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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El protocolo de bajo costo que consiste en análisis de la huella y colgante caja de prueba después de sistema de seguridad para el estrés es útil para evaluar los trastornos de movimiento del modelo del ratón.

Resumen

Disturbio del paso se observa con frecuencia en pacientes con trastornos del movimiento. En modelos de ratón utilizados para trastornos del movimiento, análisis de la marcha es prueba de comportamiento importante para determinar si los ratones imitan los síntomas de los pacientes. Déficit motor es a menudo inducida por el estrés cuando no fenotipo motor espontáneo se observa en los modelos de ratón. Por lo tanto, el análisis de la marcha siguió por la tensión de carga sería un método sensible para evaluar el fenotipo motor en modelos de ratón. Sin embargo, los investigadores enfrentan la exigencia de un aparato costoso para obtener automáticamente resultados cuantitativos de análisis de la marcha. Para estrés, tensión carga por métodos simples sin aparatos costosos necesarios para la descarga eléctrica y forzado a correr es deseable. Por lo tanto, presentamos un protocolo simple y de bajo costo que consiste en análisis de la huella con tinta y papel colgante caja de prueba para evaluar la función motora, y carga de estrés por restricción con un tubo cónico. El déficit motor de los ratones con éxito fueron detectado por este protocolo.

Introducción

Trastornos del movimiento se definen como alteraciones del sistema nervioso, mostrando un exceso o falta de movimientos voluntarios o automáticos1. En particular, disturbio del paso se documenta con frecuencia entre los pacientes con trastornos de movimiento2,3,4. Por lo tanto, análisis de la marcha es una prueba de comportamiento adecuada para la validación de modelos animales de trastornos del movimiento. En ratones, análisis de la marcha automática se han realizado para caminar a velocidad natural5 y a las velocidades ajustables por cinta de correr6,7. Estos análisis ofrecen resultados cuantitativos de la marcha automáticamente. Un método alternativo para detectar la alteración de la marcha se llama análisis de huella. Después de etiquetar los fondos de los pies con tinta, ratones caminando sobre el papel, y se analizan las huellas. Inicialmente, vaselina y carbón en polvo se utilizaron para visualizar la huella8y luego fueron reemplazados por tinta sobre papel de polígrafo9 y revelador fotográfico papel fotográfico10. Un método más barato y menos tóxico con tinta y el papel que los otros métodos sigue siendo hasta la fecha11. Análisis de la huella es menos costoso en comparación con análisis automatizado5,6,7 y serían útil para evaluar los trastornos del movimiento en modelos de ratón para los investigadores sin fondos de abundante investigación .

El colgante caja de prueba es una clase de cuatro extremidades colgantes pruebas con alambre jaula tapa12 y13de la pantalla de malla de alambre. La caja es un aparato con la tapa de la malla rotativa en la tapa de la caja a lo largo de una barra central. Además de análisis de la marcha, puede se realizar el examen fácilmente y económicamente. Por lo tanto, llevamos a cabo el colgante caja de prueba para evaluar la fuerza de agarre y el equilibrio, además para el análisis de la huella en el presente Protocolo.

El estrés induce los síntomas de trastornos de movimiento14,15. Déficit motor es inducido a menudo por varias tensiones crónicas aun cuando ningún fenotipo motor espontáneo se observa en los modelos de ratón de un desorden de movimiento16,17,18. Moderación es uno de los métodos comúnmente usados para tensión de carga en los ratones, porque el animal no está físicamente dañado19 y costo menos comparado con otros métodos como descargas eléctricas con aparato dedicado y forzado con el uso de una caminadora. Restricción por un tubo, que se realiza en confinamiento de un ratón en un tubo cónico de 50 mL agujereado, es más fácil que otros métodos tales como alambre de malla de tamiz, extremidades con cinta y envoltura de animal con una gasa (ha comentado20). En este artículo, resumimos los protocolos de la huella de análisis y el cuadro del colgante de prueba después de moderación por un tubo. Este protocolo nos ayudaría a utilizar modelos de ratón de trastornos del movimiento sin fenotipo motor espontáneo.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron en forma humana. La institucional Animal experimento Comité de Jichi Universidad médica aprobó el estudio. El estudio se realizó conforme a la regulación institucional experimento Animal y pautas fundamentales para la correcta conducta de Animal experimento y actividades afines en instituciones académicas de investigación bajo la jurisdicción del MEXT de Japón. Ratones en este protocolo han sido descrito previamente21.

1. colgar la caja de prueba

  1. Registrar el peso de cada ratón. Marque la cola Pen de la marca para la discriminación individual (por ejemplo., una línea, doble líneas y líneas triples).
    Nota: Se utilizan las curvas de crecimiento de un índice de salud general22.
  2. Coloque el ratón en la sala experimental por lo menos 30 min antes de la prueba de comportamiento. Establecer el cuadro de la suspensión, que consiste en una caja transparente (25 x 25 x 40 cm3) con una tapa de malla giratorio en la parte superior (figura 1). La tapa de la malla puede ser rotada a lo largo de una barra central para que la tapa se gira 180 grados.
  3. Poner un ratón en el centro de la tapa de malla. Baje la tapa de la malla lado cuidadosamente.
  4. Medir la latencia de la caída (tiempo de la suspensión) del ratón de la tapa de malla.
    Nota: Si el ratón no se dentro de 5 min, registrar la latencia como 5 minutos.
  5. Volver el ratón a la jaula del hogar. Limpie la caja colgante con etanol al 70% después de cada prueba.

