Rilevamento di immunoglobulina Anti-acquaporina-4 G di siero umano dall'analisi Cell-based

Riepilogo

Test basati su celle è un metodo ampiamente utilizzato per rilevare l'immunoglobulina del siero anti-acquaporina-4 G. Questo metodo potrebbe essere applicato a diagnosi clinica e ricerche scientifiche di neuromielite ottica dello spettro autistico.

Abstract

Anti-acquaporina-4 (AQP4) dell'immunoglobulina G (IgG) è il biomarcatore diagnostico di nucleo per disordini di spettro di optica di neuromyelitis (NMOSD). L'analisi basata sulle celle (CBA) è un metodo ampiamente usato per rilevare anti-AQP4 IgG nel siero umano con alta sensibilità e specificità. Brevemente, siero anti-AQP4 IgG è catturato dai cellule trasfettate con AQP4 che sono fissata sul biochip poi rilevata da un anticorpo secondario marcato con fluoresceina. Microscopia di fluorescenza è utilizzata per visualizzare la fluorescenza e l'intensità di fluorescenza viene valutato da almeno due esperti clinici. Una diagnosi finale di NMOSD può essere fatta basata sulla combinazione di risultati di rilevamento di IgG anti-AQP4, manifestazioni cliniche e risultati neuroradiological. Secondo studi precedenti, CBA è più sensibile e specifico rispetto ad altri metodi di rilevamento di IgG anti-AQP4 e può essere applicato alla diagnosi clinica e di studi di NMOSD. Il metodo presenta limitazioni; ad esempio, la scala internazionale per valutare i titoli di IgG del siero anti-AQP4 è ancora carente. Qui, un protocollo dettagliato per il rilevamento di IgG anti-AQP4 siero umano utilizzando CBA è descritto.

Introduzione

Siero AQP4 IgG è un biomarcatore diagnostico di nucleo per neuromielite optica spettro disturbi (NMOSD)¹. L'analisi basata sulle celle (CBA) è un metodo di rilevamento di IgG anti-AQP4 ampiamente usato con alta sensibilità e specificità. Qui, è stato introdotto un protocollo dettagliato per CBA.

AQP4, una proteina di canale di acqua, ha sei unità dimisurazione e due domini elicoidale che circonda uno acquosa²del poro. IgG anti-AQP4 è coinvolto nella patogenesi della NMOSD tramite l'associazione alla relativa destinazione AQP4, che si trova principalmente su endfeet di astrociti³. Esso ha dimostrato che le IgG anti-AQP4 è positivo in circa due terzi di NMOSD pazienti⁴. Nei più recenti criteri diagnostici internazionali per NMOSD, IgG anti-AQP4 è considerato essere un biomarcatore diagnostico core⁵. A questo proposito, è fondamentale stabilire un protocollo affidabile per rilevare siero umano IgG anti-AQP4 e facilitare la diagnosi clinica di NMOSD.

Attualmente, diversi metodi di rilevamento di IgG anti-AQP4 sono disponibili, come CBA, analisi tissutali, analisi enzima-collegata dell'immunosorbente e flusso cytometry^6,7. CBA impiega celle EU90, che transfected con AQP4 umana, per catturare le IgG anti-AQP4. Le IgG anti-AQP4 catturato viene rilevata da fluorescenti anticorpi secondari e successivamente visualizzate da microscopia. Raccogliendo la prova ha dimostrato che CBA è più sensibile e specifico rispetto altri anti-AQP4 IgG rilevamento metodi^6,7. Secondo una meta-analisi, la sensibilità e la specificità del CBA sono stati indicati per essere 76% e 99%, che erano superiori di tissutali e⁶di analisi enzima-collegata dell'immunosorbente. Inoltre, un confronto multicentrico di saggi diagnostici di IgG anti-AQP4 era condotto⁷. Un totale di 193 Studio soggetti da 15 centri diagnostici europei sono stati arruolati⁷. Quattro diversi metodi sono stati utilizzati per rilevare siero anti-AQP4 IgG⁷. È stato dimostrato che la CBA era più sensibile e specifico rispetto gli altri metodi⁷. AQP4 è espressa come due isoforme principali (AQP4-M1 e AQP4-M23), delle cellule di cattura di IgG anti-AQP4 sono trasfettate con AQP4-M1 o AQP4-M23. Tuttavia, quale tipo di cella di cattura è migliore rimane discutibile. Una ricerca ha sostenuto AQP4-M1 basata CBA⁸, mentre altri hanno indicato che l'AQP4-M23 basato CBA è meglio^7,9,10. Tuttavia, basati su AQP4-M23 CBA può dare risultati falsamente positivi a causa di non specifico IgG associazione⁸. Jarius et al.. ¹¹ ha riferito che non c'era differenza significativa nei tassi di rilevamento di IgG anti-AQP4 tra AQP4-M1 ed eventuali CBA AQP4-M23-basato.

