주요 주력 중 하나입니다. 그러나, 미세 환경은 점점 세포 표현형에 영향을 미치는 그것의 기능에 대 한 인식 되 고. 암에서, 종양 미세환경은 성장, 생존, 침습 및^{치료요법에}대한 반응 1,^2를포함하는 다중 세포 행동에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 전통적인 단층 세포 배양은 전형적으로 미세 환경 영향이 결여되어, 이는 시판되는 정제된 지하 막 추출물을 포함하여 세포를 성장시키기 위해 보다 복잡한 3차원(3D) 어설법의 발달을 주도하고 있다. 그러나, 이러한 정제된 행렬은 전형적으로 사용하기가 복잡하고 배치 가변성³ 및 복잡한 조성물^3과같은 기술적 문제로 고통받고 있다. 그 결과, 세포 표현형 3에 영향을 미칠 수 있는 특정 단백질에기능을 할당하는 것은 어려울 수 있습니다.

이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 세포 외 매트릭스 (ECM) 및 수용성 성장 인자 단백질^{4,5의 간단한 조합으로 미세 환경을 감소시키는 미세 환경 마이크로 어레이 (MEMA) 기술을 개발했습니다.} . MEMA 플랫폼은 세포의 거동에 영향을 미치는 지배적인 미세 환경 요인을 식별할 수 있게 합니다. 배열 형식을 사용하면 단일 실험에서 수천 개의 미세 환경 요인 조합을 분석할 수 있습니다. 여기에 기술된 MEMA는 ~ 2,500개의 상이한 독특한 미세 환경 조건을 심문합니다. 잘 판에 인쇄된 ECM 단백질은 세포가 배양될 수 있는 성장 패드를 형성합니다. 수용성 리간드가 개별 우물에 첨가되어 세포가 노출되는 각 다른 지점에 고유한 조합 미세 환경(ECM + 리간드)을 생성합니다. 세포는 이러한 특정 미세 환경 조합에 노출의 결과로 세포 표현형을 평가하기 위해 며칠 동안 배양된 다음 고정, 염색 및 이미지화됩니다. 미세 환경은 간단한 조합이기 때문에 세포의 주요 현상형 변화를 유도하는 단백질을 식별하는 것은 간단합니다. MEMA는 세포 운명 결정 및 치료 4,^5,6,7에대한 반응을 유도하는 요인을 포함하여 다중 세포 표현형에 영향을 미치는 요인을 확인하기 위해 성공적으로 사용되었습니다. 이러한 반응은 간단한 2D 실험에서 검증될 수 있고 종양 미세 환경의 복잡성을 보다 완전하게 재입증하는 조건하에서 평가될 수 있다. MEMA 플랫폼은 좋은 표현형 바이오마커를 사용할 수 있는 경우 다양한 세포 유형 및 종점에 매우 적응할 수 있습니다.

프로토콜

참고: 예상 시간을 포함하여 전체 MEMA 프로세스의 개요는 그림1에 표시된 흐름 다이어그램에 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 8웰 플레이트에서 MEMA의 제작에 대해 자세히 설명합니다. 프로토콜은 다른 플레이트 또는 슬라이드에 적용될 수 있다.

