Использование Microarrays для допроса микроenvironmentale влияние на клеточные фенотипы при раке

Резюме

Цель метода, представленного здесь, состоит в том, чтобы показать, как микроокружение microarrays (MEMA) могут быть изготовлены и использованы для допроса воздействия тысяч простых комбинаторных микросред на фенотип культивированных клеток.

Аннотация

Понимание влияния микроокружения на фенотип клеток является сложной проблемой из-за сложной смеси как растворимых факторов роста, так и матричных белков в микроокружении in vivo. Кроме того, легкодоступные реагенты для моделирования микросред в пробирке обычно используют сложные смеси белков, которые не полностью определены и страдают от пакетной к пакетной изменчивости. Платформа микроокружения microarray (MEMA) позволяет оценить тысячи простых комбинаций белков микросреды для их воздействия на клеточные фенотипы в одном анализе. MEMAs готовятся в колодцах, что позволяет добавление отдельных лигандов отделять скважины, содержащие массивные внеклеточные матричные белки (ECM). Сочетание растворимого лиганда с каждым печатным ECM образует уникальное сочетание. Типичный анализ MEMA содержит более 2500 уникальных комбинаторных микросред, что клетки подвергаются в одном анализе. В качестве тестового случая, линия клеток рака молочной железы MCF7 была покрыта на платформе MEMA. Анализ этого анализа выявил факторы, которые как усиливают и препятствуют росту и распространению этих клеток. Платформа MEMA является очень гибкой и может быть расширена для использования с другими биологическими вопросами, помимо исследований рака.

Введение

Культирование раковых клеток линий на пластике в двумерных (2D) монослой остается одним из основных рабочих лошадок для исследователей рака. Тем не менее, микросреда все больше признается за его способность влиять на клеточные фенотипы. При раке, микроокружение опухоли, как известно, влияет на несколько клеточного поведения, в том числе рост, выживание, вторжение, и ответ на терапию^1,2. Традиционные монослойные клеточные культуры, как правило, не имеют влияния микроэкологии, что привело к разработке более сложных трехмерных (3D) анализов для выращивания клеток, в ключая коммерчески доступные очищенные экстракты мембраны подвала. Тем не менее, эти очищенные матрицы, как правило, сложны в использовании и страдают от технических проблем, таких как вариабельность пакетов³ и сложные композиции^3. В результате, это может быть трудно назначить функцию конкретных белков, которые могут влиять на клеточные фенотипы³.

Для устранения этих ограничений мы разработали технологию микроокружения microarray (MEMA), которая сводит микроокружение к простым сочетаниям внеклеточной матрицы (ECM) и растворимых белков фактора роста^4,5 . Платформа MEMA позволяет выявлять доминирующие микроэкологические факторы, влияющие на поведение клеток. Используя формат массива, тысячи комбинаций факторов микросреды могут быть рассмотрены в одном эксперименте. MEMA описал здесь допрашивает 2500 различных уникальных условий микросреды. Белки ECM, напечатанные в хорошо пластины образуют рост колодки, на которых клетки могут быть культивированы. Растворимые лиганды добавляются в отдельные скважины, создавая уникальные комбинаторные микросреды (ECM и ligand) на каждом различном месте, к которому подвергаются клетки. Клетки культивируются в течение нескольких дней, затем фиксируются, окрашиваются и образуются для оценки клеточных фенотипов в результате воздействия этих специфических комбинаций микросреды. Поскольку микросреда представляет собой простые комбинации, легко определить белки, которые управляют основными фенотипическими изменениями в клетках. MEMAs были успешно использованы для выявления факторов, которые влияют на несколько клеточных фенотипов, в том числе те, которые управляют решениями судьбы клеток и ответ на терапию^4,5,6,7. Эти ответы могут быть проверены в простых 2D-экспериментов, а затем могут быть оценены в условиях, которые более полно резюмировать сложность микросреды опухоли. Платформа MEMA хорошо адаптируется к различным типам клеток и конечным точкам, при условии, что имеются хорошие фенотипические биомаркеры.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор всего процесса MEMA, включая расчетное время, изложен на диаграмме потока, показанной на рисунке 1. В этом протоколе подробно описано изготовление MEMA в 8-колодцах. Протокол может быть адаптирован для других пластин или слайдов.

