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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il protocollo di basso costo consistente di analisi dell'impronta e appeso prova box dopo lo sforzo del fermo è utile per valutare i disordini di movimento di modello del topo.

Abstract

Dispersione di andatura è osservata frequentemente in pazienti con disordini del movimento. In modelli murini utilizzati per disturbi del movimento, analisi del passo è importante test comportamentali per determinare se i topi imitano i sintomi dei pazienti. Deficit motori sono spesso indotte da stress quando nessun fenotipo motore spontaneo è osservato nei modelli del mouse. Pertanto, analisi del cammino seguito da carico sarebbe un metodo sensibile per la valutazione del fenotipo motore in modelli murini. Tuttavia, i ricercatori devono affrontare il requisito di un apparecchio costoso per ottenere risultati quantitativi automaticamente da analisi del passo. Per lo stress, lo sforzo di caricamento con metodi semplici senza costosi apparati necessari per scosse elettriche e costretto in esecuzione è auspicabile. Di conseguenza, introduciamo un protocollo semplice e a basso costo, costituito da analisi dell'impronta con carta e inchiostro, appeso test box per valutare la funzione di motore e carico di stress definiti da fermo con un tubo conico. Il deficit del motore dei topi sono stati correttamente rilevati dal presente protocollo.

Introduzione

Disordini di movimento sono definiti come disturbi del sistema nervoso mostrando un eccesso o scarsità di movimenti volontari o automatico1. In particolare, disturbi dell'andatura sono frequentemente documentato tra i pazienti con i disordini di movimento2,3,4. Pertanto, l'analisi del passo è un idoneo test comportamento per la validazione di modelli animali di disordini di movimento. Nei topi, sono state effettuate analisi automatizzata di andatura per camminare a velocità naturale5 ed a velocità regolabile da tapis roulant6,7. Queste analisi forniscono risultati quantitativi di andatura automaticamente. Un metodo alternativo per rilevare la dispersione di andatura è chiamato analisi dell'impronta. Dopo l'etichettatura le parti inferiori dei piedi con inchiostro, topi cammino sulla carta, e le impronte vengono analizzate. Inizialmente, vaselina e polvere di carbone sono stati utilizzati per visualizzare l' impronta8e quindi sono stati sostituiti da inchiostro il poligrafo carta9 e dello sviluppatore fotografico su carta fotografica10. Un metodo più economico e meno tossico utilizzando inchiostro e carta rispetto agli altri metodi rimane ad oggi11. Analisi dell'impronta sono meno costoso rispetto con analisi automatica5,6,7 e sarebbero utile per valutare i disordini di movimento in modelli murini per i ricercatori senza fondi di ricerca abbondante .

L'impiccagione prova box è una sorta di quattro test di attaccatura degli arti mediante filo gabbia coperchio12 e rete metallica schermata13. La scatola è un apparato con coperchio girevole maglia sulla parte superiore del riquadro lungo una barra centrale. Oltre alle analisi del passo, il test può essere a buon mercato e facilmente eseguito. Di conseguenza, abbiamo condotto l'impiccagione test box per valutare la forza prensile ed equilibrio, inoltre per l'analisi dell'impronta in questo protocollo.

Lo stress induce i sintomi di disturbi di movimento14,15. I deficit del motore sono spesso indotte da diversi stress cronico anche quando nessun fenotipo motore spontaneo è osservato nei modelli del mouse di un disordine di movimento16,17,18. Moderazione è uno dei metodi comunemente usati per lo sforzo di caricamento nei topi, perché l'animale non è fisicamente danneggiato19 e il costo è inferiore rispetto ad altri metodi come scosse elettriche con apparecchio dedicato e costretto in esecuzione con l'uso di un tapis roulant. Ritenuta da un tubo, che è eseguito da confinare un topo in una provetta conica forata 50 mL, è più facile di altri metodi come filo maglia colino, arto nastrata e avvolgimento di animale con garza (Recensito il20). In questa carta, riassumiamo i protocolli dell'impronta analisi e il riquadro sporgente test dopo ritenuta da un tubo. Questo protocollo ci aiuterebbe ad utilizzare modelli murini di disordini di movimento senza fenotipo motore spontanea.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in maniera umana. Istituzionali animale esperimento Comitato di Jichi Università medica approvato lo studio. Lo studio è stato condotto in conformità con il regolamento istituzionale per esperimento animale e linea guida fondamentale per condotta corretta di esperimento di animali e attività connesse nelle istituzioni accademiche di ricerca sotto la giurisdizione del MEXT del Giappone. Topi usati in questo protocollo sono state descritte in precedenza21.

