זיהוי נוגדן Anti-aquaporin-4 G בנסיוב אדם על ידי Assay מבוססת-תא

Summary

Assay מבוססת תא היא שיטה בשימוש נרחב כדי לזהות סרום אנטי-aquaporin-4 אימונוגלובולין G... יכול להיות מיושם בשיטה זו אבחנה קלינית, מחקרים מדעיים של הפרעות ספקטרום אופטי neuromyelitis.

Abstract

נוגדן אנטי-aquaporin-4 (AQP4) G (IgG) הוא סמן אבחון הליבה עבור הפרעות הספקטרום אופטיקה neuromyelitis (NMOSD). הבדיקה מבוססת-תא (כקבוצת) היא שיטה בשימוש נרחב כדי לזהות anti-AQP4 IgG בסרום אדם עם רגישות גבוהה. בקצרה, סרום אנטי-AQP4 IgG הוא נלכד על ידי תא AQP4 transfected נעוצות על ביו-שבב אז זוהה על ידי נוגדנים משניים מתויג fluorescein. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ הוא מנוצל כדי להמחיש את פלורסצנטיות, עוצמת קרינה פלואורסצנטית מוערך על-ידי קלינאים מנוסים לפחות שני. אבחנה סופית של NMOSD יכול להתבצע מבוסס על השילוב של אנטי-AQP4 IgG תוצאות איתור, הביטויים הקליניים ואת הממצאים neuroradiological. על פי מחקרים קודמים, כקבוצת הוא רגיש יותר ספציפית יותר שיטות זיהוי IgG אחרות אנטי-AQP4, ניתן להחיל אותה אבחנה קלינית והן מחקרים של NMOSD. השיטה יש מגבלות; לדוגמה, עדיין מידה בינלאומי כדי להעריך סרום אנטי-AQP4 IgG titers לוקה בחסר. . הנה, פרוטוקול מפורט לגילוי בנסיוב אדם אנטי-AQP4 IgG באמצעות כקבוצת מתואר.

Introduction

אג AQP4 סרום הוא סמן אבחון הליבה עבור neuromyelitis אופטיקה ספקטרום הפרעות (NMOSD)¹. וזמינותו מבוססת-תא (כקבוצת) היא שיטה לזיהוי IgG נגד שימוש נרחב-AQP4 עם רגישות גבוהה. . הנה, עבור כקבוצת פרוטוקול מפורט הוא הציג.

AQP4, חלבון ערוץ מים, יש שש יחידות משתרע על-פני קרום ונקבוביות שני תחומים לוליינית סביב אחד מימית². Anti-AQP4 אג מעורב בפתוגנזה של NMOSD באמצעות קשירה המטרה שלו, AQP4, הנמצא בעיקר על endfeet של האסטרוציטים³. הוכח כי אנטי-AQP4 IgG הוא חיובי כ שני שלישים של חולים NMOSD⁴. האחרונה הבינלאומי הקריטריונים לאבחון NMOSD, אנטי-AQP4 IgG נחשב להיות סמן אבחון הליבה⁵. בהקשר זה, חשוב מאוד ליצור פרוטוקול אמין כדי לזהות בנסיוב אדם אנטי-AQP4 IgG וכדי להקל על אבחנה קלינית של NMOSD.

כיום, שיטות שונות של זיהוי IgG anti-AQP4 הינם זמינים, כגון כקבוצת, המבוסס על רקמות assay, מקושרים-אנזים immunosorbent assay לזרום cytometry^6,7. כקבוצת מעסיקה EU90 תאים, אשר הם transfected עם AQP4 האנושי, כדי ללכוד אנטי-AQP4 IgG. IgG שנתפסו anti-AQP4 זוהה על ידי נוגדנים משניים פלורסנט, לאחר מכן דמיינו ידי מיקרוסקופ. לצבירת ראיות הראו כי כקבוצת הוא רגיש וספציפי יותר מאשר אחרים אנטי-AQP4 IgG זיהוי שיטות^6,7. על פי מטא אנליזה, רגישות וסגוליות של כקבוצת הוכחו להיות 76% ו- 99%, אשר היו גבוהים יותר מאשר מבוסס-רקמות, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent⁶. יתר על כן, השוואה multicenter של מבחני אבחון של אנטי-AQP4 IgG היה מתנהל⁷. סך של 193 לימוד הנושאים מ 15 מרכזי אבחון אירופה היו נרשם⁷. ארבע שיטות שונות נוצלו לזהות סרום אנטי-AQP4 IgG⁷. הוכח כי כקבוצת היה רגיש וספציפי יותר מאשר אחרים שיטות⁷. כפי AQP4 מבוטאת שני איזופורמים הגדולות (AQP4-M1 ו- AQP4-M23), אנטי-AQP4 IgG ללכוד תא transfected עם AQP4-M1 או AQP4-M23. אולם, איזה סוג של תא לכידה היא במחלוקת יותר שרידים. חקירה אחד תמך AQP4-M1 מבוסס כקבוצת⁸, בעוד אחרים הראו כי AQP4-M23 מבוסס כקבוצת הוא^7,טוב יותר^9,10. עם זאת, AQP4-M23 מבוססי כקבוצת תניב תוצאות חיוביות כוזבות עקב IgG לא ספציפי האיגוד⁸. Jarius ואח. ¹¹ דיווחו כי היה הבדל משמעותי בשיעורי זיהוי IgG anti-AQP4 בין AQP4-M1 ו- CBAs AQP4-M23 מבוססי.