1. 단백질, 희석제 및 염색 완충제의 준비

1. EPM, 리간드 및 사이토카인의 바이알을 실온(RT)에 평형화하고 잠시 원심분리기를 사용합니다. 제품 데이터 시트에 표시된 대로 적절한 RT 버퍼의 적절한 볼륨을 추가합니다. 재고 농도에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오.
   참고: 리간드 및 EPM의 전체 목록과 재고 및 최종 농도가 표 1 및 표2에 제공됩니다. 리간드와 EPM은 일반적으로 표준 2일 배양 어설슬에서 생물학적 효과를 유도하는 제조업체가 권장하는 범위의 가장 높은 농도로 사용됩니다. 오염을 방지하기 위해 라미나 흐름 아래의 생체 안전 캐비닛에서 단백질을 부드럽게 처리하십시오.
2. 1 시간 동안 RT에서 부드러운 흔들림으로 바이알을 배양하십시오. 이 변성 그들을 일으킬 수 있습니다 으로 소용돌이 단백질하지 마십시오.
3. 모든 aliquots는 반복된 동결/해동 주기로 분해를 피하기 위해서만 일회용이 되도록 장기간 보관을 위한 Aliquot 단백질. 필요할 때까지 -80 °C (달리 명시되지 않은 경우)에서 동독화된 단백질을 저장합니다. (i) 단백질 이름, (ii) 준비된 날짜, (iii) 로트/배치 번호, (iv) 공급업체, (v) 카탈로그 번호, (vii) 농도, (vii) 볼륨 및 (viii) 준비자 등 향후 참조를 위해 모든 메타데이터를 수집하십시오.
4. 글리세롤 20%(v/v) 글리세롤, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7.2, 및 필터 멸균을 포함하는 희석제 완충제를 준비합니다. 이 버퍼를 멸균 상태로 유지하고 RT에 보관하십시오.
5. 인산완충식염수(PBS)에서 2%(w/v) BSA, 1 mM MgCl₂및 0.02% NaN_3를 함유하는 염색 완충액을 준비한다. 4°C에서 걸기 및 보관하십시오.

2. ECM 소스 플레이트 의 준비

1. 인쇄할 ECM 단백질의 aliquoted 주식을 제거하고 얼음에 해동합니다. 메타데이터 추적을 위해 모든 로트 번호를 기록합니다.
2. 해동된 단백질튜브를 부드럽게 톡톡하여 적절한 재서스펜션을 보장하고 원심분리기에서 스핀다운합니다.
3. ECM 인쇄 혼합물(EPM)과 형광 피덕스를 액체 처리 로봇이 사용하여 무작위 384웰 소스 플레이트를 만듭니다.
   참고: 384웰 소스 플레이트는 터치 핀 어레이 프린터에서 8개의 웰 플레이트에 인쇄된 어레이를 만드는 데 사용됩니다.
   1. 각 EPM 및 신탁에 대해 1.5 mL 미세 원심 분리튜브를 라벨로 지정합니다.
   2. 125 μL의 희석제 버퍼(1.4단계 참조)를 적절한 부피의 ECM 스톡과 결합하여 각 EPM을 준비하고 혼합물을 PBS와 함께 총 부피 250 μL까지 가져온다. 각 EPM 튜브의 최종 농도는 1x ECM 단백질, 5 mM EDTA, 10% 글리세롤 및 100 mM Tris일 것이다.
   3. 제조업체가 지정한 적절한 완충액으로 용해하여 형광 피럭을 준비하고 라벨이 부착된 신탁 튜브로 250 μL을 전달합니다.

3. 액체 핸들러를 사용하여 소스 플레이트 생성

1. EPM의 위치를 임의화하고 사용 중인 어레이 프린터 핀 헤드에 최적화된 384웰 플레이트 레이아웃을 설계합니다. 배열 방향을 지원하기 위해 각 웰의 행 1, 열 1 위치에 인쇄되도록 신탁의 배치를 디자인합니다.
   참고: 각 ECM의 총 14-15개의 복제가 강력한 데이터를 보장하는 데 사용됩니다. 결합의 균일성을 평가하기 위해 강력한 부착물을 생성하는 콜라겐 또는 다른 ECM의 추가 복제본을 포함합니다. 레이아웃은 관심 있는 EPM의 수에 따라 여러 개의 384웰 플레이트를 사용해야 할 수 있습니다.
2. EPM 튜브를 액체 핸들러로 옮기고 냉각 된 튜브 랙으로 튜브를 4 °C로 유지하거나 냉장실에있는 액체 처리 로봇을 사용하여 튜브를 유지하십시오.
3. 액체 처리기의 소프트웨어를 사용하여 각 EPM의 15 μL과 384 웰 소스 플레이트 내의 미리 지정된 우물로 신탁을 전송하는 프로그램을 실행합니다.
4. PBS를 사용하지 않은 우물에 파이펫하여 습도를 높이고 인쇄 공정 중 탈수방지를 방지합니다.
   참고: 4 x 7 핀 헤드에 최적화되어 있고 콜라겐 I 블록 및 PBS를 포함하는 384 웰 소스 플레이트 세트의 예는 도 2를 참조하십시오.
5. 접시를 밀봉하고 인쇄 할 준비가 될 때까지 4 °C에서 유지하십시오.