1. Test di scatola d'attaccatura

  1. Registrare il peso di ogni topo. Contrassegnare la coda dalla penna di marcatura per discriminazione individuale (ad es.., una linea, doppie linee e linee triple).
    Nota: Curve di crescita sono utilizzate per un indice di salute generale22.
  2. Posizionare i topi nella camera sperimentale almeno 30 min prima del test comportamento. Impostare il riquadro sporgente, che consiste in una scatola trasparente (25 x 25 x 40 cm3) con un coperchio girevole mesh in alto a sinistra (Figura 1). Il coperchio della maglia può essere ruotato lungo una barra centrale affinché la parte superiore viene capovolta di 180 gradi.
  3. Mettere un mouse al centro del coperchio della maglia. Con attenzione abbassare il coperchio di maglie a lato.
  4. Misurare la latenza di caduta (tempo di sospensione) del mouse dal coperchio della maglia.
    Nota: Se il mouse non rientra entro 5 min, registrare la latenza come 5 min.
  5. Tornare il mouse dalla gabbia. Pulire la scatola d'attaccatura con etanolo al 70% dopo ogni test.

2. analisi dell'impronta

Nota: In seguito il riquadro sporgente test, eseguire l'analisi dell'impronta.

  1. Impostare il Runway (Figura 2A).
    1. Tagliare un pezzo di carta bianca (29,7 x 42 cm x 0,09 mm) longitudinalmente in tre lunghezze di uguale larghezza. Impostare un pezzo di carta bianco (9,9 x 42 cm) sul tavolo.
    2. Mettete la scatola scuro obiettivo all'estremità distale della carta. Mettere altro scatole (circa la stessa lunghezza di quello della carta) con le pareti su entrambi i lati della pista, impedire la fuga dei topi.
    3. Mettere inchiostro nero e inchiostro rosso in piatti separati di Petri (35 mm di diametro).
  2. Sessione di allenamento.
    Nota: Eseguire la sessione di allenamento solo a 4 settimane di età.
    1. Mettere un mouse sull'estremità prossimale della carta (volto la testa verso la casella di obiettivo). Lasciare che il mouse a piedi dall'estremità prossimale alla casella di obiettivo. Rimuovere il mouse dalla casella di obiettivo. Se il mouse si ferma sulla carta, spingere delicatamente il mouse alla casella obiettivo dal dito.
    2. Tenere premuto il mouse afferrando la collottola tra il pollice e l'indice per limitare il movimento delle zampe anteriori. Quindi, afferrare il dorso e la coda tra la sfera del pollice e le altre dita per limitare il movimento delle zampe posteriori.
      Nota: Insufficiente tenuta del mouse provoca macchie di inchiostro sui vestiti.
    3. Immergere le parti inferiori delle zampe anteriori in inchiostro rosso e le parti inferiori delle zampe posteriori in inchiostro nero. Mettere immediatamente il mouse sull'estremità prossimale della carta (volto la testa verso la casella di obiettivo). Lasciare che il mouse a piedi dall'estremità prossimale alla casella di obiettivo. Se il mouse si ferma sulla carta, spingere delicatamente il mouse alla casella obiettivo dal dito.
    4. Rimuovere il mouse dalla casella di obiettivo. Andare per la sessione di test.
  3. Sessione di test.
    1. Dopo la sessione di allenamento, impostare la pista per impronte con un nuovo pezzo tagliato di carta bianca.
    2. Tenere premuto il mouse afferrando la collottola tra il pollice e l'indice per limitare il movimento delle zampe anteriori. Quindi, afferrare il dorso e la coda tra la sfera del pollice e le altre dita per limitare il movimento delle zampe posteriori.
    3. Immergere le parti inferiori delle zampe anteriori in inchiostro rosso e le parti inferiori delle zampe posteriori in inchiostro nero. Mettere immediatamente il mouse sull'estremità prossimale della carta. Lasciare che il mouse a piedi dall'estremità prossimale alla casella di obiettivo.
