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Resumen

Caracterización del proteoma de camas microvasculares oculares es fundamental para la profunda comprensión de muchas patologías oculares en los seres humanos. Este estudio demuestra un método efectivo, rápido y robusto para la extracción de proteína y preparación de la muestra de pequeños vasos sanguíneos con las arterias ciliares posteriores cortas porcinas como recipientes de modelo de análisis basado en la espectrometría de masas proteómica.

Resumen

El uso de vasos oculares aislados in vitro para descifrar el estado fisiopatológico del ojo utilizando enfoques tecnológicos avanzados ha ampliado enormemente nuestra comprensión de ciertas enfermedades. Espectrometría de masas (MS)-basada en proteómica se ha convertido en una poderosa herramienta para desentrañar las alteraciones en los mecanismos moleculares y proteínas de señalización de vías en los lechos vasculares en salud y enfermedad. Sin embargo, los pasos de preparación de muestra antes del análisis de MS son cruciales para obtener resultados reproducibles y profundo esclarecimiento del proteoma complejo. Esto es particularmente importante para la preparación de microvasos ocular, donde la cantidad de muestra para análisis a menudo es limitado y por lo tanto, representa un reto para la extracción de proteínas óptimo. Este artículo intenta proporcionar un protocolo eficiente, rápido y robusto para la preparación de la muestra de un lecho vascular ocular de retrobulbar ejemplar con las arterias ciliares posteriores cortas porcinas. El presente método se centra en procedimientos de extracción de proteínas del sobrenadante y pellet de la muestra tras la homogeneización, limpieza con aparatos de filtro centrífugo antes unidimensional gel electroforesis y el péptido de purificación de la muestra pasos para la cuantificación de etiqueta-libre en un sistema de cromatografía líquida-electrospray ionización lineal de trampa de iones-Orbitrap MS. Aunque este método ha sido desarrollado específicamente para análisis de Proteómica de microvasos ocular, también hemos proporcionado pruebas convincentes de que puede también ser fácilmente empleado para otras muestras de tejido.

Introducción

El avance en el campo de la proteómica, que permisos integración e insuperable potencia de colección de datos, ha revolucionado grandemente nuestra comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes a ciertas condiciones de enfermedad, así como en lo que refleja la estado fisiológico de una célula específica población o tejido1,2,3,4. Proteómica también ha demostrado para ser una plataforma importante en la investigación oftalmológica debido a la sensibilidad y el análisis imparcial de diversas muestras oculares que facilitaron la identificación de posibles marcadores de enfermedad para el eventual diagnóstico y pronóstico, como demuestra elegantemente por muchos estudios en los últimos años, incluyendo algunos nuestros1,5,6,7,8,9,10. Sin embargo, a menudo es difícil obtener muestras humanas para el análisis proteómico debido a razones éticas, especialmente teniendo en cuenta la necesidad de material de control de individuos sanos para análisis comparativos confiables. Por otro lado, también es difícil obtener la cantidad suficiente de muestras para análisis de espectrometría de masa óptima y confiables. Esto es particularmente crucial para masa limitada materiales biológicos tales como los vasos de sangre del ojo. Un tal retrobulbar importante vaso sanguíneo que juega un papel fundamental en la regulación del flujo sanguíneo ocular es la arteria ciliar posterior corto (sPCA). Cualquier perturbación o anomalías en este lecho vascular pueden resultar en graves repercusiones clínicas, que pueden conducir a la patogenia de varias enfermedades peligrosas para la vista como glaucoma y no arterítica neuropatía óptica isquémica anterior (NAION)11 , 12. sin embargo, hay una falta de estudios elucidar los cambios proteoma en esta cama arterial debido a los inconvenientes antes mencionados. Por lo tanto, en los últimos años, los cerdos (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) de la casa ha surgido como un buen modelo animal en la investigación oftalmológica debido a las alta similitudes morfológicas y filogenéticas entre los seres humanos y cerdos13, 14,15. Las muestras oculares porcinas están fácilmente disponibles y lo más importante, son una representación más precisa de los tejidos humanos.