4. 배열 인쇄 로봇을 사용하여 MEA 인쇄

참고: 프로토콜의 다음 부분은 특히 MCF7 세포의 성장 및 증식에 대한 상이한 미세 환경 단백질의 영향을 조사하기 위해 MEMA의 제조 및 사용을 설명합니다. 그러나, 프로토콜은 다른 리간드, EMS 및 세포를 사용하여 다른 세포주 및 관심 종점을 연구하도록 용이하게 적응될 수 있다.

1. 터치 핀 프린터를 사용하여 Epm 과 fiducial 스팟을 8 개의 웰 플레이트에 인쇄하십시오. 재현성을 보장하기 위해 각 ECM 조건의 여러 복제본을 인쇄합니다.
   참고: 다른 플레이트 형식이나 슬라이드를 인쇄에 사용할 수 있지만 최적의 스팟 형성을 위해 버퍼 최적화가 필요할 수 있습니다.
   1. 4 x 7 프린트 헤드 구성으로 배열된 350 μm 직경 핀을 사용하여 MEMA용 EPM을 인쇄합니다. 8웰 플레이트의 배열을 35열로 20개의 열로 인쇄하여 총 ~700개의 지점을 지정합니다. 더 큰 배열은 이 격판덮개에서 가능하 그러나 세포 결합 과 염색 둘 다에 있는 증가한 가장자리 효력의 트레이드 오프와 함께 옵니다.
2. 인쇄 후, 사용 하기 전에 최소 3 일 동안 건조기에서 접시를 저장 합니다.

5. 리간드 처리 플레이트 의 창조

1. 관심 있는 리간드를 포함한 96웰 플레이트 레이아웃을 설계합니다. 한 번에 많은 MEMA 플레이트의 처리를 용이하게하기 위해, 8 웰 MEMA와 96 웰 플레이트의 우물 사이에 액체를 전송하는 4 간격 팁 멀티 채널 파이펫의 사용을 허용하는 간격으로이 플레이트를 설계합니다.
   참고: 이 프로토콜에서는 표 2에 나열된 전체 리간드 세트가 활용됩니다.
2. 얼음에 리간드를 해동. 각 튜브를 짧게 쓸어 넘기고 회전시다.
3. 제조업체의 권장 버퍼(일반적으로 PBS)를 사용하여 리간드를 200배 작업 재고로 희석합니다.
4. 각 200x 리간드 스톡의 파이펫 10 μL은 96웰 플레이트 내에서 해당 웰내로 한다.
5. -20 °C에서 접시를 밀봉하고 보관하십시오.
   참고: 리간드 처리 플레이트를 일괄 처리하여 다운스트림 분석을 위한 모든 메타데이터를 캡처합니다.