1. Подготовка белков, разбавитель, и окрашивания буферов

1. Равновесие флаконов ЭКМ, лигандов и цитокинов к комнатной температуре (RT) и краткоцентрике. Добавьте соответствующий объем соответствующего буфера RT, указанного в листе данных о продукте. Следуйте рекомендациям производителя в расчете на концентрацию запасов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полный список лигандов и ЭКМ с их запасами и конечными концентрациями приведен в таблице 1 и таблице2. Оба лиганда и ЭКМ, как правило, используются при самой высокой концентрации диапазона, рекомендованных производителем, что вызывает биологический эффект в стандартных 2-дневный анализ культуры. Ручка белки мягко и в биобезопасности шкафы под ламинарный поток, чтобы избежать загрязнения.
2. Инкубировать флаконы с нежным раскачиванием на RT за 1 ч. Не вихревые белки, так как это может привести к их денатурации.
3. Белки Aliquot для долгосрочного хранения так, что все aliquots одноразового использования только для того чтобы во избежание деградация с повторными циклами замораживания/оттепели. Храните лиофилизированные белки при -80 градусах по Цельсию (если не указано иное) до необходимости. Позаботьтесь о сборе всех метаданных для будущей ссылки, таких как: (i) название белка, (ii) дата подготовлена, (iii) лот/номер партии, (iv) поставщик, (v) номер каталога, (vi) концентрация, (vii) объем, и (viii) подготовителя.
4. Приготовьте разбавительный буфер, содержащий 20% (v/v) глицерол, 10 мМ EDTA, 200 мМ Tris-HCl, pH 7.2, и фильтр стерилизовать. Держите этот буфер стерильным и храните на RT.
5. Подготовка окрашивания буфера, содержащего 2% (w/v) BSA, 1 мМ MgCl₂, и 0.02% NaN₃ в фосфат-буферных солив (PBS). Фильтр и хранить при 4 градусах По Цельсию.

2. Подготовка ECM Исходная плита

1. Удалите алицитные запасы белков ECM для печати и оттаивания на льду. Запись всех номеров лотов для отслеживания метаданных.
2. Флик трубки оттаяли белков осторожно, чтобы обеспечить надлежащее повторное приостановление и спина вниз в центрифуге.
3. Сделать ECM печати смесей (EPMs) и флуоресцентные фидуциальное для использования жидким роботом обработки, который создаст рандомизированных 384-хорошо источник пластин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 384-хорошо источник пластин ы будет использоваться сенсорным контактным массивом принтера для создания печатных массивов в 8 хорошо пластин.
   1. Этикетка 1,5 мл микроцентрифуговых труб для каждого EPM и фидуциальной.
   2. Подготовьте каждый EPM, объединив 125 л разбавительного буфера (см. шаг 1.4) с соответствующим объемом eCM запаса и довести смесь до общего объема 250 Зл с PBS. Окончательные концентрации в каждой трубке EPM будут 1x eCM протеин, 5 mM EDTA, 10% glycerol, и 100 mM Tris.
   3. Подготовьте флуоресцентный фидуциал, растворив его в соответствующем буфере, указанном производителем, и перенесите 250 л на маркированную фидуциальную трубку.

3. Создание исходной плиты с использованием жидкого обработчика

1. Дизайн 384-луп овойте, который рандомизирует позиции ECM и оптимизируется для используемой головки контактного кода принтера массива. Дизайн размещения фидуциальных так, что он будет напечатан в строке 1, столбец 1 положение каждого хорошо, чтобы помочь в ориентации массива.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения надежных данных используется в общей сложности 14–15 репликаций каждого ECM. Включите дополнительные репликации коллагена или другого ECM, который дает надежное вложение для оценки единообразия связывания. Макет, возможно, потребуется использовать несколько 384-колодец пластин в зависимости от количества ECMs интерес.
2. Передача EPM трубки жидких обработчик, сохраняя трубки на 4 кВ либо с охлажденный трубки стойки или с помощью жидкой обработки робота, расположенного в холодной комнате.
3. Используя программное обеспечение обработчика жидкости, запустите программу для переноса 15 qL каждого EPM и фидуциальных к заранее назначенным скважинам в пределах 384-хорошей пластины источника (ы).
4. Pipet PBS в любые неиспользованные скважины для повышения влажности и защиты от высыхания во время процесса печати.
   ПРИМЕЧАНИЕ: См Рисунок 2 на примере 384-хорошо набор пластины источника, который оптимизирован для 4 х 7 контактный головка и включает в себя коллаген i блок и PBS.
5. Печать пластины (ы) и держать при 4 градусах По Цельсию до готовности к печати.

