Suero humano Anti-Acuaporina-4 inmunoglobulina G detección por análisis Cell-based

Resumen

Ensayo basado en células es un método ampliamente utilizado para detectar la inmunoglobulina del suero de anti-Acuaporina-4 G. Este método podría aplicarse a diagnóstico clínico y las investigaciones científicas de los trastornos del espectro óptico de Neuromielitis óptica.

Resumen

Anti-Acuaporina-4 (AQP4) inmunoglobulina G (IgG) es el biomarcador diagnóstico base para trastornos del espectro de Neuromielitis optica (NMOSD). El ensayo celular (CBA) es un método ampliamente utilizado para la detección de IgG anti-AQP4 en suero humano con alta sensibilidad y especificidad. Brevemente, suero IgG anti-AQP4 es captada por células transfected AQP4 que es fijo en el biochip entonces detectado por un anticuerpo secundario marcado con fluoresceína. Microscopía de fluorescencia se utiliza para visualizar la fluorescencia, y la intensidad de fluorescencia es evaluada por al menos dos médicos experimentados. Puede hacer un diagnóstico definitivo de NMOSD basado en la combinación de resultados de detección de IgG anti-AQP4, manifestaciones clínicas y resultados neuroradiological. Según estudios previos, CBA es más sensible y específico que otros métodos de detección de IgG anti-AQP4, y puede ser aplicado al diagnóstico clínico y estudios de NMOSD. El método tiene limitaciones; por ejemplo, todavía carece de una escala internacional para evaluar los títulos de IgG del suero anti-AQP4. Aquí, se describe un protocolo detallado para la detección de IgG anti-AQP4 suero humano utilizando CBA.

Introducción

Suero IgG de AQP4 es un biomarcador diagnóstico base para Neuromielitis optica espectro trastornos (NMOSD)¹. El ensayo celular (CBA) es un método de detección de IgG anti-AQP4 ampliamente utilizado con alta sensibilidad y especificidad. Aquí, se presenta un protocolo detallado para el CBA.

AQP4, una proteína de canal de agua, tiene seis unidades que atraviesan la membrana y dos dominios helicoidales rodeando uno acuoso poro². IgG anti-AQP4 es implicar en la patogenesia de NMOSD mediante el enlace a su objetivo de AQP4, que se encuentra principalmente en el endfeet de astrocitos³. Se ha demostrado que la IgG anti-AQP4 es positiva en aproximadamente dos tercios de NMOSD pacientes⁴. En los más recientes criterios de diagnóstico internacionales para NMOSD, IgG anti-AQP4 se considera un núcleo biomarcador diagnóstico⁵. En este sentido, es crucial para establecer un protocolo confiable para la detección de suero humano IgG anti-AQP4 y facilitar el diagnóstico clínico de NMOSD.

Actualmente, varios métodos de detección de IgG anti-AQP4 están disponibles, como CBA, análisis de tejidos, análisis enzima-ligado del inmunosorbente y flujo cytometry^6,7. CBA emplea EU90 células, que son transfectadas con AQP4 humana, captar IgG anti-AQP4. La IgG anti-AQP4 capturado es detectada por anticuerpos fluorescentes de secundarios y posteriormente visualizada por microscopía. La acumulación de pruebas ha demostrado que la CBA es más sensible y específico que otros anti-AQP4 IgG detección métodos^6,7. Según un meta-análisis, la sensibilidad y especificidad de la CBA se demostró que el 76% y 99%, que fueron superior a base de tejido y análisis de la enzima-ligado del inmunosorbente⁶. Además, una comparación multicéntrica de diagnóstico análisis de IgG anti-AQP4 fue llevado a cabo⁷. Un total de 193 estudio temas de 15 centros diagnóstico europeos fueron inscritos⁷. Se utilizaron cuatro métodos distintos para la detección de IgG del suero anti-AQP4⁷. Se demostró que el CBA fue más sensible y específico que otros métodos⁷. AQP4 es expresada como dos isoformas principales (AQP4-M1 y AQP4 M23), celular de captura de IgG anti-AQP4 es transfected con AQP4-M1 o AQP4 M23. Sin embargo, qué tipo de célula de captura es mejor sigue siendo controvertido. Una investigación ha apoyado AQP4-M1 base CBA⁸, mientras que otros han indicado que AQP4 M23 basado en CBA es mejor^7,9,10. Sin embargo, AQP4 M23 basado en CBA puede producir resultados falsos positivos debido a la no específica IgG enlace⁸. Jarius et al.. ¹¹ informó que no hubo ninguna diferencia significativa en las tasas de detección de IgG anti-AQP4 entre M1 de AQP4 y AQP4 M23 basado en CAD.