בסיכום, סרום אנטי-AQP4 IgG הוא סמן הליבה עבור NMOSD. כקבוצת יש ירידה לפרטים ורגישות גבוהה יותר מאשר שיטות זיהוי IgG אחרות אנטי-AQP4. זה נשאר שנוי במחלוקת אם AQP4-M1 או AQP4-M23-מבוסס - כקבוצת עדיף. במאמר זה, עבור כקבוצת AQP4-M1 מבוססי פרוטוקול מפורט מתואר, אשר ניתן להחיל על אבחנה קלינית ולימודים של NMOSD.

Protocol

פרוצדורה זו אושרה על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת בית החולים הראשון של ג'ילין ובוצע על נושאים כ-1,500.

1. החולה הרשמה ואוסף דגימת דם

1. להחיל את הגילוי מעבדה של סרום שאנטי-AQP4 IgG לחולים clinic עם צ'יף תלונות ותסמינים המפורטים להלן. לבצע בדיקות גופניות כמו גם.
   
   לדלקת בעצה הראייה: חולים סובלים עם גירעונות חזותיים, כגון אובדן של שדות חזותיים וצמצום של חדות הראייה.
   דלקת חוט השדרה חריפה: חולים יכול להציג עם שיתוק, גירעונות החושים חוסר תפקוד אוטונומי.
   תסמונת postrema אזור: חולים ייתכן הסימפטומים של שיהוקים בלתי מוסברים, בחילות או הקאות.
   תסמונת גזע המוח חריפה: נגעים גזע המוח עלול לגרום תסמינים שונים וסימנים פיזית בהתאם למיקום של נגעים.
   Narcolepsy סימפטומטי או תסמונת קלינית diencephalic חריפה עם נגעים MRI diencephalic NMOSD טיפוסי.
   תסמונת מוחית סימפטומטי עם נגעים במוח NMOSD טיפוסי.
   
   הערה: על-פי הקריטריונים לאבחון קונצנזוס בינלאומי עבור NMOSD⁵, אבחנה של NMOSD יכול להתבצע אם המטופל סרום אנטי-AQP4 IgG חיובי ויש לפחות אחד מהמאפיינים הקליניים הליבה שהוזכרו לעיל. עם זאת, לא מומלץ בדיקה של אנטי-AQP4 IgG בחולים עם לדלקת בעצה הראייה בלבד.
2. איסוף דגימת דם
   הערה: חולים אין צורך להיות בצום.
   1. לצייר 2-3 מ"ל של דם ורידי בשפופרת איסוף דם ואקום 4 מ"ל.
   2. לאפשר את הנסיוב להיקרש למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
      הערה: קרישת ממושך יכול להגביר רמות בסרום עקב דליפה של טסיות דם.
   3. צנטריפוגה ב 2100 x g עבור 5 דק להעביר בזהירות את הנסיוב צינור חדש.
   4. לנתח את הנסיוב מיד או aliquot ולאחסן ב-20 או-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: אחסון ב-20 ° C נמצא עבור אחסון של חודשים, בעוד-80 ° C הוא עבור אחסון של שנים.

2. זיהוי נוגדנים anti-AQP4

התראה: ערכת בשימוש ריאגנטים ודוגמאות החולה צריך להיחשב חומרים זיהומיות. ריאגנטים המכילות אזיד הנתרן בערכה רעילים. תרשים זרימה של הפרוטוקול מסופק באיור1.