4. Печать MEMAs с использованием робота-печати array

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая часть протокола конкретно описывает подготовку и использование MEMA для исследования влияния различных белков микросреды на рост и распространение клеток MCF7. Тем не менее, протокол может быть легко адаптирован для использования различных лигандов, ECMs и клеток для изучения других клеточных линий и конечных точек интереса.

1. Использование сенсорного принтера, печать EPMs и фидуциальных пятен в 8 хорошо пластин. Печать нескольких репликаций каждого состояния ECM для обеспечения воспроизводимости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие форматы пластин или слайды могут быть использованы для печати, но оптимизация буфера может потребоваться для достижения оптимального образования точек.
   1. Печать ECMs для MEMA с использованием 350 мкм диаметром булавки расположены в 4 х 7 печати головы конфигурации. Печать массивов в 8-ну колодцев, как 20 столбцов на 35 строк, в общей сложности 700 пятен. Большие массивы возможны в этих пластинах, но поставляются с компромиссом увеличенных эффектов края как в связывании клеток и окрашивания.
2. После печати храните тарелки в обезвраживаемом месте в течение как минимум 3 дней до использования.

5. Создание лигандских лечебных пластин

1. Дизайн 96-ну хорошо планировки пластины в том числе лиганды интерес. Чтобы облегчить обработку многих пластин MEMA сразу, спроектируйте эту пластину с интервалом, что позволяет использовать многоканальный трубчатый с 4 расставленными наконечниками для передачи жидкостей между скважинами 8-хорошо MEMAs и 96-хорошей пластиной.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используется полный набор лигандов, перечисленных в таблице 2.
2. Оттепель лиганды на льду. Кратко Флик и спина вниз каждой трубки.
3. Разбавлять лиганды до 200-х рабочих запасов с помощью рекомендованный буфер производителя (обычно PBS).
4. Пипер 10 л каждого 200-х лиганда в соответствующую скважину в пределах 96-колодца пластины.
5. Печать и хранить тарелки при -20 градусах Цельсия.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сделать лиганд лечения пластин в партиях, захватив все метаданные для анализа вниз по течению.