Teniendo en cuenta el importante papel de estos vasos sanguíneos en el ojo, así como la escasez de metodología atendido para análisis y extracción de proteínas eficiente de estos microvasos, anteriormente hemos caracterizado el proteoma de la sPCA porcino utilizando un interno Protocolo que dio lugar a la identificación de un gran número de proteínas16. Basado en este estudio, además hemos optimizado y descrito en profundidad la metodología en este artículo, que permite el análisis del proteoma de cantidades minuciosas de muestras usando el sPCA porcino como tejido de modelo. Aunque el objetivo principal de este estudio fue establecer una metodología compatible con MS para los vasos sanguíneos oculares masa limitada, hemos proporcionado evidencia experimental considerable que el flujo de trabajo descrito también puede ser aplicado ampliamente a diversas muestras de tejido.

Se prevé que este flujo de trabajo será instrumental para preparación de muestras de alta calidad compatible con MS de pequeñas cantidades de materiales para el análisis del proteoma completo.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales con muestras de animales fueron realizados en estricta observancia a la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología (ARVO) instrucción para el uso de animales en oftálmica e investigación de la visión y las directrices. Este estudio fue realizado y aprobado en el Departamento de Oftalmología de la Universidad médica centro de Maguncia.

Nota: Ojos porcinos junto con el nervio óptico y tejidos extraoculares se obtuvieron desde el matadero local inmediatamente post-mortem. Ojos enucleated fueron transportadas al laboratorio en solución salina helada tamponada de fosfato (PBS) y utilizados inmediatamente. La descripción esquemática del flujo de trabajo empleado es como se muestra en la figura 1.

1. las soluciones

  1. Para preparar Krebs-Henseleit (K-H) de búfer, pesan las siguientes sustancias (27,68 g de NaCl, 8,4 g de NaHCO3, 1,4 g de KCl, 1,18 g de MgSO4y 0,64 g de KH2PO4) en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL limpio y seco y , 1,47 g de CaCl2 y 8,0 g de glucosa en otro tubo.
    Nota: La mezcla del polvo de estos productos químicos debe guardarse en un lugar fresco y seco. La mezcla del polvo CaCl2 y glucosa es mejor preparada frescos para evitar la absorción de la humedad y el agrupar.
  2. Para preparar 200 μL de buffer de extracción 2A por muestra de pellets, mezcla de 100 μl de extracción Tampón 2 y 100 μl de reactivo de la extracción de la proteína de la transmembrana kit (ver B6 en la Tabla de materiales).
    Nota: Alícuota los componentes del kit de extracción de proteína transmembrana compuesta por buffer de extracción 2, reactivo y cóctel del inhibidor de la proteasa en porciones de trabajo y almacenar a-20 ° C para uso prolongan. Evitar congelaciones y descongelaciones repetidas. Descongelar los reactivos a temperatura ambiente (RT) antes de iniciar el procedimiento de extracción de pellets.
  3. Para preparar la solución de bicarbonato de amonio (ABC, 100 mM), disolver 0,39 g de ABC en 50 mL de agua desionizada.
  4. Para preparar 10 mM 1, 4-dithiothreitol (DTT) solución, disolver 30 mg de DTT en 20 mL de 100 mM ABC.
  5. Para preparar la solución de Yodoacetamida (IAA) de 55 mM, disolver 200 mg de AIA en 20 mL de 100 mM ABC.
    Nota: IAA debe guardarse en la oscuridad. Utilice una lámina de aluminio para envolver los tubos con soluciones sensibles a la luz.
  6. Preparar el tampón de la tripsina que contiene 10 mM ABC y 10% (vol / vol) acetonitrilo (ACN). Añadir 1,5 mL de solución de tripsina en un vial de 20 mg de tripsina para disolver su contenido para preparar una solución de trabajo de la tripsina de 13 ng/μl.
    Nota: Secuenciación modificado grado tripsina se suministra liofilizado y deben ser almacenados en-20 ° C hasta uso.
  7. Para preparar el tampón de extracción péptido, mezcla 1:2 (v/v) de ácido fórmico al 5% con ACN.
    Nota: Preparar todas las soluciones en pasos 1.3-1.7 fresco justo antes de usar y desechar cualquier volumen sin usar.
  8. Para preparar el 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA), mezclar 10 μl de TFA con 10 mL de agua desionizada.

2. aislamiento de las arterias ciliares posteriores cortas

Nota: El ojo porcino básicamente se divide en las secciones posteriores (figura 2B) y anterior (figura 2A).

