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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das kostengünstige Protokoll bestehend aus Footprint Analysen und hängen-Box-Test nach Zurückhaltung Stress nützlich ist für die Bewertung der Bewegungsstörungen des Mausmodells.

Zusammenfassung

Gangstörung ist häufig bei Patienten mit Bewegungsstörungen zu beobachten. In Mausmodellen für Bewegungsstörungen verwendet ist Ganganalyse wichtiger Verhaltens Test um festzustellen, ob die Mäuse die Symptome des Patienten zu imitieren. Motorische Defizite werden oft durch Stress induziert, wenn keine spontane motor Phänotyp in den Mausmodellen beobachtet wird. Ganganalyse, gefolgt von Stress laden wäre daher eine sensitive Methode zur Bewertung des motorischen Phänotyps in Mausmodellen. Allerdings haben Forscher das Erfordernis einer teuren Apparatur quantitative Ergebnisse automatisch Ganganalyse einzuholen. Für Stress ist Stress laden durch einfache Methoden ohne teure Apparate für elektrischen Schlag erforderte und zwang ausgeführt wünschenswert. Daher stellen wir eine einfache und kostengünstige Protokoll bestehend aus Footprint Analysen mit Papier und Tinte, hängend-Box-Test zur Beurteilung der motorischen Funktion, und Stress-Belastung durch Zurückhaltung mit einem konischen Rohr definiert. Die motorischen Defizite von Mäusen wurden erfolgreich durch dieses Protokoll erkannt.

Einleitung

Bewegungsstörungen werden als Störungen des Nervensystems zeigen ein Überschuss oder Mangel an freiwilligen oder automatische Bewegungen1definiert. Gangstörung ist besonders häufig bei Patienten mit Bewegung Störungen2,3,4dokumentiert. Ganganalyse deshalb einen geeigneten Verhaltens Test für die Validierung von Tiermodellen von Bewegungsstörungen. Bei Mäusen wurden automatisierte Gangart Analysen durchgeführt zum Wandern bei natürlichen Geschwindigkeit5 und einstellbare Geschwindigkeiten Laufband6,7. Diese Analysen liefern quantitative Ergebnisse des Gehens automatisch. Eine alternative Methode zur Erkennung von Gangstörungen nennt Footprint Analysen. Nach Kennzeichnung der Unterseite der Füße mit Tinte, Mäuse Fuß auf dem Papier, und die Spuren ausgewertet. Zunächst, Vaseline und pulverisierter Kohle wurden verwendet, um den Fußabdruck8visualisieren, und wurden dann durch Tinte auf Polygraph Papier9 und fotografische Entwickler auf Fotopapier10ersetzt. Eine billigere und weniger toxische Methode mit Tinte und Papier als die anderen Methoden bleibt bislang11. Footprint Analysen ist weniger teuer im Vergleich mit automatisierten Analyse5,6,7 und wäre sinnvoll, die Bewegungsstörungen in Mausmodellen für die Forscher ohne reichlich Forschungsgelder bewerten .

Das hà ¤ ngen-Box-Test ist eine Art von vier Gliedmaßen hängen Tests mit Draht Käfig Deckel12 und Maschendraht Bildschirm13. Die Box ist eine Vorrichtung mit drehbaren Mesh Deckel auf der Oberseite Box entlang einen Mittelsteg. Neben Ganganalyse kann der Test kostengünstig und einfach durchgeführt werden. Daher führten wir das hà ¤ ngen-Box-Test, Griffstärke und Balance, zusätzlich zu den Footprint Analysen in diesem Protokoll zu bewerten.

Stress induziert die Symptome der Bewegung Störungen14,15. Motorische Defizite werden oft von mehreren chronischen Spannungen induziert, auch wenn keine spontane motor Phänotyp in Mausmodellen eine Bewegung Störung16,17,18beobachtet wird. Zurückhaltung ist eine der häufigsten verwendeten Methoden für Stress bei Mäusen, laden, weil das Tier nicht körperlich geschädigten19 und Kosten ist weniger im Vergleich mit anderen Methoden wie Stromschläge mit eigenen Apparat und gezwungen, mit Einsatz von einem Laufband laufen. Zurückhaltung mit einer Röhre, die durchgeführt wird, durch die Beschränkung einer Maus in eine gelochte 50 mL konische Rohr ist einfacher als andere Methoden wie z. B. Draht Sieb, getapten Bein und Verhüllung des Tieres mit Gaze (bewertete20 Mesh). In diesem Artikel fassen wir die Protokolle des Footprint Analysen und die hängenden Box testen nach Zurückhaltung durch ein Rohr. Dieses Protokoll würde helfen, Maus-Modellen von Bewegungsstörungen ohne spontane motor Phänotyp zu verwenden.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden auf humane Weise durchgeführt. Der institutionellen Tier Experiment Ausschuss des Jichi medizinischen Universität bewilligt. Die im Einklang mit den institutionellen Verordnung für Tier-Experiment und grundlegende Leitlinie für die ordnungsgemäße Durchführung der Tier Experiment und damit zusammenhängende Tätigkeiten in akademischen Forschungseinrichtungen unter der Gerichtsbarkeit des MEXT Japan Studie wurde. In diesem Protokoll verwendeten Mäuse wurden21beschrieben.