En Resumen, suero anti-AQP4 IgG es un biomarcador de núcleo para NMOSD. CBA tiene mayor especificidad y sensibilidad que otros métodos de detección de IgG anti-AQP4. Sigue siendo polémico si la AQP4-M1 o AQP4 M23-basado en CBA es mejor. En este artículo, se describe un protocolo detallado para CBA AQP4 M1-basada, que puede aplicar a diagnóstico clínico y estudios de NMOSD.

Protocolo

Este procedimiento fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad del primer Hospital de Jilin y se realizó en aproximadamente 1.500 temas.

1. paciente inscripción y recogida de muestras de sangre

1. Aplicar la detección de laboratorio del suero de que IgG anti-AQP4 en pacientes de la clínica con las principales quejas y los síntomas enumerado a continuación. Realizar exámenes físicos también.
   
   Neuritis óptica: pacientes sufren déficits visuales, tales como pérdida de campos visuales y reducción de la agudeza visual.
   Mielitis aguda: los pacientes pueden presentar con parálisis, déficits sensoriales y disfunción autonómica.
   Síndrome del área postrema: los pacientes pueden tener síntomas de hipo e inexplicable, náuseas o vómitos.
   Síndrome de médula oblonga aguda: lesiones del médula oblonga pueden resultar en diferentes síntomas y signos dependiendo de la localización de las lesiones.
   Narcolepsy sintomático o agudo diencefálico síndrome clínico con lesiones diencefálicas NMOSD típico del MRI.
   Síndrome cerebral sintomático con NMOSD típicas lesiones cerebrales.
   
   Nota: Según los criterios diagnósticos de consenso internacional para NMOSD⁵, se puede hacer un diagnóstico de NMOSD si el paciente es el suero anti-AQP4 IgG positivo y cuenta con al menos una de las características clínicas fundamentales mencionados anteriormente. Sin embargo, no recomendamos pruebas de IgG anti-AQP4 en pacientes con neuritis óptica solamente.
2. Recogida de muestras de sangre
   Nota: pacientes no es necesario ser ayuno.
   1. Dibujar 2-3 mL de sangre venosa en un tubo de colección de sangre vacío de 4 mL.
   2. Permita que el suero coagule durante 30 min a temperatura ambiente (RT).
      Nota: Coagulación prolongado puede aumentar niveles séricos debido a la pérdida de plaquetas.
   3. Centrífuga a 2100 x g por 5 min transferir cuidadosamente el suero a un tubo nuevo.
   4. Analizar el suero inmediatamente o alícuota y almacenar a -20 ó -80 º C.
      Nota: Almacenamiento a-20 ° C es para el almacenamiento de meses, mientras que es de-80 ° C para almacenamiento de años.

2. anti-AQP4 detección del anticuerpo

PRECAUCIÓN: Las muestras y los reactivos del kit utilizado deben considerarse material infeccioso. Reactivos que contienen azida de sodio en el kit son tóxicos. Un diagrama de flujo del Protocolo se proporciona en la figura 1.

