Détection d’immunoglobuline Anti-aquaporin-4 G de sérum humain par Cell-based Assay

Résumé

Essai sur les cellules est une méthode largement utilisée pour détecter les immunoglobulines de sérum anti-aquaporin-4 G. Cette méthode pourrait être appliquée au diagnostic clinique et les recherches scientifiques de neuromyélite optique spectre troubles.

Résumé

Anti-aquaporin-4 (AQP4), immunoglobuline G (IgG) est le biomarqueur diagnostique de noyau pour les troubles du spectre de neuromyélite optique (NMOSD). L’essai sur les cellules (ABC) est une méthode largement utilisée pour détecter des IgG anti-AQP4 dans le sérum humain avec une spécificité et une sensibilité élevée. En bref, sériques IgG anti-AQP4 est capté par les cellules transfectées AQP4 qui sont fixé sur la biopuce alors détectée par un anticorps secondaire marqué à la fluorescéine. La microscopie de fluorescence est utilisée pour visualiser la fluorescence, et l’intensité de la fluorescence est évaluée au moins deux des cliniciens expérimentés. Un diagnostic définitif de NMOSD peut être pris en fonction sur la combinaison des résultats de détection IgG anti-AQP4, manifestations cliniques et neuroradiologiques conclusions. Selon des études antérieures, ABC est plus sensible et plus spécifique que les autres méthodes de détection des IgG anti-AQP4, et il peut être appliqué à la fois le diagnostic clinique et les études de NMOSD. La méthode a des limites ; par exemple, il manque encore l’échelle internationale pour évaluer les titres d’IgG sériques anti-AQP4. Ici, un protocole détaillé pour la détection de IgG anti-AQP4 sérum humain à l’aide d’ABC est décrite.

Introduction

Sérum AQP4 IgG est un biomarqueur diagnostique de noyau pour neuromyélite optique du spectre des troubles (NMOSD)¹. L’essai sur les cellules (ABC) est une méthode de détection des IgG anti-AQP4 largement utilisé avec grande sensibilité et spécificité. Ici, un protocole détaillé pour ABC est introduit.

AQP4, une protéine de canal de l’eau, doté de six modules transmembranaire et deux domaines hélicoïdes entourant une solution aqueuse de pores². IgG anti-AQP4 est impliqué dans la pathogénie de le NMOSD par la liaison à la cible AQP4, qui se trouve principalement sur l’endfeet des astrocytes³. Il a été démontré que les IgG anti-AQP4 est positif dans environ deux tiers des patients NMOSD⁴. Les plus récents critères diagnostiques internationaux pour NMOSD, IgG anti-AQP4 est réputé être un biomarqueur diagnostique de base⁵. À cet égard, il est crucial d’établir un protocole fiable pour détecter le sérum humain IgG anti-AQP4 et faciliter le diagnostic clinique des NMOSD.

Actuellement, les diverses méthodes de détection d’IgG anti-AQP4 sont disponibles, comme ABC, dosage à base de tissus, immuno enzymatique et l’écoulement cytometry^6,7. CBA emploie EU90 cellules, qui sont transfectées avec des AQP4 humaines, pour capturer des IgG anti-AQP4. Les IgG anti-AQP4 capturé est détectée par des anticorps secondaires fluorescents et visualisée par la suite par microscopie. Accumuler des preuves a montré que l’ABC est plus sensible et plus spécifique que les autres de^6,méthodes détection IgG anti-AQP4⁷. Selon une méta-analyse, la sensibilité et la spécificité d’ABC se sont avérés être de 76 % et 99 %, qui étaient plus élevés que sur tissus et enzyme-linked immunosorbent assays⁶. En outre, une comparaison multicentrique des épreuves diagnostiques d’IgG anti-AQP4 a été menée⁷. Un total de 193 étude sujets de 15 centres de diagnostic européens étaient inscrits⁷. Quatre méthodes différentes ont été utilisées pour détecter le sérum anti-AQP4 IgG⁷. Il a été démontré que l’ABC était plus sensible et plus spécifique que les autres méthodes⁷. AQP4 est placée comme deux isoformes majeurs (M1-AQP4 et AQP4-M23), anti-AQP4 IgG capture cellulaire est transfecté avec AQP4-M1 ou AQP4-M23. Toutefois, quel type de cellule de capture est mieux reste controversée. Une enquête a soutenu AQP4-M1 selon ABC⁸, tandis que d’autres ont indiqué que AQP4-M23 base ABC est mieux^7,9,10. Toutefois, ABC AQP4-M23-basé peut donner des résultats faussement positifs en raison de liaison non-spécifique IgG⁸. . De Jaïre et al. ¹¹ a signalé qu’il n’y avait aucune différence significative dans les taux de détection des IgG anti-AQP4 entre AQP4 M1 et de la base de AQP4-M23 SABC.