6. MEMA에 세포 배양

1. 20분 동안 MEMA를 20분 동안 블로킹 블로킹 버퍼당 2mL로 2%의 비파울 링 블로킹 을 함유하고 있는 비오염 차단제(재료표)를 이중 증류수(ddH_2O)에서포함시켰다.
2. PBS로 차단 버퍼 및 트리플 린스 웰을 흡인합니다. 건조를 방지하기 위해, 셀 도금준비가 될 때까지 우물에 PBS의 최종 부피를 둡니다.
   참고: MEMA에서 세포 배양 단계를 위해 두 명의 벤치 작업자를 두는 것이 매우 유용합니다. 한 벤치 작업자는 포인더스 단계를 수행할 수 있으며 두 번째 작업자는 추가 단계를 수행할 수 있습니다. 파이펫팅을 위한 8웰 플레이트와 두 개의 파스퇴르 파이펫이 있는 Y-스플리터와 일치하는 팁이 있는 1mL 멀티채널 파이펫을 사용하여 한 번에 여러 웰을 흡인하는 것이 좋습니다.
3. 종자 2 x 10⁵ MCF7 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS)을 함유하는 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM) 배지의 2 mL에서 잘 당한다.
   참고: 전체 MEMA 실험에 앞서, MEMA 스팟이 원하는 실험 기간의 끝에 높은 세포 수(그러나 수렴되지 않음)를 갖도록 세포 수를 최적화하기 위해 세포 적정 실험을 수행한다.
4. 접착 의 2-18 시간 후, 배지를 흡인하고 감소 성장 매체의 2 mL로 교체 (0.1 % FBS와 DMEM).
   참고: 감소된 혈청(예를 들어, 0.1% FBS) 또는 성장 인자 고갈 조건은 이때 특정 리간드의 자극적 영향을 격리하는데 사용될 수 있다.
5. 얼음에 리간드 처리 플레이트를 해동. 원심분리기는 1 분 동안 200 x g에서 플레이트를 해동했습니다.
6. 배양플레이트에서 각각의 웰로부터 배지의 200 μL을 처리 플레이트에서 적절한 웰로 이송한다. 리간드 부피를 중간 크기로 혼합하고 이 혼합물을 MEMA 플레이트의 적절한 우물로 다시 이송하기 위해 위아래로 피펫을 피펫합니다.
7. 손으로 가볍게 흔들고 MEMA 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 보냅니다. 37°C 및 5% CO2에서 리간드/ECM 조합의 존재 상태에서실험의 지속 기간 동안 배양.
   참고: 일반적인 MEMA 실험은 72시간 동안 실행됩니다. 더 긴 기간 실험은 리간드로 배지 및 재처리를 대체해야 할 수 있습니다.
8. 펄스 MEMA는 100x 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)과 함께 71시간에서 10 μM의 최종 농도를 위해 37°C 및 5%CO2에서 1시간 동안 EdU와 실험 조건에서 인큐베이션한다.
   참고: 다른 라이브 세포 치료는 또한 이 때 사용될 수 있다.

7. 메마의 고정 및 염색

1. 72 시간 및 모든 라이브 세포 치료 후, 우물을 흡인. RT에서 15분 동안 2% 파라포름알데히드(PFA)의 웰당 2 mL에 MEMA를 고정합니다.
2. 흡인 PFA. 15 분 동안 0.1 % nonionic 계면 활성제의 웰 당 2 mL로 퍼메아빌화하십시오.
3. 난비 계면 활성제를 흡인하고 PBS의 웰 당 2 mL로 세척합니다. 흡인 PBS. 0.05% 폴리소르베이트 20(PBS-T)으로 2mL의 PBS로 세척합니다.
   참고: MEMA 표면은 소수성이며, 얼룩 및 항체 배양 전에 PBS-T로 씻지 못하면 배양 단계 동안 우물에서 공극이 형성되고 염색 아티팩트가 발생합니다.
4. 흡인 PBS-T. EdU 검출 반응 시약을 추가합니다. RT에서 1 시간 동안 배양하고 흔들며 빛으로부터 보호하십시오. 1 시간 배양 후, 제공된 상업적 담금질 완충액으로 반응을 담금질한다.
   참고: EdU 검출 및 염색/항체 단계는 비용을 절감하기 위해 웰당 1.5 mL에서 수행될 수 있다.
5. 담금질 완충제를 흡기하고 얼룩 또는 항체로 배양하기 전에 PBS-T로 세척합니다.
6. MEMA를 히스톤 H3K9me3(1:1,000) 및 피브리알라린(1:400)에 대한 항체와 함께 배양하여 2%(w/v) 소 혈청 알부민(BSA), 1 mMM MgCl₂ 및 0.02% NaN_3을 4°C에서 밤새 염색완충충제에 함유하였다.
   참고: 전체 MEMA 세트에서 항체 적정을 사용하여 최적의 농도를 결정합니다.
7. 1 차 적인 항체 또는 얼룩 인큐베이션에 따라, PBS로 2 x 및 PBS-T로 한 번 우물을 씻으소서.
8. 보조 항체 (당나귀 안티 마우스 IgG와 당나귀 안티 토끼 IgG, 모두 1:300) 및 0.5 μg / mL 4′ 6-diamidino-2-페니 날린 돌 (DAPI). 어둠 속에서 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
9. PBS의 웰당 2 mL로 우물을 2x 씻어 최종 2 mL PBS에 남깁니다.
10. 빛으로부터 보호된 4°C에서 PBS에서 나중에 이미징을 위해 얼룩진 MEMA를 이미징또는 저장하십시오.