  1. Lugar del globo del ojo en una cámara de disección con helado K-H tampón. Con cuidado recorte muscular circundante y los tejidos con un par de afiladas tijeras de Mayo.
  2. Hacer una incisión con un bisturí y cortar el globo a lo largo del plano ecuatorial con un par de afiladas tijeras de Mayo hasta que el ojo se separa en las mitades anteriores y posteriores. Eliminar como cuerpo vítreo tanto como sea posible de la mitad posterior del ojo con un par de pinzas patrón estándar.
    Nota: Separación del globo ocular en dos mitades facilita el aislamiento de sPCA con facilidad sin necesidad de un movimiento del ojo en el plato de la disección. Sin embargo, este paso no es obligatorio. Los vasos también pueden ser aislados sin tener que abrir el globo ocular.
  3. Use alfileres de disección al pin cuidadosamente por la mitad posterior del ojo con el lado de la retina hacia abajo y el nervio óptico hacia arriba hacia el experimentador.
  4. Con cuidado recorte el tejido conectivo que rodea el nervio óptico para exponer la vasculatura retrobulbar subyacente con un par de tijeras de Vannas estudiante primavera.
  5. La sPCA puede considerarse corta ramas de los vasos (entre 5-8) que penetran la esclerótica y circunferencialmente rodean la cabeza del nervio óptico (figura 2C). Aislar el paraoptic y distal sPCA junto con los tejidos conectivo circundantes con un par de tipo precisión 5 pinzas y tijera Vannas (figura 2D).
    Nota: Asegúrese de que el buffer K-H permanezca helado durante todo el procedimiento de aislamiento. Se recomienda cambiar el tampón cada 20-30 min, dependiendo de la temperatura ambiente.

3. preparación de la muestra

  1. Suavemente Retire los tejidos conectivos de los segmentos arteriales con punta extra fina tipo 5 precisión pinzas y tijera Vannas bajo un estereomicroscopio y enjuague las arterias aisladas en helada PBS para eliminar los contaminantes y residuos de la sangre.
    Nota: Si las muestras no están sujetos a los siguientes pasos inmediatamente, rápido-congele les en nitrógeno líquido y tienda en-80 ° C hasta su uso posterior.
  2. Arterias de la piscina de dos ojos para obtener una réplica biológica, transferirlas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y pesar las muestras utilizando una balanza analítica.
  3. A cada tubo, agregar una mezcla de granos de óxido de circonio 0,5 mm y 1,0 mm, seguido por el reactivo de extracción de proteína de tejido (T-PER; ver B7 en la Tabla de materiales).
    Nota: El volumen de T-por depende el peso de las muestras en cada tubo, con una proporción de 1 mL de reactivo a 50 mg de muestra. Regla general del pulgar a seguir cargando tubos para la homogeneización es una proporción de volumen de 1:1:2 = muestra: granos: T-por (figura 3A). No utilice demasiado grande un volumen del tampón de extracción y también un poco de granos para evitar la homogeneización ineficiente.
  4. Cargar los tubos de muestra en un homogeneizador mezclador (véase D6 en la Tabla de materiales). Ajuste el temporizador a 2 minutos y velocidad nivel 6 y empezar a homogeneización. Después de funcionar, compruebe las muestras para la homogeneización completa y ciclo repita hasta que las muestras son totalmente homogeneizada (figura 3B).
    Nota: Un total de 24 tubos de muestra puede ser homogeneizado en una carrera. Es importante mantener las muestras frías durante el procedimiento de homogeneización para minimizar la desnaturalización de la proteína. El homogeneizador del mezclador bala utilizado en este estudio tiene una función de enfriamiento inherente que mantiene frías las muestras. En casos donde ninguna característica interna de refrigeración está disponible en el homogenizador, muestras pueden conservarse en hielo entre cada serie.
  5. Pipetear cuidadosamente homogeneizado en tubos de microcentrífuga fresco. Centrifugar las muestras a 10.000 x g durante 20 min a 4 ° C para que sedimenten las proteínas insolubles y separado sobrenadante que contiene proteínas solubles. Pipetear cuidadosamente hacia fuera el sobrenadante en tubos de microcentrífuga fresco sin tocar la capa de sedimento (figura 3C).
    Nota: Pellet y sobrenadante pueden almacenarse en-80 ° C hasta su uso posterior.