6. Культивирование ячеек на МЕМА

1. Блок MEMAs в течение 20 минут с 2 мл на скважину не-загрязнения блокирующий буфер, содержащий 1% незагрязняющий блокирующий агент(Таблица материалов) в двойной дистиллированной воде (ddH₂O).
2. Аспир блокирующий буфер и тройной промывки скважин с помощью PBS. Для предотвращения высыхания, оставьте окончательный объем PBS в скважинах до готовности к клеточному покрытию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это чрезвычайно полезно иметь два скамейки работников для клеточной культуры шаги на MEMAs. Один работник скамейки может выполнять шаги аспирации, в то время как второй выполняет дополнительные шаги. Рекомендуется использовать 1 мл многоканального пайпета с наконечниками, расположенными в соответствии с 8-хорошо пластины для pipetting и Y-сплиттер с двумя пастерпицы, чтобы аспирировать несколько скважин одновременно.
3. Семена 2 х 10⁵ клеток MCF7 на скважину в 2 мл модифицированной среды Орла Dulbecco (DMEM), содержащей 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед полным экспериментом MEMA, выполнить эксперимент титрования клеток для оптимизации числа клеток, таким образом, что пятна MEMA имеют высокие номера клеток (но не конфлеятор) в конце желаемой экспериментальной продолжительности.
4. После 2–18 ч слякоть, аспирируйте среднюю и заменяйте 2 мл среды с пониженным ростом (DMEM с 0,1% FBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Снижение сыворотки (например, 0,1% FBS) или фактор роста истощенных условиях могут быть использованы в это время для изоляции стимулирующего воздействия конкретных лигандов.
5. Оттепель лигандовой лечебной пластины на льду. Центрифуга разморожена по 200 х г в течение 1 мин.
6. Перенесите 200 л среды от каждого колодца в культурной тарелке к соответствующему колодцу в лечебной пластине. Pipet вверх и вниз, чтобы смешать объем лиганда со средним и передать эту смесь обратно в соответствующий хорошо в пластине MEMA.
7. Слегка раскачивайтесь вручную и возвращайте пластины MEMA в инкубатор. Культура на протяжении всего эксперимента при наличии комбинации лиганд/Экм при 37 градусах Цельсия и 5% CO_2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Типичный эксперимент MEMA длится 72 ч; более длительные эксперименты могут потребовать замены средней и повторной обработки лигандой.
8. Пульс овсяные скважины MEMA при 71 ч со 100х 5-этинил-2'-деоксюридин (EdU) для окончательной концентрации 10 мкм. Инкубируйтев экспериментальных условиях с EdU для 1 ч при 37 C и 5% CO 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Другие живые клетки лечения также могут быть использованы в это время.

7. Фиксация и окрашивание МЕМА

1. После 72 ч и любых живых клеточных процедур, аспирных колодцев. Исправить MEMAs в 2 мл на скважину 2% параформальдегида (PFA) в течение 15 минут на RT.
2. Аспир ПФА. Пермяки с 2 мл на скважину 0,1% неионического сурфактанта в течение 15 мин.
3. Аспирируй неионический сурфактант и мыть с 2 мл на скважину PBS. Аспирируй PBS. Мытье с 2 мл PBS с 0,05% полисорбат 20 (PBS-T).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность MEMA гидрофобна, и отказ мыть с PBS-T до инкубации пятна и антитела приведет к образованию пустот в скважинах во время инкубационных шагов и приведет к окрашиванию артефактов.
4. Аспират PBS-T. Добавьте реагенты реакции обнаружения EdU. Инкубировать в течение 1 ч на RT, качаясь и защищены от света. После 1 ч инкубации, утолить реакцию с предусмотренным коммерческим буфером утоления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: EdU обнаружения и окрашивания / антитела шаги могут быть выполнены в 1,5 мл на хорошо, чтобы уменьшить стоимость.
5. Призадыхать утолить буфер и промыть PBS-T до инкубации с пятнами или антителами.
6. Инкубировать MEMA скважины с антителами против гистона H3K9me3 (1:1,000) и фибрилларин (1:400) в окрашивание буфера, содержащего 2% (w/v) бычьей сыворотки альбумина (BSA), 1 мМ MgCl₂ и 0.02% NaN₃ ночь на 4 кв.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните титрования антител, чтобы определить оптимальные концентрации до их использования на полном наборе MEMA.
7. После первичного антитела или пятно инкубации, мыть колодцы 2x с PBS и один раз с PBS-T.
8. Добавьте вторичные антитела (осел анти-мышь IgG и осел анти-кролик IgG, как 1:300) и 0,5 мкг /мл 4 "6-диамидино-2-фенилинзол (DAPI). Инкубировать 1 ч на RT в темноте.
9. Вымойте скважины 2x с 2 мл на скважину PBS, оставляя их в финале 2 мл PBS.
10. Приступить к визуализации или хранить окрашенные MEMAs для последующего изображения в PBS при 4 градусах по Цельсию, защищенных от света.

8. Изображение МЕМА

1. Изображение MEMA на автоматизированной системе визуализации с соответствующими каналами флуоресцентного обнаружения.
2. Вывод данных изображений в систему управления изображениями. Сегментные клетки и вычислить уровни интенсивности с помощью CellProfiler⁸.

9. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ данных состоит из нормализации, коррекции изменений и обобщения необработанных данных CellProfiler. В этом случае R-среда с пользовательским кодом используется для выполнения всех шагов. Тем не менее, любая статистическая среда или программа программного обеспечения могут быть использованы для выполнения эквивалентных действий. Пример пользовательского кода с открытым исходным кодом для среды R для анализа доступен по адресу: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

1. Предварительное обработка и нормализация сегментированных данных изображений.
2. Определите количество точечных клеток с помощью окрашенных ядер DAPI.
3. Авто-ворота EdU интенсивность для обозначения клеток, как EdU^. Измерьте пролиферацию, используя пропорцию клеток EdU^в каждом месте.
4. Медианные суммируют цитоплазматические пятна и измерения ядерной морфологии на спот-уровне.
5. Выполните удаление нежелательных изменений (RUV) нормализации на данных для улучшения качества данных⁹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот подход применяется к каждой интенсивности и морфологии сигнал атебов независимо как матрица с массивами, использующими строки и пятна, как столбцы, как описано ранее⁹.
6. Применить нормализацию двухвариатной лэсск к нормализованным остаткам RUV, используя строку массива и столбец массива в качестве независимых переменных для коррекции пространственных или связанных с интенсивностью эффектов.
7. Как только нормализация завершена, медиана суммирует репликации для каждого состояния микросреды для отчетности и дальнейшего анализа.

Результаты

Для упрощения воздействия микроenvironmentalов на рост и пролиферацию клеток и выявления условий, способствующих или препятствуя росту и пролиферации клеток, линия клеток рака молочной железы MCF7 была посеяна на комплекте из восьми 8-ну хорошо MEMAs, как описано в протоколе. Этот анализ подверга...