En résumé, sérum anti-AQP4 IgG est un biomarqueur de base pour NMOSD. ABC a plus de spécificité et de sensibilité que les autres méthodes de détection des IgG anti-AQP4. Il demeure controversée s’AQP4-M1 AQP4 M23-base ou ABC est préférable. Dans cet article, un protocole détaillé pour ABC AQP4-M1-basée est décrite, qui peut s’appliquer au diagnostic clinique et d’études de NMOSD.

Protocole

Cette procédure a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Université de premier hôpital de la province du Jilin et s’est déroulée sur environ 1 500 sujets.

1. patient Enrollment et prélèvement d’échantillons de sang

1. Appliquer le laboratoire de détection du sérum Qu'igg anti-AQP4 pour les patients de la clinique avec les plaintes en chef et les symptômes énuméré ci-dessous. Effectuer les examens physiques aussi bien.
   
   Névrite optique : les Patients souffrent de déficits visuels, tels que la perte du champ visuel et la réduction de l’acuité visuelle.
   Myélite aiguë : les Patients peuvent présenter des déficits sensoriels, paralysie et dysfonctionnement autonomique.
   Syndrome de postrema de secteur : les Patients peuvent avoir des symptômes de hoquet inexpliquée, des nausées ou vomissements.
   Syndrome de tronc cérébral aigu : lésions du tronc cérébral peuvent entraîner différents symptômes et signes physiques selon la localisation des lésions.
   Narcolepsie symptomatique ou syndrome clinique diencéphale aigu avec des lésions de MRI diencéphale NMOSD-typiques.
   Syndrome cérébral symptomatique avec des lésions cérébrales NMOSD-typique.
   
   Remarque : Selon les critères diagnostiques du consensus international pour NMOSD⁵, un diagnostic de NMOSD peut être fait si le patient est sérum anti-AQP4 IgG positif et a au moins une des caractéristiques cliniques fondamentales mentionnées ci-dessus. Cependant, nous ne recommandons pas les tests d’IgG anti-AQP4 chez les patients avec une névrite optique uniquement.
2. Prélèvement d’échantillons de sang
   Remarque : les Patients ne doivent pas être jeûne.
   1. Dessiner 2-3 mL de sang veineux dans un tube de prélèvement sanguin sous vide 4 mL.
   2. Laisser le sérum à coaguler pendant 30 min à température ambiante (RT).
      Remarque : Coagulation prolongé peut augmenter les niveaux de sérum due à une fuite des plaquettes.
   3. Centrifuger à 2100 x g pendant 5 min. transvaser avec soin le sérum dans un nouveau tube.
   4. Analyser le sérum immédiatement ou la partie aliquote et conserver à -20 ou -80 ° C.
      Remarque : Stockage à-20 ° C est pour le stockage des mois, tandis que-80 ° C est pour le stockage des années.

2. détection des anticorps anti-AQP4

Mise en garde : Échantillons de patients et des réactifs utilisés doivent envisager des matières infectieuses. Réactifs contenant de l’azide de sodium dans le kit sont toxiques. Un diagramme du protocole est fourni à la Figure 1.