4. pellets de digestión

  1. Añadir 200 μL de tampón de extracción 2A y 5 μl de inhibidor de la proteasa cóctel a cada muestra de sedimento. Suspender el precipitado varias veces con una pipeta.
    Nota: Mezcle los reactivos de extracción bien antes de agregar a los pellets. Mantenga 2A de buffer de extracción en el hielo y el inhibidor de proteasa a temperatura ambiente durante todo el procedimiento de extracción.
  2. Usar un homogenizador ultrasónico para homogeneizar completamente la pastilla.
    1. Establece la amplitud en ciclo a 1 y 60. Utilizar una sonda de titanio (Ø 0,5 mm, 80 mm de largo), que es apropiado para homogeneización de muestras con volúmenes pequeños (10-500 μl).
    2. Sumerja la sonda en la mezcla de buffer de extracción y pellets y presione el botón start para exponer la muestra a las ondas ultrasónicas.
    3. Someter a ultrasonidos la muestra hasta que los grumos de la pelotilla son completamente homogeneizados. Pausa de unos segundos entre cada sonicación.
    4. Compruebe visualmente la homogeneización completa. Mezclar el homogeneizado varias veces con una pipeta para asegurar que no hay grumos.
      Nota: El procedimiento de extracción de pellets debe realizarse en hielo para evitar la desnaturalización de la proteína debido al calor generado durante la homogeneización (figura 4).

5. limpieza de la muestra y tampón intercambio

  1. Utilizar dispositivos de filtro centrífugo con corte 3 kDa (ver D3 en la Tabla de materiales) para este procedimiento según las instrucciones del fabricante con modificaciones en su caso. En primer lugar, inserte la unidad de filtro en un tubo de microcentrífuga (incluido en el paquete de filtro).
  2. Pipetee 200 μL de homogenado de muestra al dispositivo de un filtro y añadir 200 μL de agua desionizada en el filtro mismo. Tapa firmemente (figura 5A).
  3. Coloque la unidad de filtro en una centrifugadora y exprimido para 14.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
  4. Retire el dispositivo de la centrifugadora y separar la unidad de filtrado del concentrado de la muestra del tubo de microcentrífuga con el filtrado. Deseche el filtrado (figura 5B).
  5. Añadir 400 μL de agua desionizada en la unidad de filtro para reconstituir el concentrado. Repita los pasos tres veces 5.3 y 5.4. Cuidadosamente Pipetee el concentrado 'limpiado' muestra en un microtubo limpio.
    Nota: Por lo general, una muestra cruda de 200 μL producirá 70 ~ 50 μl del concentrado después de la filtración.
  6. Repita los pasos 5.1-5.5 para los homogenados de muestra restantes.

6. proteína medida

  1. Utilizar análisis de proteína (BCA) ácido bicinchoninic kit (ver B5 en la Tabla de materiales) para determinar las concentraciones de proteína de las fracciones de pellet y sobrenadante de las muestras de sPCA en un lector de placas.
  2. Preparar las diluciones de (BSA) estándar de albúmina (final BSA las concentraciones oscilan entre 25 a 2.000 μg/mL) de una ampolla de 1 mL con 2 mg/mL BSA, según las instrucciones del fabricante.
  3. Pipetear 10 μl de cada dilución estándar de BSA y muestra réplicas (sobrenadante y sedimento) en cada pocillo de una microplaca de 96 pozos de fondo plano.
  4. Preparar el BCA trabajo reactivo mediante la adición de 50 partes de reactivo BCA para 1 parte de reactivo B. BCA
    Nota: Calcular el volumen total del reactivo de trabajo necesario para cada medición antes de la preparación y recién preparar suficiente volumen basado en el número de muestras y diluciones estándar a ensayarse.
  5. Cuidadosamente pipetee 200 μL del BCA trabajo reactivo en cada pozo. Cubrir la microplaca e incubar a 37 ° C durante 30 minutos. Después de enfriar la placa a RT, medir la absorbancia a 562 nm en un lector de placas (véase D13 en la Tabla de materiales).
  6. Basado en la curva estándar generada para cada concentración del estándar de BSA (μg/mL), determinar las concentraciones de proteína de las muestras.