(1) hängen-Box-Test

  1. Nehmen Sie das Gewicht jeder Maus. Markieren Sie das Heck durch Markierung Feder für individuelle Diskriminierung (z.B.., eine Linie, Linien und drei Zeilen).
    Hinweis: Wachstumskurven sind für einen Index der allgemeinen Gesundheit22verwendet.
  2. Legen Sie die Mäuse im Versuchsraum mindestens 30 min vor dem behavioral Test. Legen Sie die hängende Feld, bestehend aus einer klaren Box (25 X 25 X 40 cm3) mit einem drehbaren Mesh Deckel auf der Oberseite (Abbildung 1). Die Netz-Deckel kann entlang einer zentralen Bar gedreht werden, so dass oben 180 Grad gekippt wird.
  3. Setzen Sie eine Maus in der Mitte des Deckels Netz. Drehen Sie vorsichtig den Mesh Deckel Seite nach unten.
  4. Messen Sie die Herbst-Latenz (hängende Zeit) der Maus aus dem Netz-Deckel.
    Hinweis: Wenn die Maus nicht innerhalb von 5 min fällt, notieren Sie die Latenz als 5 min.
  5. Die Maus zu Hause Käfig zurück. Reinigen Sie die hängenden Kasten mit 70 % Ethanol nach jedem Test.

2. Footprint Analysen

Hinweis: Im Anschluss an die hängenden Box test, Footprint Analysen durchführen.