Обсуждение

Важность "мерности" и контекста был мотивирующее фактор в развитии систем культуры in vitro в качестве инструментов в характеристике раковых клеток через их взаимодействие с микросредой¹¹, и способность in vitro культурные системы для имитации среды in vivo является движущей силой с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aushon 2470	Aushon BioSystems		Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA	Nikon		High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler	BioTek		liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution	Sigma	T2069
EDTA	Invitrogen	15575-038
Glycerol	Sigma	G5516
Triton X100	Sigma	T9284
Tween 20	Sigma	P7949
Kolliphor P338	BASF	50424591
384-well microarray plate, cylindrical well	Thermo Fisher	ab1055
Nunc 8 well dish	Thermo Fisher	267062
Paraformaldehyde 16% solution	Electron Microscopy Science	15710
BSA	Fisher	BP-1600
Sodium Azide	Sigma	S2002
Cell Mask	Molecular Probes	H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor	Molecular Probes	C10357
DAPI	Promo Kine	PK-CA70740043
ALCAM	R & D Systems	656-AL	ECM
Cadherin-20 (CDH20)	R & D Systems	5604-CA	ECM
Cadherin-6 (CDH6)	R & D Systems	2715-CA	ECM
Cadherin-8 (CDH8)	R & D Systems	188-C8	ECM
CD44	R & D Systems	3660-CD	ECM
CEACAM6	R & D Systems	3934-CM	ECM
Collagen I	Cultrex	3442-050-01	ECM
Collagen Type II	Millipore	CC052	ECM
Collagen Type III	Millipore	CC054	ECM
Collagen Type IV	Sigma	C5533	ECM
Collagen Type V	Millipore	CC077	ECM
COL23A1	R & D Systems	4165-CL	ECM
Desmoglein 2	R & D Systems	947-DM	ECM
E-cadherin (CDH1)	R & D Systems	648-EC	ECM
ECM1	R & D Systems	3937-EC	ECM
Fibronectin	R & D Systems	1918-FN	ECM
GAP43	Abcam	ab114188	ECM
HyA-500K	R & D Systems	GLR002	ECM
HyA-50K	R & D Systems	GLR001	ECM
ICAM-1	R & D Systems	720-IC	ECM
Laminin	Sigma	L6274	ECM
Laminin-5	Abcam	ab42326	ECM
Lumican	R & D Systems	2846-LU	ECM
M-Cad (CDH15)	R & D Systems	4096-MC	ECM
Nidogen-1	R & D Systems	2570-ND	ECM
Osteoadherin/OSAD	R & D Systems	2884-AD	ECM
Osteopontin (SPP)	R & D Systems	1433-OP	ECM
P-Cadherin (CDH3)	R & D Systems	861-PC	ECM
PECAM1	R & D Systems	ADP6	ECM
Tenascin C	R & D Systems	3358-TC	ECM
VCAM1	R & D Systems	ADP5	ECM
Vitronectin	R & D Systems	2308-VN	ECM
Biglycan	R & D Systems	2667-CM	ECM
Decorin	R & D Systems	143-DE	ECM
Periostin	R & D Systems	3548-F2	ECM
SPARC/osteonectin	R & D Systems	941-SP	ECM
Thrombospondin-1/2	R & D Systems	3074-TH	ECM
Brevican	R & D Systems	4009-BC	ECM
Elastin	BioMatrix	5052	ECM
Fibrillin	Lynn Sakai Lab OHSU	N/A	ECM
ANGPT2	RnD_Systems_Own	623-AN-025	Ligand
IL1B	RnD_Systems_Own	201-LB-005	Ligand
CXCL8	RnD_Systems_Own	208-IL-010	Ligand
IGF1	RnD_Systems_Own	291-G1-200	Ligand
TNFRSF11B	RnD_Systems_Own	185-OS	Ligand
BMP6	RnD_Systems_Own	507-BP-020	Ligand
FLT3LG	RnD_Systems_Own	308-FK-005	Ligand
CXCL1	RnD_Systems_Own	275-GR-010	Ligand
DLL4	RnD_Systems_Own	1506-D4-050	Ligand
HGF	RnD_Systems_Own	294-HGN-005	Ligand
Wnt5a	RnD_Systems_Own	645-WN-010	Ligand
CTGF	Life_Technologies_Own	PHG0286	Ligand
LEP	RnD_Systems_Own	398-LP-01M	Ligand
FGF2	Sigma_Aldrich_Own	SRP4037-50UG	Ligand
FGF6	RnD_Systems_Own	238-F6	Ligand
IL7	RnD_Systems_Own	207-IL-005	Ligand
TGFB1	RnD_Systems_Own	246-LP-025	Ligand
PDGFB	RnD_Systems_Own	220-BB-010	Ligand
WNT10A	Genemed_Own	90009	Ligand
PTN	RnD_Systems_Own	252-PL-050	Ligand
BMP3	RnD_Systems_Own	113-BP-100	Ligand
BMP4	RnD_Systems_Own	314-BP-010	Ligand
TNFSF11	RnD_Systems_Own	390-TN-010	Ligand
CSF2	RnD_Systems_Own	215-GM-010	Ligand
BMP5	RnD_Systems_Own	615-BMC-020	Ligand
DLL1	RnD_Systems_Own	1818-DL-050	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	296-HR-050	Ligand
KNG1	RnD_Systems_Own	1569-PI-010	Ligand
GPNMB	RnD_Systems_Own	2550-AC-050	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	350-NS-010	Ligand
IL15	RnD_Systems_Own	247-ILB-005	Ligand
TNF	RnD_Systems_Own	210-TA-020	Ligand
IGFBP3	RnD_Systems_Own	675-B3-025	Ligand
WNT3A	RnD_Systems_Own	5036-WNP-010	Ligand
PDGFAB	RnD_Systems_Own	222-AB	Ligand
AREG	RnD_Systems_Own	262-AR-100	Ligand
JAG1	RnD_Systems_Own	1277-JG-050	Ligand
BMP7	RnD_Systems_Own	354-BP-010	Ligand
TGFB2	RnD_Systems_Own	302-B2-010	Ligand
VEGFA	RnD_Systems_Own	293-VE-010	Ligand
IL6	RnD_Systems_Own	206-IL-010	Ligand
CXCL12	RnD_Systems_Own	351-FS-010	Ligand
NRG1	RnD_Systems_Own	378-SM	Ligand
IGFBP2	RnD_Systems_Own	674-B2-025	Ligand
SHH	RnD_Systems_Own	1314-SH-025	Ligand
FASLG	RnD_Systems_Own	126-FL-010	Ligand