7. electroforesis en Gel unidimensional (1DE)

  1. Preparar las muestras para 1DE como se muestra en la tabla 1 (para una muestra). Mezclar la mezcla de muestra con una pipeta. Calentar las muestras a 70 ° C por 15 min y enfriar a RT.
  2. Agregar 50 mL de tampón de correr de SDS MES a 950 mL de agua desionizada para preparar 1 x Buffer de corriente. Mezclar bien.
  3. Preparar prefabricado 4-12% Bis-Tris geles de proteína (ver B4 en la tabla de materiales).
    1. Corte la bolsa de plástico para quitar el cartucho de gel y enjuague el cartucho con agua desionizada.
    2. Retirar el peine de la cassette de gel en un solo movimiento fluido, teniendo cuidado de no para dañar los pozos.
    3. Enjuague suavemente los pocillos de carga 2 - 3 veces con 1 x Buffer de corriente utilizando una pipeta. Invertir y sacuda suavemente el cartucho de gel para retirar el tampón, asegurándose de que allí no hay burbujas de aire en los pozos.
    4. Retire la cinta blanca en la parte inferior de los cartuchos de gel.
  4. Geles (máximo dos cassettes) en el gel funcionamiento tanque y una vez montado completamente, cerrar la cuña de la tensión de gel.
  5. Llenar el buffer superior (cátodo) del compartimiento con 200 mL de Buffer de corriente hasta que los pozos estén completamente cubiertos. Revise en busca de fugas.
  6. Agregar 500 μl de antioxidante (véase A14 en la Tabla de materiales) al Buffer de corriente.
    Nota: El antioxidante es un reactivo de propiedad que debe ser usado con muestras reducidas con agente reductor (ver tabla 1) para mantener las condiciones reductoras durante la electroforesis y para prevenir la reoxidación de delicados aminoácidos como triptófano y metionina.
  7. Cuidadosamente la carga 50 μg de muestra por carril con una pipeta. Luego, cargar el estándar de la proteína previamente manchada como un marcador de masas molecular (véase A18 en la Tabla de materiales).
  8. Llenar la cámara inferior de búfer (ánodo) con 600 mL de Buffer de corriente.
  9. Correr los geles para ~ 60 min a una tensión constante de 175 V. En el final del funcionamiento, retire con cuidado el gel de la placa de cassette con un cuchillo de gel.
  10. Cuidadosamente transfiera los geles en un gel caja de tinción.
    1. Preparar la solución de fijación fresco basada en el número total de geles que necesitan ser manchado, según las instrucciones del fabricante tal como se describe en la tabla 2.
    2. Agite el cuál en la solución fijadora durante 10 min a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.
  11. Deseche la solución de fijación y tinción de los geles con azul coloidal kit de tinción.
    1. Preparar el fresco de la tinción soluciones basado en el número total de geles que necesitan ser manchado, según las instrucciones del fabricante tal como se describe en la tabla 3.
    2. En primer lugar, medir el volumen adecuado y mezclar directamente los componentes marcados con un asterisco (*) en el gel caja de tinción. Agite el cuál en la solución de tinción sin manchar B durante 10 min a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.
    3. Añadir Stainer B directamente en la tinción la caja que contiene el * solución de tinción. Cerciórese de agite bien antes de utilizar Stainer B.
      PRECAUCIÓN: Llevar a cabo los pasos de preparación 7.10.1 y 7.11.1 bajo una campana de humos.
  12. Agite el cuál en la solución de tinción durante la noche para mejores resultados generales.
    Nota: Las bandas teñidas serán visibles dentro de 10 minutos después de la adición de Stainer B. tinción requiere un mínimo de 3 h y la intensidad no varía si se deja por más tiempo en la solución de tinción.
  13. Decantar la solución de tinción y reemplazar con 200 mL de agua desionizada. Agite el cuál durante al menos 7-8 h en el agua para limpiar el fondo.
    Nota: Agua desionizada debe cambiarse varias veces durante el procedimiento de extracción para remover mejor mancha excesiva. El cuál puede también dejarse en agua durante 3 días sin comprometer la intensidad de la banda de proteína. Si el cuál no se sujeta a los siguientes pasos inmediatamente, puede ser almacenado en solución de sulfato de amonio 20% a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.

8. en gel de la digestión tríptica

Nota: Este protocolo es de acuerdo al método por Shevchenko et al.17, con ligeras modificaciones. Este procedimiento debe llevarse a cabo en una cabina de flujo laminar campana y ponga dedicado sistema de pipetas, puntas, tubos y cristalería específicamente para este propósito. Use guantes y ropa de laboratorio apropiada en todo momento para evitar que la queratina y otras impurezas. Preparar todas las soluciones y los reactivos utilizados en este procedimiento poco antes de su uso.