  1. Einrichten die Start-und Landebahn (Abbildung 2A).
    1. Schneiden Sie ein Stück weißes Papier (29,7 x 42 cm x 0,09 mm) längs in drei Längen von gleicher Breite. Legen Sie ein Stück weißes Papier (9,9 x 42 cm) auf dem Tisch.
    2. Setzen Sie die dunklen Ziel Kasten am distalen Ende des Papiers. Setzen Sie andere Boxen (etwa die gleiche Länge wie die des Papiers) mit den Wänden auf beiden Seiten der Start-und Landebahn, die Flucht von Mäusen zu verhindern.
    3. Schwarze Tinte und roter Tinte in separaten Petrischalen (35 mm Durchmesser) genommen.
  2. Trainingseinheit.
    Hinweis: Führen Sie das Training nur bei 4 Wochen alt.
    1. Setzen Sie eine Maus am proximalen Ende des Papiers (Gesicht der Kopf auf den Ziel-Quader). Lassen Sie die Maus aus dem proximalen Ende in das Ziel-Feld zu gehen. Entfernen Sie die Maus aus dem Ziel-Feld. Wenn die Maus nicht auf dem Papier mehr, schieben Sie die Maus in das Ziel-Feld mit dem Finger.
    2. Halten Sie die Maus durch das Greifen des Genicks zwischen Daumen und Zeigefinger um die Bewegung der Vorderbeine zu begrenzen. Greifen Sie dann, den Rücken und die Rute zwischen den Ball mit dem Daumen und die anderen Finger, die Bewegung der Hintergliedmaßen zu begrenzen.
      Hinweis: Unzureichende Durchführung eines Maus-führt zu Flecken der Tinte auf Kleidung.
    3. Tauchen Sie die Böden der Vorderbeine in roter Tinte und die Böden der Hinterbeine in schwarzer Tinte. Sofort setzen Sie die Maus auf das proximale Ende des Papiers (Gesicht der Kopf auf den Ziel-Quader). Lassen Sie die Maus aus dem proximalen Ende in das Ziel-Feld zu gehen. Wenn die Maus nicht auf dem Papier mehr, schieben Sie die Maus in das Ziel-Feld mit dem Finger.
    4. Entfernen Sie die Maus aus dem Ziel-Feld. Gehen Sie zu den Test-Session.
  3. Sitzung zu testen.
    1. Nach der Trainingseinheit, richten Sie die Start-und Landebahn für Spuren mit einem neuen Schnitt Stück weißes Papier.
    2. Halten Sie die Maus durch das Greifen des Genicks zwischen Daumen und Zeigefinger um die Bewegung der Vorderbeine zu begrenzen. Greifen Sie dann, den Rücken und die Rute zwischen den Ball mit dem Daumen und die anderen Finger, die Bewegung der Hintergliedmaßen zu begrenzen.
    3. Tauchen Sie die Böden der Vorderbeine in roter Tinte und die Böden der Hinterbeine in schwarzer Tinte. Sofort setzen Sie die Maus auf das proximale Ende des Papiers. Lassen Sie die Maus aus dem proximalen Ende in das Ziel-Feld zu gehen.
      Hinweis: Da Mäuse Dunkeln bevorzugen, wird das Wandern gleichmäßiger als die Maus Feld dunkle Ziel nähert. Wenn die Maus nicht auf dem Papier mehr, schieben Sie die Maus in das Ziel-Feld mit dem Finger. Dann, wenn zuverlässige Fußabdrücke für die Analyse nicht erhalten werden (siehe Punkt 2.4. Analyse der Footprints für details) weil die Maus gestoppt, wiederholen Sie die Test-Session.
    4. Die Maus zu Hause Käfig aus dem Ziel-Feld zurück. Reinigen Sie das Ziel-Feld mit 70 % Ethanol nach jedem Test-Session. Trocknen Sie die Fuß-bedruckte Papier an der Luft.
  4. Analyse der Spuren
    1. Erhalten Sie drei Messungen der einzelnen Parameter (Länge der Vorderbeine und Hinterbeine, Vorder- und Hinterbeine Basis breiten zu schreiten, Überschneidung von Vorderbein und Megalosauridae, Abb. 2 b) mit einem Lineal von Fuß-bedruckte Papier.
      Hinweis: Da Spuren der proximalen und distalen enden häufig große Unterschiede wegen Beendigung zeigen oder ausgeführt wird, wählen Sie den Teil mit einem stetigen Gangbild von Fußspuren. Der mittlere Teil des Fuß-bedruckten Papiers werden in der Regel geeignet für die Analyse.
      1. Messen Sie für die Schrittlänge die Abstände zwischen den gleichen Teilen von der Pfote (z. B. Pfote Pad oder Zehe).
      2. Zeichnen Sie für die vorderen Basisbreite eine Linie zwischen aufeinander folgenden rechts (oder links) vordere Fußabdrücke. Dann messen Sie die Länge der vertikalen Linie aus dem Pad des linken (oder rechten) vordere Footprints auf der Linie zwischen den Spuren rechten (oder linken).
      3. Zeichnen Sie für die Hinterbeine Basisbreite eine Linie zwischen aufeinander folgenden rechts (oder links) hinteren Fußspuren. Dann messen Sie die Länge der vertikalen Linie aus dem Pad des linken (oder rechten) hinteren Footprints auf der Linie zwischen den Spuren rechten (oder linken).
      4. Überlappung messen Sie den Abstand zwischen Pads von links (oder rechts) Vorder- und Hinterbeine Fußabdrücke.
    2. Durchschnitt der drei Messungen für jeden einzelnen. Verwenden Sie die einzelnen Durchschnitt der einzelnen Parameter für die statistische Auswertung.
      1. Verwenden Sie für die Schrittlänge den Durchschnittswert der einzelnen Durchschnitte von der linken und rechten Fortschritte.
      2. Verwenden Sie für Asymmetrie der Schrittlänge der Absolute Wert der Differenz zwischen einzelnen Durchschnitte der linken Extremität und rechten Extremität Schrittlänge.
      3. Verwenden Sie für die statistische Auswertung der anderen Parameter (vordere Basisbreite, Hinterbeine Basisbreite und Überlappung) den individuellen Durchschnitt direkt.

