Humanem Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G Erkennung durch zellbasierte Assays

Zusammenfassung

Zellbasierte Assays ist eine weit verbreitete Methode zur Erkennung von Serum Anti-Aquaporin-4 Immunglobulin G. Diese Methode könnte auf klinische Diagnose und wissenschaftlichen Forschungen der Neuromyelitis-optisches Spektrum-Störungen angewendet werden.

Zusammenfassung

Anti-Aquaporin-4 (AQP4) Immunglobulin G (IgG) ist der Kern diagnostischer Biomarker für Neuromyelitis Optica-Spektrum-Störungen (NMOSD). Zellbasierte Assays (CBA) ist eine weit verbreitete Methode, Anti-AQP4-IgG in humanem Serum mit hoher Sensitivität und Spezifität zu erkennen. Kurz, Serum Anti-AQP4 IgG wird von AQP4-transfizierten Zellen, die feste auf dem Biochip ist dann durch einen Fluorescein-gekennzeichnete sekundäre Antikörper erkannt gefangen genommen. Fluoreszenzmikroskopie wird genutzt, um die Fluoreszenz sichtbar zu machen, und die Intensität der Fluoreszenz wird durch mindestens zwei erfahrene Kliniker ausgewertet. Eine endgültige Diagnose des NMOSD kann basierend auf der Kombination von Anti-AQP4 IgG Detektionsergebnisse, klinischen Manifestationen und neuroradiologische Befunde erfolgen. Früheren Studien zufolge CBA ist empfindlicher und spezifischer als andere Anti-AQP4-IgG-Nachweisverfahren und klinische Diagnose und Studien des NMOSD aufgebracht werden. Die Methode hat Einschränkungen; zum Beispiel fehlt noch eine internationale Skala Serum Anti-AQP4-IgG-Titer bewertet. Hier wird ein detailliertes Protokoll für menschliches Serum Anti-AQP4 IgG Nachweis mit CBA beschrieben.

Einleitung

Serum IgG AQP4 ist ein Kern diagnostischer Biomarker für Neuromyelitis Optica Spektrum Störungen (NMOSD)¹. Zellbasierte Assays (CBA) ist eine weit verbreitete Anti-AQP4 IgG Methode mit hoher Sensitivität und Spezifität. Hier ist ein detailliertes Protokoll für CBA vorgestellt.

AQP4, ein Wasser-Kanal-Protein hat sechs Membran überspannt Einheiten und zwei spiralförmige Domains rund um eine wässrige pore². Anti-AQP4 IgG in der Pathogenese der NMOSD durch Bindung an ihr Ziel AQP4, engagiert sich vor allem auf die Endfeet von Astrozyten³liegt. Es hat sich gezeigt, dass Anti-AQP4-IgG positiv in etwa zwei Drittel der NMOSD Patienten⁴ist. In der jüngsten internationalen Diagnosekriterien für NMOSD Anti-AQP4 IgG gilt eine Core-diagnostischer Biomarker-⁵. In dieser Hinsicht ist es entscheidend, ein zuverlässiges Protokoll zur Humanserum erkennen zu etablieren Anti-AQP4-IgG und klinische Diagnose der NMOSD zu erleichtern.

Derzeit sind verschiedene Anti-AQP4-IgG-Nachweismethoden zur Verfügung, wie z. B. CBA, Gewebe-basierten Tests und Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay Flow Cytometry^6,7. CBA beschäftigt EU90 Zellen, die mit menschlichen AQP4 Anti-AQP4 IgG erfassen transfiziert sind. Die erfassten Anti-AQP4-IgG ist von fluoreszierenden Sekundärantikörper erkannt und anschließend visualisiert durch Mikroskopie. Sammeln Beweise hat gezeigt, dass CBA empfindlicher und spezifischer als andere Anti-AQP4 IgG Erkennung Methoden^6,7. Laut einer Meta-Analyse die Sensitivität und Spezifität der KNA erwiesen sich 76 % und 99 %, die höher als gewebebasierten waren und Enzym-linked Immunosorbentprobe assays⁶. Darüber hinaus wurde ein multizentrische Vergleich der diagnostischen Tests von Anti-AQP4 IgG durchgeführten⁷. Insgesamt 193 Studie waren Themen aus 15 europäischen Diagnosezentren eingeschrieben⁷. Vier verschiedene Methoden wurden verwendet, um Serum Anti-AQP4 IgG⁷erkennen. Es konnte gezeigt werden, dass CBA empfindlicher und spezifischer als die anderen Methoden⁷war. Wie AQP4 als zwei große Isoformen (AQP4-M1 und AQP4-M23) zum Ausdruck kommt, ist Anti-AQP4-IgG-Capture-Zelle mit AQP4-M1 oder AQP4-M23 transfiziert. Welche Art von Capture-Zelle ist jedoch besser bleibt umstritten. Eine Untersuchung hat AQP4-M1 Basis unterstützt CBA⁸, während andere schon angedeutet haben, dass AQP4-M23 CBA basierend ist besser^7,9,10. AQP4-M23-basierte CBA kann jedoch falsch positive Ergebnisse durch unspezifische IgG Bindung⁸erzielen. Jarius Et Al. ¹¹ berichtet, dass gab es keinen signifikanten Unterschied in Anti-AQP4-IgG-Erkennungsraten zwischen AQP4-M1 und AQP4-M23-basierte GAV.