8. MEMAS의 이미징

1. 적절한 형광 검출 채널을 갖춘 자동화된 이미징 시스템의 이미지 MEMA.
2. 결과 이미지 데이터를 이미지 관리 시스템에 출력합니다. 셀 프로파일러 8을 사용하여셀을 분할하고 강도 수준을 계산합니다.

9. 데이터 분석

참고: 데이터 분석은 Raw CellProfiler 파생 데이터의 정규화, 변형 보정 및 요약으로 구성됩니다. 이 경우 사용자 지정 코드가 있는 R-환경은 모든 단계를 수행하는 데 사용됩니다. 그러나 모든 통계 환경 또는 소프트웨어 프로그램을 사용하여 동등한 작업을 수행할 수 있습니다. 분석을 위한 R 환경에 대한 오픈 소스 사용자 지정 코드의 예는 https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486 .

1. 분할된 이미지 데이터를 사전 처리하고 정규화합니다.
2. DAPI 염색 핵을 사용하여 스팟 세포 수를 결정합니다.
3. 자동 게이트 EdU 강도를 사용하여 셀을 EdU⁺로 레이블지정합니다. 각 스팟에서 EdU⁺ 셀의 비율을 사용하여 증식을 측정합니다.
4. 중앙값은 스팟 수준에서 세포질 얼룩 및 핵 형태 측정을 요약합니다.
5. 데이터 품질 향상을 위해 데이터에 대한 원치 않는 변형(RUV) 정규화 제거를^{수행합니다.}
   참고: 이 접근법은 앞서^9에설명된 바와 같이 행및 스팟을 사용하는 배열이 있는 매트릭스로서 각 강도 및 형태학적 신호에 독립적으로 적용된다.
6. 공간 또는 강도 관련 효과를 수정하기 위해 배열 행 및 배열 열을 독립 변수로 사용하여 RUV 정규화 된 잔류에 이변량 대류 정규화를 적용합니다.
7. 정규화가 완료되면 중앙값은 보고 및 추가 분석을 위해 각 미세 환경 조건에 대한 복제를 요약합니다.

결과

세포 성장 및 증식에 대한 미세 환경적 영향을 단순화하고 세포 성장 및 증식을 촉진 또는 억제하는 조건을 식별하기 위해, 유방암 세포주 MCF7은 프로토콜에 기재된 바와 같이 8개의 8-well MEMA 세트에 시드되었다. 이 분석은 총 2736개의 조합 미세 환경 조건에 대해 48개의 상이한 EPM 및 57개의 다른 리간드에 세포를 노출하였다. 배양 에서 71 시간 후, 세포는 EdU, 고정, 투과 및 DAPI로 염색, EdU 검출에 대?...