1. הכנה
   1. להביא את הקיט RT לפני השימוש.
      הערה: אחסן את הקיט ב 2-8 ° c
   2. להכין לפחות 200 מ של PBS שטיפת מאגר המכיל 0.2% Tween 20. שופכים 100 מ של שטיפת מאגר לתוך גביע 500 מ"ל.
   3. שתדללו הנסיוב דגימות x 10 עם שטיפת מאגר. הכינו את הפקדים חיוביים ושליליים על פי ההוראות של המפיץ.
2. לדוגמה דגירה
   1. להוסיף 30 µL של דגימות מראש מדולל, בקרה חיובית או שלילית שליטה שדות תגובה של המגש ריאגנט (איור 2).
      הערה: להימנע בועות אוויר.
   2. הסר את מכסה מגן בשקופיות ביו-שבב.
      הערה: אל תגעו את biochips כדי למנוע את הניתוק וזיהום של תאים קבוע. החזק את השקופית side-by-side לפני הסרת המכסה.
   3. להחיל את השקופית ביו-שבב על המגש ריאגנט (איור 2). מתחיל אינקובציה של 30 דקות ב- RT.
      הערה: כל המדגם צריך להיות droplet בודדים מחובר ביו-שבב התואם ללא ערבוב עם טיפות אחרות.
   4. לשטוף בעדינות את השקופית ביו-שבב פעם אחת עם מאגר לשטוף. לטבול את השקופית ביו-שבב לתוך 500 מ"ל. הספל מלא עם 100 מ של שטיפת המאגר עבור פחות 5 דק. המקום הספל על מטרף במידת האפשר.
   5. להוציא את השקופית ביו-שבב מתוך המאגר לשטוף. בזהירות לנגב המאגר לשארי שטיפת מחוץ השדות התגובה עם מגבת נייר. לחשוף את השקופית ביו-שבב באוויר הפתוח למשך 1-2 דקות מתמוססות המאגר לשארי שטיפת על המגרש התגובה.
      הערה: לא לייבש את השדות התגובה. אל תגעו biochips על מגבת נייר.
3. נוגדנים משניים דגירה
   1. להכין את הפתרון נוגדן משני לפי ההוראות של המפיץ.
   2. להוסיף 25 µL של פלורסנט נוגדן משני השדות התגובה של מגש ריאגנט נקי.
   3. השקופית ביו-שבב חלות על המגש ריאגנט נטען עם נוגדנים משניים. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
4. הרכבה
   1. שופכים המאגר שטיפת בשימוש, להוסיף 100 מ של מאגר טריים לשטוף הספל. לחזור על השטיפה כפי שתואר בשלבים 2.2.4 ו 2.2.5.
   2. להוסיף בזהירות בינוני ההטבעה השדות התגובה בשקופית ביו-שבב (טיפה אחת לכל שדה התגובה). חותם את השקופית ביו-שבב עם חתיכה אחת של כיסוי זכוכית. להימנע בועות אוויר.
5. זיהוי קרינה פלואורסצנטית
   1. הפעל את נורה פלואורסצנטית של מיקרוסקופ וחום מראש עבור 15 דק ' בחירה ' 488 ננומטר מסנן.
   2. תוכנת הצילום פתוח. צלם תמונות מאזורים transfected והן untransfected של כל השדות התגובה עם רמות הגדלה שונות. ראשית, תמונה אחת עם 4 x הגדלה לקבלת סקירה ולאחר מכן לצלם תמונות נוספות עם 10 x ו- 20 x הגדלה.
      הערה: פרוטוקול מפורט מוצג בטבלה 1. פרשנות של התוצאות נדון במקטע תוצאות נציג.

3. אבחון של חולים

1. אם החולה אינו סרום אנטי-AQP4 IgG חיובי מראה מאפיין קליני אחד לפחות של הליבה של NMOSD (ראה סעיף לדיון), לאבחן את החולה NMSOD⁵. עם זאת, אם החולה אינו אנטי-AQP4 IgG שלילי, אבחנה של NMOSD אין אפשרות שלא לכלול.

תוצאות

באמצעות ההליך המתואר כאן, anti-AQP4 ספציפיים IgG בסרום הוא לזיהוי. במהלך ההליך, נוספו דגימות מראש מדולל פקד חיובי, שלילי פקד לשדה התגובה, המכילים אזורים transfected ו untransfected (איור 2). זריחה של הפקד שלילי באזור transfected הצביעו בעיקר על הכריכה לא ספציפי של נוגדנים משניים ל?...

Discussion

תארנו שיטה נגישים נרחב לזהות anti-AQP4 IgG בנסיוב אדם. Anti-AQP4 אג קשורה קשר הדוק NMOSD, הקמת שיטת זיהוי אמין anti-AQP4 IgG חיונית לאבחון קליני של NMOSD. ראשית, anti-AQP4 IgG הוא ספציפי NMOSD. טרשת נפוצה היא גם מחלה בתיווך החיסונית של מערכת העצבים המרכזית ומניות קווי דמיון רבים עם NMOSD¹². עם זאת, anti-AQP4 IgG הוא רק ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-aquaporin-4 IIFT	Euroimmun	FA 1128-2005-50	Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.
CellSens Dimension	OLYMPUS	N/A	photograph software
Gel & clot activator tube	Improve medical	623040202	From a local Chinese company