1. Préparation
   1. Faire le kit RT avant utilisation.
      NOTE : Conserver le kit 2-8 ° c.
   2. Préparer au moins 200 mL de tampon de lavage PBS contenant 0,2 % Tween 20. Verser 100 mL de tampon de lavage dans un bécher de 500 mL.
   3. Diluer le sérum échantillons x 10 avec tampon de lavage. Préparer des témoins positifs et négatifs selon les instructions du distributeur.
2. Incubation de l’échantillon
   1. Ajouter 30 µL des échantillons préalablement dilués, témoin positif ou contrôle négatif dans les champs de la réaction du bac à réactif (Figure 2).
      Remarque : Éviter les bulles d’air.
   2. Retirez le capot de protection sur les diapositives de la biopuce.
      Remarque : Ne pas toucher les biopuces pour éviter le détachement et la contamination des cellules fixes. Tenir la lame-by-side avant de retirer le couvercle.
   3. S’applique à la diapositive biopuce à la barre d’état réactif (Figure 2). Commencer une période d’incubation de 30 min à température ambiante.
      Remarque : Chaque échantillon doit être une gouttelette individuel relié à la biopuce correspondante sans mélange avec d’autres gouttelettes.
   4. Rincer doucement la lame biopuce une fois avec le tampon de lavage. Plonger la lame de biopuces dans le bécher de 500 mL, rempli de 100 mL de tampon de lavage pendant au moins 5 min Place le bécher sur un agitateur si possible.
   5. Retirez la lame de biopuces de la mémoire tampon de lavage. Soigneusement essuyer le tampon de lavage résiduelle à l’extérieur les champs de réaction avec du papier absorbant. Exposer la diapositive biopuce à l’air libre pendant 1-2 min évaporer le tampon de lavage résiduelle sur la zone réactive.
      Remarque : Ne pas sécher les champs de la réaction. Ne pas toucher les biopuces avec du papier essuie-tout.
3. Incubation de l’anticorps secondaire
   1. Préparer la solution d’anticorps secondaire conformément aux instructions du distributeur.
   2. Ajouter 25 µL d’immunofluorescence secondaire vers les champs de la réaction d’un plateau propre.
   3. S’applique à la diapositive de biopuces pour le bac à réactif chargé avec l’anticorps secondaire. Incuber 30 min à température ambiante.
4. Montage
   1. Versez le tampon de lavage, ajouter 100 mL de tampon de lavage fraîche dans le bol. Répéter le lavage comme décrit aux points 2.2.4 et 2.2.5.
   2. Ajouter avec précaution le milieu d’inclusion aux champs réaction sur une lame de biopuces (un pour chaque zone réactive). Sceller la diapositive biopuce avec un morceau de la lamelle couvre-objet. Éviter les bulles d’air.
5. Détection par fluorescence
   1. Allumez la lampe fluorescente de microscope et préchauffer pendant 15 min. choisir un filtre à 488 nm.
   2. Logiciel de photographie ouvert. Prendre des photos de régions transfectées et celllulaire de tous les champs de la réaction avec des grossissements différents. Tout d’abord, prenez une photo avec un grossissement de x 4 pour un aperçu, puis prendre des photos plus avec 10 x et 20 x grossissements.
      Remarque : Le protocole détaillé est indiqué dans le tableau 1. Interprétation des résultats est discutée dans la section résultats représentatifs.

3. le diagnostic des Patients

1. Si le patient est sérum anti-AQP4 IgG positif et montre au moins une caractéristique clinique de noyau de NMOSD (voir la section « discussion »), diagnostiquer les patients atteints de NMSOD⁵. Toutefois, si le patient est anti-AQP4 IgG négatif, un diagnostic de NMOSD ne peut pas être exclu.

Résultats

En utilisant la procédure décrite ici, IgG spécifiques anti-AQP4 dans le sérum est détectable. Au cours de la procédure, les échantillons préalablement dilués, un témoin positif et un témoin négatif ont été ajoutés aux champs de réaction, qui contiennent des zones transfectées et celllulaire (Figure 2). Fluorescence du contrôle négatif dans une zone transfectée indiqué principalement la liaison non spécifique de l’anticorps secondaire ...

Discussion

Nous avons décrit une méthode largement accessible pour détecter les IgG anti-AQP4 dans le sérum humain. IgG anti-AQP4 est étroitement lié au NMOSD, et établir une méthode de détection des IgG anti-AQP4 fiable est essentiel pour le diagnostic clinique de NMOSD. Tout d’abord, les IgG anti-AQP4 est spécifique pour NMOSD. Sclérose en plaques est également une maladie auto-immune du système nerveux central et partage de nombreuses similitudes avec NMOSD¹². Cependant, les IgG anti-AQP4 n...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-aquaporin-4 IIFT	Euroimmun	FA 1128-2005-50	Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.
CellSens Dimension	OLYMPUS	N/A	photograph software
Gel & clot activator tube	Improve medical	623040202	From a local Chinese company