In sintesi, siero anti-AQP4 IgG è un biomarcatore di nucleo per NMOSD. CBA ha maggiore specificità e sensibilità rispetto ad altri metodi di rilevamento di IgG anti-AQP4. Rimane controverso se AQP4-M1 AQP4 M23-basato o CBA è meglio. In questo articolo, è descritto un protocollo dettagliato per CBA AQP4-M1-base, che può essere applicato a diagnosi clinica e studi di NMOSD.

Protocollo

Questa procedura è stata approvata dal comitato etico dell'Università ospedale prima di Jilin ed è stata effettuata su circa 1.500 soggetti.

1. paziente iscrizione e raccolta campioni ematici

1. Applicare il rilevamento in laboratorio del siero di che IgG anti-AQP4 ai pazienti della clinica con i reclami principali ed i sintomi elencati di seguito. Eseguire esami fisici pure.
   
   Neurite ottica: pazienti soffrono di deficit visivi, come la perdita del campo visivo e riduzione dell'acuità visiva.
   Mielite acuta: i pazienti possono presentare con paralisi, deficit sensoriali e disfunzione autonomica.
   Sindrome di area postrema: i pazienti possono avere sintomi di inspiegabile singhiozzo, nausea o vomito.
   Sindrome acuta del tronco cerebrale: lesioni del tronco cerebrale potrebbero causare diversi sintomi e segni fisici a seconda della posizione delle lesioni.
   Narcolessia sintomatica o acuta Sindrome diencefalica clinica con le lesioni diencephalic NMOSD-tipici di MRI.
   Sindrome cerebrale sintomatica con le lesioni di cervello NMOSD-tipiche.
   
   Nota: Secondo i criteri diagnostici di un consenso internazionale per NMOSD⁵, una diagnosi di NMOSD può essere fatta se il paziente è siero anti-AQP4 IgG-positivo e ha almeno una delle caratteristiche cliniche principali di cui sopra. Tuttavia, si sconsiglia di test di IgG anti-AQP4 in pazienti con la neurite ottica solo.
2. Raccolta campioni ematici
   Nota: pazienti non è necessario essere a digiuno.
   1. Disegnare 2-3 mL di sangue venoso in un tubo di raccolta sangue vuoto 4 mL.
   2. Consentire il siero coagulare per 30 min a temperatura ambiente (TA).
      Nota: Coagulazione prolungato può aumentare i livelli del siero a causa di perdite dalle piastrine.
   3. Centrifuga a 2100 x g per 5 min, trasferire con cautela il siero ad un nuovo tubo.
   4. Analizzare il siero immediatamente o aliquotare e conservare a -20 o -80 ° C.
      Nota: Conservazione a-20 ° C è per l'archiviazione dei mesi, mentre è di-80 ° C per lo stoccaggio di anni.

2. anti-AQP4 rilevazione dell'anticorpo

Attenzione: Campioni e reagenti di kit usato dovrebbero essere considerati materiale infettivo. Sodio azide-contenente i reagenti sono tossici. Un diagramma di flusso del protocollo è fornito nella Figura 1.