토론

"차원성"과 맥락의 중요성은 미세 환경^(11)과의상호 작용을 통해 암세포의 특성화에 도구로서 시험관 내 배양 시스템의 개발에 동기 부여 요인이되었습니다 11, 및 생체 외에서의 능력 생체 내 환경을 모방하는 문화 시스템은 이러한 문화 시스템을 개선하기 위한 탐구의 원동력입니다. 그러나 체외 시스템은 복잡한 생체 내 상황을 단순화된 모델^12로증류하는 능?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aushon 2470	Aushon BioSystems		Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA	Nikon		High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler	BioTek		liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution	Sigma	T2069
EDTA	Invitrogen	15575-038
Glycerol	Sigma	G5516
Triton X100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P7949
Kolliphor P338	BASF	50424591
384-well microarray plate, cylindrical well	Thermo Fisher	ab1055
Nunc 8 well dish	Thermo Fisher	267062
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Science	15710
BSA	Fisher	BP-1600
Sodium Azide	Sigma	S2002
Cell Mask	Molecular Probes	H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor	Molecular Probes	C10357
DAPI	Promo Kine	PK-CA70740043
ALCAM	R & D Systems	656-AL	ECM
Cadherin-20 (CDH20)	R & D Systems	5604-CA	ECM
Cadherin-6 (CDH6)	R & D Systems	2715-CA	ECM
Cadherin-8 (CDH8)	R & D Systems	188-C8	ECM
CD44	R & D Systems	3660-CD	ECM
CEACAM6	R & D Systems	3934-CM	ECM
Collagen I	Cultrex	3442-050-01	ECM
Collagen Type II	Millipore	CC052	ECM
Collagen Type III	Millipore	CC054	ECM
Collagen Type IV	Sigma	C5533	ECM
Collagen Type V	Millipore	CC077	ECM
COL23A1	R & D Systems	4165-CL	ECM
Desmoglein 2	R & D Systems	947-DM	ECM
E-cadherin (CDH1)	R & D Systems	648-EC	ECM
ECM1	R & D Systems	3937-EC	ECM
Fibronectin	R & D Systems	1918-FN	ECM
GAP43	Abcam	ab114188	ECM
HyA-500K	R & D Systems	GLR002	ECM
HyA-50K	R & D Systems	GLR001	ECM
ICAM-1	R & D Systems	720-IC	ECM
Laminin	Sigma	L6274	ECM
Laminin-5	Abcam	ab42326	ECM
Lumican	R & D Systems	2846-LU	ECM
M-Cad (CDH15)	R & D Systems	4096-MC	ECM
Nidogen-1	R & D Systems	2570-ND	ECM
Osteoadherin/OSAD	R & D Systems	2884-AD	ECM
Osteopontin (SPP)	R & D Systems	1433-OP	ECM
P-Cadherin (CDH3)	R & D Systems	861-PC	ECM
PECAM1	R & D Systems	ADP6	ECM
Tenascin C	R & D Systems	3358-TC	ECM
VCAM1	R & D Systems	ADP5	ECM
Vitronectin	R & D Systems	2308-VN	ECM
Biglycan	R & D Systems	2667-CM	ECM
Decorin	R & D Systems	143-DE	ECM
Periostin	R & D Systems	3548-F2	ECM
SPARC/osteonectin	R & D Systems	941-SP	ECM
Thrombospondin-1/2	R & D Systems	3074-TH	ECM
Brevican	R & D Systems	4009-BC	ECM
Elastin	BioMatrix	5052	ECM
Fibrillin	Lynn Sakai Lab OHSU	N/A	ECM
ANGPT2	RnD_Systems_Own	623-AN-025	Ligand
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CXCL8	RnD_Systems_Own	208-IL-010	Ligand
IGF1	RnD_Systems_Own	291-G1-200	Ligand
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JAG1	RnD_Systems_Own	1277-JG-050	Ligand
BMP7	RnD_Systems_Own	354-BP-010	Ligand
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VEGFA	RnD_Systems_Own	293-VE-010	Ligand
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IGFBP2	RnD_Systems_Own	674-B2-025	Ligand
SHH	RnD_Systems_Own	1314-SH-025	Ligand
FASLG	RnD_Systems_Own	126-FL-010	Ligand