      Nota: Perché topi preferiscono il buio, camminare diventa più costante mentre il mouse si avvicina la casella obiettivo scuro. Se il mouse si ferma sulla carta, spingere delicatamente il mouse alla casella obiettivo dal dito. Quindi, se affidabile impronte non sono ottenute per l'analisi (vedere il punto 2.4. Analisi delle impronte per dettagli) perché il mouse ha smesso, riprovare a eseguire la sessione di test.
    4. Tornare alla gabbia a casa il mouse dalla casella di obiettivo. Pulire la scatola di obiettivo con etanolo al 70% dopo ogni sessione di test. Asciugare la carta stampata a piedi.
  4. Analisi di impronte
    1. Ottenere tre misurazioni di ogni parametro (lunghezze di arti anteriori e posteriori, anteriori e posteriori larghezze base della falcata, si sovrappongono tra arto anteriore e arto posteriore, fig. 2B) con un righello da carta stampata a piedi.
      Nota: Perché impronte dell'estremità prossimale e distale spesso mostrano ampie variazioni a causa di arresto o in esecuzione, scegliere la parte con un modello di andatura costante delle orme. La parte centrale della carta stampata in piedi solitamente sarà adatta per l'analisi.
      1. Per la lunghezza della falcata, misurare le distanze tra le stesse parti della zampa (ad es., zampa pad o punta).
      2. Per la larghezza della base anteriore, tracciare una linea tra consecutivi orme anteriore destro (o sinistro). Quindi, misurare la lunghezza della linea verticale dal tampone dell'impronta anteriore sinistro (o destro) per la linea tracciata tra le impronte di destra (o sinistra).
      3. Per la larghezza della base posteriore, tracciare una linea tra consecutive impronte posteriori destra (o sinistra). Quindi, misurare la lunghezza della linea verticale dal tampone dell'impronta posteriore sinistro (o destro) per la linea tracciata tra le impronte di destra (o sinistra).
      4. Per sovrapposizione, misurare la distanza tra pastiglie di sinistra (o destra) anteriori e posteriori delle impronte.
    2. Media delle tre misurazioni per ogni individuo. Utilizzare la media individuale di ciascun parametro per l'analisi statistica.
      1. Per la lunghezza della falcata, utilizzare la media delle medie individuali dei passi avanti sinistra e destra.
      2. Asimmetria di lunghezza della falcata, utilizzare il valore assoluto della differenza tra medie individuali dell'arto sinistro e lunghezza della falcata arto destro.
      3. Per l'analisi statistica degli altri parametri (larghezza base frontale, Larghezza base posteriore e sovrapposizione), utilizzare la media individuale direttamente.

3. sistema di ritenuta Stress caricamento

  1. Preparazione dei tubi di contenimento.
    1. Fare 16 fori (circa 2 mm di diametro) in una provetta conica da 50 ml (30 mm di diametro x 115 mm di lunghezza) lungo i segni di scala (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mL) e il retro di ogni scala per contrassegnare quadrato trapano (Figura 3). Fare un buco sulla punta del tubo conico 50 mL (circa 5 mm di diametro) per la respirazione, tagliando la punta. Praticare un foro (circa 4 mm di diametro) nel tappo tubo per passare la coda di topi.
  2. Carico di stress
    1. Posizionare i topi in camera sperimentale.
    2. Tenere un mouse afferrando la collottola tra il pollice e l'indice. Inserire il tubo di contenimento il mouse dalla testa. Passare la coda attraverso il foro nel tappo. Chiudere il tappo.
      Nota: Limitare il movimento degli arti anteriori, perché topi rifiutano di entrare nella cannula di quelle anteriori.
    3. Tenere il mouse racchiuso per 2 h su un banco a temperatura ambiente. Rimuovere il mouse dal tubo di moderazione e tornare alla gabbia a casa.
      Nota: I tubi di ritenuta possono essere riutilizzati dopo il lavaggio e asciutto.