  1. Suprimir las bandas de proteínas desde el gel con cuchillas para Microtomo limpio y nuevo. Cortada la banda pequeña (aproximadamente 1 mm x 1 mm 2 mm x 2 mm). Cuidadosamente transfiera las piezas de gel en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
    Nota: Piezas que son demasiado pequeños pueden obstruir las puntas de pipeta y pedazos más grandes reduce recuperación de péptidos. Tenga cuidado al usar cuchillas para microtomo, que son extremadamente filosas.
  2. Extracción de
    1. Añadir 500 μL de solución de extracción que contiene 100 mM ABC solución/ACN (1:1, v/v) e incubar las muestras a temperatura ambiente por 30 min con agitación ocasional o Vortex.
    2. Pipetee cuidadosamente la solución de extracción. Compruebe visualmente cualquier tubo con el colorante residual. Repita el paso 8.2.1 si gel piezas todavía se tiñen de azul.
  3. Reducción y alquilación
    1. Añadir ~ 400 μL de solución recién preparada de TDT e incubar a 56 ° C para 30 min Asegúrese de que la solución cubre completamente las piezas de gel. Pipetear la solución reductora y deseche cuidadosamente.
    2. Añadir ~ 400 μL de solución recién preparada de IAA e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos Retire el alquilantes tampón con una pipeta y descartar.
  4. Digestión
    1. Agregar 500 μl de ACN limpio a temperatura ambiente durante 10-15 min hasta que las piezas de gel retracción y convertido en opacas. Pipetear a ACN y secar piezas de gel durante 5-10 min bajo el capó.
    2. Pipetear 50 μl de solución de tripsina en cada tubo para cubrir completamente las piezas de gel. Incubar los tubos en 4 ° C por 30 minutos.
    3. Después de 30 min, comprobar cada tubo si toda solución de tripsina ha sido absorbida por las piezas de gel. Añadir un volumen suficiente de tampón de tripsina (50-100 μl, dependiendo del volumen del tubo) para cubrir completamente las piezas de gel, si es necesario. Incubar las muestras durante la noche a 37 ° C.
  5. Extracción de péptido
    1. Pipetee cuidadosamente la solución de péptido extraído de los tubos y la transferencia para limpiar microtubos. El sobrenadante en un evaporador de vacío centrífugo en seco.
      Nota: No se deshaga de las restantes piezas de gel.
    2. Añada 100 μl de tampón de extracción (consulte el paso 1.7) a cada tubo e incubar durante 30 min a 37 ° C con agitación.
    3. Pipetee el sobrenadante en los mismos microtubos que contienen los péptidos extraídos según las respectivas bandas y seco hacia abajo en una centrífuga de vacío.
      Nota: Si no se utiliza inmediatamente, los extractos secos de péptido pueden almacenarse en-20 ° C hasta por varios meses hasta su uso posterior.

9. péptido purificación

Nota: Este procedimiento de desalación y purificación de la muestra de péptido se lleva a cabo con el uso de puntas de pipeta de18 C (véase C15 en la Tabla de materiales). Utilice una nueva punta para cada muestra.

  1. Preparar el siguiente fresco de soluciones en tubos de centrífuga cónicos y alícuota en tubos de microcentrífuga de 2 mL para el procedimiento de la purificación de péptidos, como se muestra en la tabla 4. Un resumen de los tubos para la purificación de péptidos es el siguiente: una (solución de la muestra), del tubo tubo B (solución de adherencia de soldadura), tubo C (solución de equilibrado), tubo D (solución de lavado), tubo E (solución de elución), tubo F (un vacio 2 mL o 5 mL tubo de microcentrífuga, dependiendo de el número de muestras a limpiarse, eliminación de residuos) y tubo G (un microtubo limpio, vacío, capacidad 0,2 mL).
  2. Reconstituir los extractos secos péptido de paso 8.6.3 con 10 μl de 0.1% TFA. Este tubo se señala tubo A.
  3. Someter a ultrasonidos A los tubos en un baño ultrasónico con hielo durante 5 minutos.
  4. Girar por la solución de la muestra en una centrífuga de sobremesa a 1.000 x g durante 1 minuto.
  5. Establece una micropipeta P10 en el ajuste de máximo volumen de 10 μl y conecte firmemente una punta de pipeta C18 .
  6. Sumerja la punta de la pipeta en la solución de humectación (tubo B) y aspirar con cuidado en el material de embalaje. Lentamente distribuir los residuos en el tubo F. Repita este paso por lo menos 7 - 8 veces.
    Nota: Oprima el émbolo de la pipeta a un paro y suelte lentamente el émbolo durante el procedimiento de dispensar. Tome la precaución de no introducir burbujas de aire en las puntas durante el pipeteo para asegurar la Unión del péptido máximo a la columna C18.
  7. Equilibre la punta para enlace péptido por aspiración 10 μl solución de equilibrado en tubo C. Deseche la solución y repita este procedimiento 3 a 4 veces.
  8. A continuación, aspirar y dispensar la solución de la muestra en tubo varias veces (dependiendo del espesor de banda de gel correspondiente) para enlazar los péptidos hasta la punta de la columna.
    PRECAUCIÓN: La aspiración y dispensación pasos durante el procedimiento de enlace (paso 9.8) se llevan a cabo dentro de tubo A. No dispensa la solución a los residuos.
  9. Lave la pipeta de18 C por aspiración la solución de lavado en tubo D y descarte desperdicios (tubo F) 4 a 5 veces.
  10. Por último, responsables los péptidos enlazados por pipetear la solución de elución (tubo de E) y dispensar el eluant en tubo G.
  11. Repita los pasos todos 2 a 3 ciclos por muestra para aumentar la recuperación de la muestra.
  12. Deseche la punta después de la purificación de una muestra y utilizar una punta nueva para la siguiente muestra.
  13. Los eluatos péptido purificado en un concentrador de vacío en seco.
    Nota: Las muestras purificadas ahora están listas para LC-MS/MS de análisis en el sistema LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS. Almacenar las muestras secadas en-20 ° C hasta su uso posterior.