2. huella análisis

Nota: Tras la caja colgante prueba, realizar el análisis de huella.

  1. Configurar el Pista de aterrizaje (Figura 2A).
    1. Cortar un trozo de papel blanco (29,7 cm x 42 cm x 0.09 mm) longitudinalmente en tres tiras de igual ancho. Fijar un trozo del libro blanco (9,9 cm x 42 cm) sobre la mesa.
    2. Poner la caja de gol oscuro en el extremo distal del papel. Poner otras cajas (aproximadamente la misma longitud que el del papel) con las paredes a ambos lados de la pista, evitando el escape de los ratones.
    3. Poner tinta negra y tinta roja en platos de Petri separadas (35 mm de diámetro).
  2. Sesión de entrenamiento.
    Nota: Llevar a cabo la sesión de entrenamiento sólo a 4 semanas de edad.
    1. Poner un ratón en el extremo proximal del papel (cara de la cabeza hacia la caja de gol). Deja el ratón a pie desde el extremo proximal a la caja de gol. Quitar el ratón de la caja de gol. Si el ratón se detiene en el papel, empuje suavemente el ratón hacia la caja de gol por el dedo.
    2. Sujete el mouse agarrando el pescuezo entre los dedos pulgar e índice para limitar el movimiento de las extremidades anteriores. Luego, sostenga la espalda y la cola entre la bola del pulgar y los otros dedos para limitar el movimiento de miembros posteriores.
      Nota: Insuficiente explotación del ratón resulta en manchas blancas /negras de la tinta en la ropa.
    3. Sumergir la parte inferior de extremidades anteriores en tinta roja y la parte inferior de miembros posteriores en tinta negra. Inmediatamente ponga el ratón en el extremo proximal del papel (cara de la cabeza hacia la caja de gol). Deja el ratón a pie desde el extremo proximal a la caja de gol. Si el ratón se detiene en el papel, empuje suavemente el ratón hacia la caja de gol por el dedo.
    4. Quitar el ratón de la caja de gol. Ir a la sesión de prueba.
  3. Sesión de prueba.
    1. Tras la sesión de entrenamiento, establecer el cauce para huellas con una nueva pieza de corte de papel blanco.
    2. Sujete el mouse agarrando el pescuezo entre los dedos pulgar e índice para limitar el movimiento de las extremidades anteriores. Luego, sostenga la espalda y la cola entre la bola del pulgar y los otros dedos para limitar el movimiento de miembros posteriores.
    3. Sumergir la parte inferior de extremidades anteriores en tinta roja y la parte inferior de miembros posteriores en tinta negra. Inmediatamente ponga el ratón en el extremo proximal del papel. Deja el ratón a pie desde el extremo proximal a la caja de gol.
      Nota: Porque los ratones prefieren la oscuridad, caminar se convierte en más estable como el ratón acerca a la caja de gol oscuro. Si el ratón se detiene en el papel, empuje suavemente el ratón hacia la caja de gol por el dedo. Entonces, si no se obtienen huellas confiables para el análisis (véase el paso 2.4. Análisis de huellas para detalles) porque el ratón se detiene, vuelva a intentar la sesión de prueba.
    4. Volver el ratón a la estructura de la casa de la caja de gol. Limpie la caja de gol con etanol al 70% después de cada sesión de prueba. Seque el papel impreso de pie.
  4. Análisis de huellas
    1. Obtener tres mediciones de cada parámetro (paso longitud de miembros anteriores y posteriores, delantero y trasero anchos de base, se superponen entre la extremidad delantera y trasera, figura 2B) con una regla de papel impreso de pie.
      Nota: Porque huellas de extremos proximales y distales con frecuencia muestran grandes variaciones debido a la parada o funcionamiento, elegir la parte con un patrón del paso constante de huellas. La parte media del pie impreso papel generalmente es adecuada para el análisis.
      1. Para la longitud de zancada, medir las distancias entre las mismas partes de la pata (por ejemplo, almohadilla de la pata o del dedo del pie).
      2. Para el delantero ancho base, trazar una línea entre huellas delanteras derecha (o izquierdas) consecutivos. Luego, mida la longitud de la línea vertical de la almohadilla de la huella delantera izquierda (o derecha) a la línea trazada entre las huellas de la derecha (o izquierdas).
      3. Para la anchura base trasera, trace una línea entre huellas traseras (izquierdas o derecha) consecutivos. Luego, mida la longitud de la línea vertical de la almohadilla de la huella trasera izquierda (o derecha) a la línea trazada entre las huellas de la derecha (o izquierdas).
      4. Superposición, mida la distancia entre teclas de la izquierda (o derecha) frente y huellas traseras.
    2. Promedio de las tres medidas para cada individuo. Utilice la media individual de cada parámetro para el análisis estadístico.
      1. Para la longitud de zancada, use el promedio de los promedios individuales de los avances de la izquierda y derecho.
      2. Asimetría de longitud de zancada, utilizar el valor absoluto de la diferencia entre promedios individuales del miembro izquierdo y longitud de zancada de la extremidad derecha.
      3. Para el análisis estadístico de los otros parámetros (ancho base delantero, ancho base trasera y superposición), utilizar la media individual directamente.