1. Preparazione
   1. Portare il kit a RT prima dell'uso.
      Nota: Conservare il kit a 2-8 ° C.
   2. Preparare almeno 200 mL di tampone di lavaggio PBS contenente 0,2% Tween 20. Versare 100 mL di tampone di lavaggio in un becher da mL 500.
   3. Diluire il siero campioni 10x con tampone di lavaggio. Preparare i controlli positivi e negativi secondo le istruzioni del distributore.
2. Incubazione del campione
   1. Aggiungere 30 µ l di campioni pre-diluiti, controllo positivo o controllo negativo per i campi di reazione del vassoio reagente (Figura 2).
      Nota: Evitare le bolle d'aria.
   2. Rimuovere il coperchio di protezione sulle diapositive biochip.
      Nota: Non toccare il biochip per evitare il distacco e la contaminazione delle cellule fisse. Tenere la diapositiva side-by-side prima di rimuovere il coperchio.
   3. Applicare la diapositiva di biochip al vassoio del reagente (Figura 2). Avviare un'incubazione di 30 minuti a TA.
      Nota: Ogni campione deve essere una gocciolina individuo collegata al biochip corrispondente senza miscelazione con altre goccioline.
   4. Sciacquare delicatamente il vetrino di biochip una volta con tampone di lavaggio. Immergere il vetrino di biochip nel bicchiere graduato 500 mL riempita con 100 mL di tampone di lavaggio per almeno 5 min posto il becher su un agitatore se possibile.
   5. Prendere lo scivolo di biochip dal tampone di lavaggio. Accuratamente pulire il tampone di lavaggio residuo fuori i campi di reazione con un tovagliolo di carta. Esporre la diapositiva di biochip aria aperta per 1-2 min per far evaporare il tampone di lavaggio residua sul campo di reazione.
      Nota: Non asciugare i campi di reazione. Non toccare il biochip con tovagliolo di carta.
3. Incubazione dell'anticorpo secondario
   1. Preparare la soluzione di anticorpo secondario secondo le istruzioni del distributore.
   2. Aggiungere 25 µ l di anticorpo secondario fluorescente ai campi della reazione di un vassoio di reagente pulito.
   3. Applicare la diapositiva di biochip per vassoio reagente caricato con anticorpo secondario. Incubare per 30 minuti a TA.
4. Montaggio
   1. Versare il tampone di lavaggio usate e aggiungere 100 mL di tampone di lavaggio fresco nel bicchiere graduato. Ripetere il lavaggio come descritto ai punti 2.2.4 e 2.2.5.
   2. Aggiungere con cautela il mezzo di inclusione per i campi di reazione in una diapositiva di biochip (una goccia per ogni campo di reazione). Sigillare la diapositiva di biochip con un pezzo di vetro di copertura. Evitare le bolle d'aria.
5. Rilevazione della fluorescenza
   1. Accendere la lampada fluorescente di microscopio e pre-riscaldare per 15 min. Scegli filtro a 488 nm.
   2. Software di fotografia aperto. Scattare foto da trasfettate e untransfected di tutti i campi di reazione con ingrandimenti differenti. In primo luogo, prendere una foto con ingrandimento 4x per una panoramica, poi scattare altre foto con 10 x e 20 x ingrandimenti.
      Nota: Il protocollo dettagliato è mostrato nella tabella 1. Interpretazione dei risultati è discussa nella sezione risultati rappresentativi.

3. diagnosi dei pazienti

1. Se il paziente è siero anti-AQP4 IgG-positivo e mostra almeno una caratteristica clinica di nucleo di NMOSD (Vedi sezione discussione), diagnosticare il paziente con NMSOD⁵. Tuttavia, se il paziente è anti-AQP4 IgG negativo, una diagnosi di NMOSD non può essere esclusa.

Risultati

Utilizzando la procedura descritta qui, IgG specifiche anti-AQP4 nel siero è rilevabile. Durante la procedura, campioni pre-diluiti, un controllo positivo e un controllo negativo sono state aggiunte per i campi di reazione, che contengono aree trasfettate e untransfected (Figura 2). Fluorescenza del controllo negativo in una zona trasfettata principalmente indicato il legame non specifico dell'anticorpo secondario alle cellule trasfettate il biochip (

Discussione

Abbiamo descritto un metodo ampiamente accessibile per rilevare anti-AQP4 IgG nel siero umano. IgG anti-AQP4 è strettamente correlata alla NMOSD, e stabilire un metodo di rilevamento di IgG anti-AQP4 affidabile è fondamentale per la diagnosi clinica di NMOSD. In primo luogo, IgG anti-AQP4 è specifico per NMOSD. La sclerosi multipla è una malattia immune-mediata del sistema nervoso centrale e condivide molte somiglianze con NMOSD¹². Tuttavia, IgG anti-AQP4 è solo positivo in NMOSD

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-aquaporin-4 IIFT	Euroimmun	FA 1128-2005-50	Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.
CellSens Dimension	OLYMPUS	N/A	photograph software
Gel & clot activator tube	Improve medical	623040202	From a local Chinese company