10. líquido cromatografía-electrospray ionización-MS/MS análisis

Nota: Análisis de proteómica cuantitativa etiqueta-libre se realizan en un sistema de MS cromatografía líquida-electrospray ionización lineal trampa de iones-Orbitrap (LC-ESI-LTQ-Orbitrap). La LC se compone de bomba cuaternaria Rheos Allegro equipada con un desgasificador en línea (acoplado a un automuestreador PAL HTS y el sistema se compone de un 30 x 0,5 mm C18 precolumna conectado a una columna de 150 mm x 0,5 mm C18 . Uso invertir fase acuosa A solvente de agua de calidad LC-MS con 0,1% (v/v) de ácido fórmico y B solvente orgánico compuesto por LC-MS grado acetonitrilo con 0,1% (v/v) de ácido fórmico. Utilice el gradiente con una duración de 60 minutos por banda de gel, como se describe en detalle en nuestros anteriores estudios6,16.

  1. Disuelva las muestras de péptido purificado en 10 μl de 0.1% TFA. Someter a ultrasonidos las muestras en hielo durante 5 minutos.
  2. Pipetear 10 muestras μL en una placa de 96 V-fondo-bien y sellar con una capa de cubierta transparente, autoadhesivo.
  3. Transferir la placa al inyector automático.
  4. Utilice el siguiente gradiente para cada duración de 60 minutos: 0-35 minutos (15-40% solvente B), 35-40 min (40-60% solvente B), 40-45 min (60-90% solvente B), 45-50 min (90% solvente B), 50-53 min (90-10% solvente B) y 53-60 min (10% solvente B).
  5. Utilice las siguientes condiciones de espectrometría de masa del instrumento: modo de ionización electrospray ión positivo, voltaje de aerosol (2.15 kV), temperatura capilar (220 ° C), modo de adquisición de datos dependientes, adquisición automática de conmutación entre Orbitrap MS y LTQ MS/MS, resolución orbitrap (30.000), gama de m/z (300 a 1.600), destino automático gain control (AGC, 1.0 x 106 iones), calibración interna (polydimethlycyclosiloxane [PCM] en los 445.120025 iones de m/z en tiempo real), bloqueo total opción activada en modo de MS, datos de tándem obtenidos mediante la selección de los cinco más intensa precursor iones, más energía de la colisión de fragmentación por la disociación colisión-inducida (CID), normalizado (NCE, 35% con un tiempo de activación de 30 m con número de repeticiones de 3) y duración de la dinámica de la exclusión (600 s).
    Nota: Los iones fragmentados que se registran en el LTQ.
  6. Ejecutar al menos tres réplicas biológicas para cada muestra.

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Resultados

La disponibilidad limitada de la muestra es uno de los principales inconvenientes en investigación oftálmica. Correspondientemente, los métodos de extracción de proteína óptima producción de pequeñas cantidades de muestras tales como vasos sanguíneos oculares son a menudo discutibles. Hasta la fecha, existe una escasez de métodos atiende particularmente para la extracción de proteínas de los vasos sanguíneos retrobulbares. Por lo tanto, como un primer paso en la optimización...