3. sistema de seguridad para carga de estrés

  1. Preparación de tubos de sujeción.
    1. Hacer 16 hoyos (aproximadamente 2 mm de diámetro) en un tubo cónico de 50 ml (30 mm de diámetro x 115 mm de longitud) a lo largo de las marcas de la escala (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mL) y la parte trasera de cada escala marca con un taladro cuadrado (figura 3). Hacer un agujero en la punta del tubo cónico de 50 mL (aproximadamente 5 mm de diámetro) para respirar por el corte la punta. Hacer un hueco (aproximadamente 4 mm de diámetro) en la tapa del tubo para pasar la cola de los ratones.
  2. Carga de estrés
    1. Colocar los ratones en la habitación experimental.
    2. Sostenga un ratón agarrando el pescuezo entre el pulgar y el dedo índice. Introduzca el ratón en el tubo de retención de la cabeza. Pasar la cola por el orificio de la tapa. Cierre la tapa.
      Nota: Limitar el movimiento del miembro anterior, ya que ratones rechazan entrar en el tubo por los miembros anteriores.
    3. Mantenga el ratón incluido por 2 h en una mesa a temperatura ambiente. Retire el ratón desde el tubo de retención y vuelva a la jaula casera.
      Nota: Los tubos de retención pueden ser reutilizados después de un lavado y seco.

4. experimental horario (Figura 4):

  1. Realizar el colgante caja de prueba y el análisis de la huella en el mismo día a las 4 semanas de edad (consulte el paso 1. Colgante caja de prueba y paso 2. Análisis de la huella para obtener más información) como una medida de línea de base en todos los ratones antes de la agrupación en 'estrés grupo' y ' sin estrés '.
    Nota: Sobre 8-10 ratones en camadas de 2-3 pueden ser convenientes utilizar en un experimento. Análisis de la huella a las 4 semanas de edad consiste en sesiones de entrenamiento y prueba.
  2. Dividir los ratones, al azar, un 'estrés grupo' y ' sin estrés '.
    Nota: Cuando los ratones se utilizan consisten en varias camadas, dividir hermanos de camada en ambos grupos. Número en cada grupo se compone de unos 4-5 ratones.
  3. Aplicar la tensión de restricción al grupo de estrés 6 veces en el transcurso de dos semanas (vea el paso 3. Tensión de seguridad carga para más detalles).
    Nota: 6 veces de retención se aplican cada dos semanas, seguido de un colgante caja análisis de prueba y huella de 6-12 semanas de edad. No aplique la tensión del sistema de seguridad para el día de la prueba de colgar la caja de prueba y el análisis de huella.
  4. Realizar el colgante caja de prueba y la sesión de la prueba de análisis de la huella en el mismo día en 6, 8, 10 y 12 semanas de edad.

Resultados

Los ratones machos heterocigotos de Atp1a3 (Atp1a3+ / −) que son el modelo de ratón para inicio rápido distonía parkinsonismo y hermanos de camada de tipo salvaje fueron utilizados en este protocolo. Atp1a3+ / − mostraron significativamente más cortos longitudes de zancada de la extremidad delantera y trasera que las del tipo salvaje en 4 semanas de edad (figura 5A y figura 5B

Discusión

El análisis de la huella y la caja colgante prueba Test conductual simple y barato para la función motora de los ratones. Los fenotipos de neurobehavioral en varios modelos de ratón han sido correctamente detectados por estas pruebas. Por ejemplo, acortar la longitud de zancada en esclerosis lateral amiotrófica24, mayor longitud de zancada asimétrica en la ataxia-telangiectasia25, mayor longitud de la superposición de la enfermedad de Huntington26

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por KAKENHI de JSPS (sociedad japonesa para la promoción de la ciencia) (subvenciones para investigación científica), conceder subsidios de universidades privadas y número 18K 07373 (H.S.).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Hanging boxO’hara & Co.http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
Marking penZEBRAMO-120-MC-BK
Goal boxO’hara & Co.http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/Accessory for apparatus of balanced beam test
BoxesO’hara & Co.-Side wall of runway
Black inkShin-asahi-
Red inkMaruyamakogyoBC-6
Disposable Petri DishCorning351008Petri dishe (35 mm in diameter)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3Askul701-712White paper (29.7 cm x 42 cm x 0.09mm)
50 mL Conical tubeCorning430829
Square drillKAKURI CorporationDIY FACTORY (K32-0313)

Referencias

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