In Zusammenfassung, Serum Anti-AQP4 IgG ist ein Kern-Biomarker für NMOSD. CBA hat höhere Spezifität und Sensitivität als andere Anti-AQP4-IgG-Nachweisverfahren. Es bleibt umstritten, ob AQP4-M1 - oder AQP4-M23-basierte CBA besser ist. In diesem Artikel wird ein detailliertes Protokoll für AQP4-M1-basierte CBA beschrieben, die für klinische Diagnose und Studien von NMOSD gelten kann.

Protokoll

Dieses Verfahren wurde von der Ethikkommission der ersten Krankenhaus der Jilin Universität zugelassen und wurde auf etwa 1.500 Probanden durchgeführt.

(1) Patienten und Blood Sample-Sammlung

1. Gelten Sie die Labor-Nachweis von Serum Anti-AQP4 IgG Klinik Patienten mit dem chief Beschwerden und Symptome unten aufgeführten. Durchführen Sie sowie körperliche Untersuchungen.
   
   Optikusneuritis: Patienten leiden mit visuellen Defiziten, wie Verlust des Gesichtsfeldes und Reduktion der Sehschärfe.
   Akuter Myelitis: Patienten mit Lähmungen, sensorische Defizite und autonome Dysfunktion präsentieren können.
   Area Postrema Syndrom: Patienten haben Symptome einer unerklärlichen Schluckauf, Übelkeit oder Erbrechen.
   Akute Hirnstamm-Syndrom: Hirnstamm Läsionen führen verschiedene Symptome und körperlichen Zeichen je nach Lage der Läsionen.
   Symptomatische Narkolepsie oder akute diencephalic klinisches Syndrom mit NMOSD-typische diencephalic MRT-Läsionen.
   Symptomatische zerebrale Syndrom mit NMOSD-typische Hirnläsionen.
   
   Hinweis: Nach den internationalen Konsens diagnostische Kriterien für NMOSD⁵, kann eine Diagnose der NMOSD gemacht werden, wenn der Patient Serum Anti-AQP4 ist IgG-positiven und hat mindestens eines der Kern klinische Merkmale wie oben beschrieben. Wir empfehlen jedoch nicht von Anti-AQP4-IgG bei Patienten mit Optikusneuritis nur testen.
2. Blut-Musterkollektion
   Hinweis: Patienten müssen nicht fasten.
   1. 2-3 mL venöses Blut in ein Sammelrohr 4 mL Vakuum Blut zu zeichnen.
   2. Lassen Sie das Serum für 30 min bei Raumtemperatur (RT) gerinnen.
      Hinweis: Verlängerten Blutgerinnung kann Serumspiegel wegen des Durchsickerns von Thrombozyten erhöhen.
   3. Zentrifuge bei 2100 X g für 5 min. sorgfältig das Serum auf einen neuen Schlauch übertragen.
   4. Das Serum sofort oder Aliquote analysieren und Lagerung bei-20 oder-80 ° C.
      Hinweis: Lagerung bei-20 ° C ist für die Lagerung von Monaten, während-80 ° C für die Lagerung von Jahren.

2. Anti-AQP4-Antikörpernachweis

Vorsicht: Patientenproben und gebrauchte Kit Reagenzien sind infektiöse Materialien anzusehen. Natrium-Azid-haltigen Reagenzien im Kit sind giftig. Ein Flussdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.