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Discusión

Proteoma completo de perfiles de una amplia gama de muestras oculares es un primer paso importante e indispensable para dilucidar los mecanismos moleculares y las vías de señalización implicadas en la salud y la enfermedad. Con el fin de obtener datos de alta calidad y garantizar la reproducibilidad de los resultados obtenidos de estos análisis, los pasos anteriores de preparación de muestra son cruciales, como se destacó en un informe de Mandal et que discute en profundidad los procedimientos de procesamiento de m...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Dr. Manicam es apoyado por la Universidad de investigación financiamiento interno (Stufe 1) desde el centro médico de la Universidad de Johannes Gutenberg universidad Maguncia y una donación de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
Calcium chloride dihydrate (CaCl2)  Carl Roth 5239.12.5 mM 
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific14190169
Formic acid (CH2O2)AppliChemA0748
HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N)AppliChemA1605
HPLC-grade methanol (CH3OH)Fisher ScientificM/4056/17
HPLC-grade water AppliChemA1589
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI6125
Kalium chloride (KCl)  Carl Roth 6781.14.7 mM 
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.21.2 mM 
LC-MS-grade acetic acid Carl Roth AE69.1
Magnesium sulphate (MgSO4)   Carl Roth 261.21.2 mM 
NuPAGE AntioxidantThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0005
NuPAGE LDS Sample buffer Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP00074x
NuPAGE MES SDS Running Buffer Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000220x
NuPAGE Sample reducing agent Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000410x
SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC5925
Sequencing grade modified trypsinPromegaV5111
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth 9265.2118.3 mM 
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Carl Roth 965.325 mM 
Trifluoroacetic acid (TFA,  C2HF3O2)Merck Millipore108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate Carl Roth 6780.111 mM 
B. Reagents and Kits
0.5 mm zirconium oxide beads Next AdvanceZROB05
1.0 mm zirconium oxide beads Next AdvanceZROB10
Colloidal Blue Staining  KitThermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC6025To stain 25 mini gels per kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gelsThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0321BOX1.0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEKMerck Millipore71772-320 reactions per kit
Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER)Thermo Scientific78510
C. Tools
96-well V-bottom platesGreiner Bio-One651180
Corning 96-well flat-bottom platesSigma-AldrichCLS3595-50EA
Disposable microtome bladespfm Medical207500014
Disposable scalpels #21pfm Medical200130021
Dissection pins Carl RothPK47.1
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools14084-08
Falcon conical centrifuge tubes (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Mayo scissors, Tough cut Fine Science Tools14130-17
Precision tweezers Fine Science Tools11251-10Type 5
Precision tweezers, straight with extra fine tipsCarl RothLH53.1Type 5
Self-adhesive sealing films for microplatesRatiolab (vWR)RATI6018412
Standard pattern forceps Fine Science Tools11000-12
Student Vannas spring scissors Fine Science Tools91501-09
Vannas capsulotomy scissors  Geuder19760 Straight, 77 mm
ZipTipC18 pipette tipsMerck MilliporeZTC18S096
D. Equipment and devices
150 × 0.5 mm BioBasic C18 columnThermo Scientific, Rockford, USA72105-150565
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column Thermo Scientific, Rockford, USA72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices Merck MilliporeUFC500396Pack of 96.
Analytical balanceSartoriusH51
Autosampler CTC Analytics AG, Zwingen, SwitzerlandHTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm Next AdvanceNA-BB-25
Eppendorf concentrator, model 5301Sigma-AldrichZ368172
Eppendorf microcentrifuge, model 5424Fisher Scientific05-403-93Non-refrigerated
Heraeus Primo R CentrifugeThermo Scientific75005440Refrigerated
Labsonic M Ultrasonic homogenizer SartoriusBBI-8535027
LC-MS pump, model Rheos AllegroThermo Scientific, Rockford, USA22080
LTQ Orbitrap XL mass spectrometer Thermo Scientific, Bremen, Germany
Multiskan Ascent plate reader Thermo Labsystemsv2.6
Rotator with vortex neoLab7-0045
Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long)SartoriusBBI-8535612
Ultrasonic bath, type RK 31Bandelin329
Xcell Surelock Mini CellLife TechnologiesEl0001

Referencias

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  8. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629(2016).
  9. Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
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  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).

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