3. Zurückhaltung Stress be-

  1. Vorbereitung der Zurückhaltung Röhren.
    1. 16 Löcher (ca. 2 mm im Durchmesser) in einem 50 ml konische Röhrchen (30 mm Durchmesser X 115 mm in der Länge) entlang der Skala Markierungen zu machen (5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 mL) und die Rückseite jeder Skala Markieren von quadratischen Bohrmaschine (Abbildung 3). Machen Sie ein Loch an der Spitze von 50 mL konische Rohr (ca. 5 mm Durchmesser) für die Atmung durch das Abschneiden der Spitze. Machen Sie ein Loch (ca. 4 mm im Durchmesser) in der Röhre Kappe, das Ende der Mäuse zu übergeben.
  2. Stress-Belastung
    1. Legen Sie die Mäuse in den Versuchsraum.
    2. Halten Sie eine Maus durch das Genick zwischen dem Daumen und dem Zeigefinger greifen. Geben Sie die Maus in der Zurückhaltung Rohr aus dem Kopf. Übergeben Sie das Heck durch das Loch in der Kappe. Schließen Sie den Deckel.
      Hinweis: Schränken die Bewegung der Vordergliedmaße, weil Mäuse ablehnen, Eintritt in das Rohr durch die Vorderbeine.
    3. Halten Sie die Maustaste 2 h auf dem Schreibtisch bei Raumtemperatur eingeschlossen. Entfernen Sie die Maus aus der Tube Zurückhaltung und dem Hause Käfig zurück.
      Hinweis: Die Zurückhaltung Rohre können nach dem Waschen und trocken wiederverwendet werden.

4. experimentelle Zeitplan (Abbildung 4):

  1. Führen Sie das hà ¤ ngen box-Test und den Footprint Analysen am selben Tag im Alter von 4 Wochen (siehe Schritt 1. Hängende Boxentest und Schritt 2. Footprint Analysen für Details) als eine Basismessung auf alle Mäuse vor die Gruppierung in "Stress-Gruppe" und "non-Stress-Gruppe".
    Hinweis: Ca. 8-10 Mäuse in 2-3 Würfe geeignet sein können, in einem Experiment zu verwenden. Footprint Analysen im Alter von 4 Wochen besteht aus Trainings und Test.
  2. Teilen Sie nach dem Zufallsprinzip die Mäuse in ein "Stress-Gruppe" und "non-Stress-Gruppe".
    Hinweis: Wenn die Mäuse verwendet werden, bestehend aus mehreren Würfen teilen Sie Wurfgeschwistern gleichmäßig in beide Gruppen. In jeder Gruppe besteht aus ca. 4-5 Mäusen.
  3. Zuweisen des Zurückhaltung-Stress "Stress-Gruppe" 6-Mal im Laufe von zwei Wochen (siehe Schritt 3. Zurückhaltung Stress Laden für Details).
    Hinweis: 6 Mal Zurückhaltung gelten alle zwei Wochen, gefolgt von einer hängenden box Test und Footprint Analysen von 6-12 Wochen alt. Gelten nicht die Zurückhaltung Stress am Testtag der hängenden box Test und den Footprint Analysen.
  4. Führen Sie das hà ¤ ngen box Test und Test-Session des Footprint Analysen am selben Tag bei 6, 8, 10 und 12 Wochen alt.

Ergebnisse

Die heterozygoten männliche Mäuse Atp1a3 (Atp1a3+ / −), die im Mausmodell für schnellen Wirkungseintritt Dystonie Parkinsonismus und Wildtyp Wurfgeschwistern wurden in dieses Protokoll verwendet. Atp1a3+ / − zeigte deutlich kürzere Schrittlängen der Vordergliedmaße und Megalosauridae als der Wildtyp bei 4 Wochen alt (Abb. 5A und 5 b Abbildung, Kreis und Quadrat öffnen)....

Diskussion

Der Footprint Analysen und die hängenden Box testen sind einfache und kostengünstige Verhaltens Tests für die Motorik von Mäusen. Die Neurobehavioral Phänotypen in verschiedenen Mausmodellen wurden erfolgreich durch diese Tests nachgewiesen. Z. B. verkürzte Schrittlänge Amyotrophe Lateralsklerose24, Zunahme der Länge asymmetrische Schrittlänge in Ataxie-Teleangiektasie25, Zunahme der Länge der Überlappung in Huntington-Krankheit26 und Dyst...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von JSPS (Japan Society for Promotion of Science) KAKENHI (Beihilfe für wissenschaftliche Forschung C), Nummer 18K 07373 (HS) und Subventionen für Private Universitäten zu gewähren.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Hanging boxO’hara & Co.http://ohara-time.co.jp/products/wire-hanging-test/
Marking penZEBRAMO-120-MC-BK
Goal boxO’hara & Co.http://ohara-time.co.jp/products/balanced-beam-test/Accessory for apparatus of balanced beam test
BoxesO’hara & Co.-Side wall of runway
Black inkShin-asahi-
Red inkMaruyamakogyoBC-6
Disposable Petri DishCorning351008Petri dishe (35 mm in diameter)
Askul Multipaper Super White J Monochrome A3Askul701-712White paper (29.7 cm x 42 cm x 0.09mm)
50 mL Conical tubeCorning430829
Square drillKAKURI CorporationDIY FACTORY (K32-0313)

Referenzen

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