1. Vorbereitung
   1. Bringen Sie das Kit auf RT vor Gebrauch.
      Hinweis: Bewahren Sie das Kit bei 2 bis 8 ° C.
   2. Bereiten Sie mindestens 200 mL PBS Waschpuffer mit 0,2 % Tween 20. Gießen Sie 100 mL Waschpuffer in einen 500-mL-Becherglas.
   3. Das Serum Proben 10 X mit Waschpuffer verdünnt. Bereiten Sie die positiven und negativen Kontrollen gemäß den Anweisungen des Verteilers.
2. Inkubation der Probe
   1. Die Reaktion Felder des Fachs Reagenz (Abbildung 2) 30 µL der vorverdünnt Proben, Positivkontrolle oder negative Kontrolle hinzufügen.
      Hinweis: Vermeiden Sie Luftblasen.
   2. Entfernen Sie die Schutzkappe auf den Folien Biochip.
      Hinweis: Berühren Sie nicht die Biochips um das ablösen und Kontamination der fixen Zellen zu vermeiden. Halten Sie die Folie nebeneinander vor dem Entfernen der Abdeckung.
   3. Gelten Sie die Biochip-Folie für das Reagenz Fach (Abbildung 2). Starten einer 30 min Inkubation bei RT
      Hinweis: Jede Probe sollte ein einzelner Tropfen ohne Vermischung mit anderen Tropfen auf die entsprechenden Biochip verbunden sein.
   4. Spülen Sie sanft die Biochip-Folie einmal mit Waschpuffer. Tauchen Sie die Biochip-Folie in der 500 mL-Becherglas mit 100 mL Waschpuffer für mindestens 5 min. Platz das Becherglas auf einen Shaker wenn möglich gefüllt.
   5. Nehmen Sie die Biochip-Folie von der Waschpuffer. Vorsichtig die restliche Waschpuffer außerhalb der Reaktion-Felder mit einem Papiertuch abwischen. Aussetzen der Biochip-Folie unter freiem Himmel für 1-2 min die verbleibende Waschpuffer im Feld Reaktion verdunsten.
      Hinweis: Die Reaktion-Felder nicht austrocknen. Berühren Sie nicht die Biochips mit Küchenpapier trockentupfen.
3. Sekundärantikörper Inkubation
   1. Bereiten Sie die sekundäre Antikörper-Lösung gemäß den Anweisungen des Verteilers.
   2. Die Reaktion Felder eines sauberen Reagenz Tabletts 25 µL fluoreszierende Sekundärantikörper hinzufügen.
   3. Gelten Sie die Biochip-Folie für das Reagenz Tablett voller Sekundärantikörper. 30 min bei RT inkubieren
4. Montage
   1. Gießen Sie die gebrauchten Waschpuffer und 100 mL frische Waschpuffer in das Becherglas. Wiederholen Sie das Waschen, wie in den Schritten 2.2.4 und 2.2.5 beschrieben.
   2. Die Reaktion-Felder auf ein Biochip-Folie (ein Tropfen pro Reaktion Feld) sorgfältig einbetten Medium hinzufügen. Die Biochip-Folie mit einem Deckglas zu versiegeln. Vermeiden Sie Luftblasen.
5. Fluoreszenz-Detektion
   1. Die Leuchtstofflampe des Mikroskops und vorheizen für 15 min. Wählen Sie einen 488 nm-Filter aktivieren.
   2. Open Foto Software. Fotografieren von transfizierten und untransfected aus allen Bereichen der Reaktion mit verschiedenen Vergrößerungen. Zunächst nehmen Sie ein Bild mit 4 X Vergrößerung für eine Übersicht, dann mehr Bilder mit 10 X und 20 X Vergrößerungen.
      Hinweis: Das ausführliche Protokoll wird in Tabelle 1dargestellt. Interpretation der Ergebnisse wird im Abschnitt repräsentative Ergebnisse diskutiert.

(3) die Diagnose des Patienten

1. Wenn der Patient Serum Anti-AQP4 ist IgG-positiven und zeigt mindestens ein Kern klinische Merkmal der NMOSD (siehe Diskussion), Patienten mit NMSOD⁵zu diagnostizieren. Jedoch wenn der Patient Anti-AQP4 kann IgG-negativ, eine Diagnose der NMOSD nicht ausgeschlossen werden.

Ergebnisse

Verwendung des beschriebenen Verfahrens hier, ist die spezifische Anti-AQP4-IgG im Serum nachweisbar. Während des Verfahrens waren vorverdünnt Proben, eine positiv-Kontrolle und eine negative Kontrolle der Reaktion Felder hinzugefügt, die transfizierte und untransfected Bereiche (Abbildung 2) enthalten. Fluoreszenz von der negativen Kontrolle in einem transfizierten Bereich angegeben vor allem die unspezifische Bindung des sekundären Antikörper zu den tr...

Diskussion

Wir haben ein breit zugänglich Verfahren zur Erkennung von Anti-AQP4-IgG in humanem Serum beschrieben. Anti-AQP4 IgG ist eng verwandt mit NMOSD und Schaffung einer zuverlässigen Anti-AQP4 IgG Erkennungsmethode ist entscheidend für die klinische Diagnose der NMOSD. Anti-AQP4 IgG ist spezifisch für NMOSD. Multiple Sklerose ist auch eine immun-vermittelte Erkrankung des zentralen Nervensystems und teilt viele Ähnlichkeiten mit NMOSD¹². Anti-AQP4 IgG ist jedoch nur positive NMOSD

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-aquaporin-4 IIFT	Euroimmun	FA 1128-2005-50	Contains biochip slides coated with AQP4-M1 transfected and untransfected EU 90 cells, fluorescein-labelled anti-human IgG, anti-AQP4 antibody as positive control, antibody negative sample, salt for PBS pH 7.2, Tween 20 and embedding medium.
CellSens Dimension	OLYMPUS	N/A	photograph software
Gel & clot activator tube	Improve medical	623040202	From a local Chinese company