4. sperimentale pianificazione (Figura 4):

  1. L'impiccagione di eseguire test e l'analisi dell'impronta della scatola lo stesso giorno alle 4 settimane di età (vedere il passaggio 1. Test di scatola d'attaccatura e il passaggio 2. Analisi dell'impronta per dettagli) come una misurazione di base su tutti i topi prima del raggruppamento in 'gruppo di sollecitazione' e un 'non-sollecita group'.
    Nota: Circa 8-10 topi in 2-3 cucciolate possono essere adatti da utilizzare in un esperimento. Analisi dell'impronta a 4 settimane di età è costituito da sessioni di training e di test.
  2. Dividere in modo casuale i topi in un gruppo di' stress' e un 'non-sollecita group'.
    Nota: Quando i topi sono utilizzati che consiste di diverse cucciolate, dividere littermates uniformemente in entrambi i gruppi. Numero in ogni gruppo è costituito da circa 4-5 topi.
  3. Applicare lo sforzo del fermo per il gruppo di' sforzo' 6 volte nel corso di due settimane (vedere il passaggio 3. Sforzo del fermo di caricamento per i dettagli).
    Nota: 6 volte di contenimento vengono applicate ogni due settimane, seguita da una sospensione casella Analisi test e impronta da 6-12 settimane di età. Non applicare lo sforzo del fermo il giorno dell'esame dell'impiccagione box test e l'analisi dell'impronta.
  4. Eseguire l'impiccagione casella test e la sessione di test di analisi dell'impronta sullo stesso giorno alle ore 6, 8, 10 e 12 settimane di età.

Risultati

I topi eterozigoti maschi di Atp1a3 (Atp1a3+ / −) che sono il modello di topo per la rapida insorgenza distonia parkinsonismo e littermates selvaggio-tipo sono stati utilizzati in questo protocollo. Atp1a3+ / − ha mostrato significativamente più brevi lunghezze di falcata della zampa anteriore e hindlimb rispetto a quelli di tipo selvatico a 4 settimane di età (Figura 5A e 5B figura<...

Discussione

L'analisi dell'impronta e il riquadro sporgente di test sono test comportamentali semplici e poco onerose per la funzione motoria dei topi. I fenotipi di neurobehavioral in diversi modelli di mouse sono stati rilevati con successo da queste prove. Ad esempio, accorciato la lunghezza della falcata nella sclerosi laterale amiotrofica24, maggiore lunghezza della falcata asimmetrica all'atassia-telangiectasia25, maggiore lunghezza di sovrapposizione nella malattia di Huntington...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato supportato da JSP (Japan Society for Promotion of Science) KAKENHI (sovvenzione per Scientific Research C), concedere numero 18K 07373 (A.S.) e sovvenzioni per le Università Private.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Hanging boxO’hara & Co.http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
Marking penZEBRAMO-120-MC-BK
Goal boxO’hara & Co.http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/Accessory for apparatus of balanced beam test
BoxesO’hara & Co.-Side wall of runway
Black inkShin-asahi-
Red inkMaruyamakogyoBC-6
Disposable Petri DishCorning351008Petri dishe (35 mm in diameter)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3Askul701-712White paper (29.7 cm x 42 cm x 0.09mm)
50 mL Conical tubeCorning430829
Square drillKAKURI CorporationDIY FACTORY (K32-0313)

Riferimenti

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