1. Preparación
   1. Llevar el kit a RT antes del uso.
      Nota: Guarde el juego a 2-8 ° C.
   2. Preparar por lo menos 200 mL de tampón de lavado PBS que contenía 0,2% Tween 20. Vierta 100 mL de tampón de lavado en un vaso de precipitados de 500 mL.
   3. Diluir el suero muestras 10 x tampón de lavado. Preparar los controles positivos y negativos según las instrucciones del distribuidor.
2. Incubación de la muestra
   1. Añadir 30 μL las muestras diluidas previamente control positivo y control negativo a los campos de reacción de la bandeja de reactivo (figura 2).
      Nota: Evitar las burbujas de aire.
   2. Retire la cubierta protectora en las diapositivas del biochip.
      Nota: No toque los biochips para evitar el desprendimiento y la contaminación de las células fijas. Mantenga el lado a lado de la diapositiva antes de quitar la tapa.
   3. La diapositiva del biochip se aplican a la bandeja de reactivo (figura 2). Iniciar una incubación de 30 min a TA.
      Nota: Cada muestra debe ser una gota individual conectado al biochip correspondiente sin mezclar con otras gotitas.
   4. Suavemente le enjuagar el portaobjetos biochip una vez con tampón de lavado. Sumerja el portaobjetos de biochips en el vaso de 500 mL con 100 mL de tampón de lavado durante al menos 5 min lugar el vaso en un agitador y si es posible.
   5. Sacar el portaobjetos de biochip del tampón de lavado. Cuidadosamente Limpie el tampón de lavado residual fuera de los campos de reacción con una toalla de papel. Exponga la diapositiva biochip aire libre 1-2 minutos que se evapore el tampón de lavado residual en el campo de la reacción.
      Nota: No seque hacia fuera de los campos de reacción. No toque los biochips con toalla de papel.
3. Incubación del anticuerpo secundario
   1. Preparar la solución de anticuerpo secundario según las instrucciones del distribuidor.
   2. Añada 25 μl del anticuerpo secundario fluorescente a los campos de reacción de una bandeja de reactivo limpio.
   3. La diapositiva del biochip se aplican a la bandeja de reactivo cargada con anticuerpo secundario. Incubar durante 30 min a TA.
4. Montaje
   1. Derramar el tampón de lavado usado y añadir 100 mL de tampón de lavado fresco en el vaso. Repita el lavado como se describe en los pasos 2.2.4 y 2.2.5.
   2. Cuidadosamente añadir medio de inclusión a los campos de reacción en una diapositiva de biochip (una gota por campo de reacción). Sello de la diapositiva del biochip con una pieza de vidrio de cubierta. Evitar las burbujas de aire.
5. Detección de fluorescencia
   1. Encender la lámpara fluorescente del microscopio y precalentamiento para elegir un filtro nm 488 a 15 minutos.
   2. Software de fotografía abierta. Tomar fotografías de zonas transfected y untransfected de todos los campos de reacción con diferentes aumentos. Primero, tome una foto con 4 aumentos para tener una visión general, luego tomar más fotografías con x 10 y 20 aumentos x.
      Nota: El protocolo detallado se muestra en la tabla 1. Interpretación de los resultados se discute en la sección de resultados representativos.

3. diagnóstico de los pacientes

1. Si el paciente es el suero anti-AQP4 IgG positivo y muestra al menos una característica clínica central de NMOSD (véase la sección discusión), diagnosticar al paciente con NMSOD⁵. Sin embargo, si el paciente es anti-AQP4 IgG negativo, una diagnosis de NMOSD puede no ser excluido.

Resultados

Utilizando el procedimiento descrito aquí, IgG específica anti-AQP4 en suero es detectable. Durante el procedimiento, las muestras, un control positivo y control negativo fueron agregados a los campos de reacción, que contienen áreas transfected y untransfected (figura 2). Fluorescencia del control negativo en un área de transfected indica principalmente la Unión inespecífica del anticuerpo secundario a las células transfected en biochips (

Discusión

Hemos descrito un método ampliamente accesible para la detección de IgG anti-AQP4 en suero humano. IgG anti-AQP4 se relaciona estrechamente con NMOSD y establecer un método de detección de IgG anti-AQP4 confiable es crucial para el diagnóstico clínico de NMOSD. En primer lugar, la IgG anti-AQP4 es específico para NMOSD. Esclerosis múltiple es una enfermedad mediada inmune del sistema nervioso central y comparte muchas similitudes con NMOSD¹². Sin embargo, IgG anti-AQP4 es sólo positiva en...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-aquaporin-4 IIFT	Euroimmun	FA 1128-2005-50	Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.
CellSens Dimension	OLYMPUS	N/A	photograph software
Gel & clot activator tube	Improve medical	623040202	From a local Chinese company