Préparation des échantillons pour l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse des microvaisseaux oculaires

Résumé

Caractérisation du protéome de lits microvasculaires oculaires est essentielle pour une compréhension approfondie des nombreuses pathologies oculaires chez les humains. Cette étude démontre une méthode efficace, rapide et robuste pour l’extraction de la protéine et préparation des échantillons de petits vaisseaux sanguins qui emploient les artères ciliaires postérieures courtes porcines comme navires de modèle pour l’analyse basée sur la spectrométrie de masse protéomique.

Résumé

L’utilisation des vaisseaux sanguins oculaires isolées in vitro à déchiffrer l’état physiopathologique de le œil en utilisant des approches technologiques avancées a considérablement élargi notre compréhension de certaines maladies. Spectrométrie de masse (MS)-protéomique basée a émergé comme un outil puissant pour démêler les altérations dans les mécanismes moléculaires et les protéines de signalisation dans les lits vasculaires dans la santé et la maladie. Cependant, les étapes de préparation d’échantillon avant l’analyse de MS sont cruciales d’obtenir des résultats reproductibles et approfondie élucidation du protéome complexe. Cela est particulièrement important pour la préparation des microvaisseaux oculaires, où la quantité d’échantillon disponible pour les analyses est souvent limité et par conséquent, constitue un défi pour l’extraction de protéines optimales. Cet article s’efforce de fournir un protocole efficace, rapid et robuste pour la préparation d’un lit vasculaire oculaire d’exemplaire rétrooculaire qui emploient les artères ciliaires postérieures courtes porcins. Le traite de méthode présente des procédés d’extraction de protéine du surnageant et le culot de l’échantillon après homogénéisation, nettoyage avec dispositifs de filtre centrifuge avant unidimensionnel gel électrophorèse et peptide purification de l’échantillon étapes pour la quantification exempte d’étiquette dans un système de MS d’ionisation linéaire piège ionique-orbitrap valant electrospray-chromatographie en phase liquide. Bien que cette méthode a été développée spécifiquement pour les analyses protéomique des microvaisseaux oculaires, nous avons également fourni une preuve convaincante qu’il peut aussi être facilement utilisé pour les autres échantillons tissulaires.

Introduction

L’avancement dans le domaine de la protéomique, qui autorise intégrée et une puissance de collecte de données, a considérablement révolutionné notre compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent certaines conditions de maladie ainsi qu’en reflétant la état physiologique d’une cellule spécifique population ou tissu^1,2,3,4. Protéomique s’est également avérée pour être une plate-forme importante recherche ophtalmique en raison de la sensibilité et l’analyse impartiale des différents échantillons oculaires qui facilite l’identification de marqueurs de maladies potentielles pour l’éventuel diagnostic et pronostic, comme en témoignent avec élégance par de nombreuses études au cours des dernières années, y compris certains des nôtres^{1,5,6,7,8,9,10}. Toutefois, il est souvent difficile d’obtenir des échantillons pour analyses protéomiques pour des raisons éthiques, surtout si l'on considère le besoin de matériel de contrôle des individus en bonne santé pour les analyses comparatives fiables. En revanche, il est également difficile d’obtenir un nombre suffisant d’échantillons pour l’analyse par spectrométrie de masse optimale et fiable. C’est particulièrement crucial pour les matières biologiques de masse limitée tels que micro-vaisseaux de le œil. Un tel vaisseau sanguin majeur rétrooculaire qui joue un rôle essentiel dans la régulation du débit sanguin oculaire est la courte artère ciliaire postérieure (sPCA). Toute perturbation ou anomalies dans ce lit vasculaire peuvent entraîner de graves répercussions cliniques, ce qui peuvent conduire à la pathogenèse de plusieurs maladies mortelles vue telles que le glaucome et nonarteritic neuropathie optique ischémique antérieure (NOIANA)^{11 , 12}. Cependant, il y a un manque d’études élucider les changements proteome dans ce lit artériel en raison les inconvénients mentionnés ci-dessus. Par conséquent, ces dernières années, le porc maison (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) a émergé comme un bon modèle animal en recherche ophtalmique en raison des forte similitudes morphologiques et phylogénétiques entre les humains et les porcs^{13, 14,15}. Porcines échantillons oculaires sont facilement disponibles et surtout, sont une représentation plus fidèle de tissus humains.

Considérant le rôle important de ces vaisseaux sanguins dans le œil, ainsi que le manque de méthodologie adapté pour l’extraction de la protéine efficace et analyses de ces microvaisseaux, nous avons caractérisé précédemment le protéome de la sPCA porcin à l’aide d’un interne protocole qui a permis l’identification d’un nombre élevé de protéines,¹⁶. Selon cette étude, nous avons également optimisé et décrit en profondeur notre méthodologie dans cet article, qui permet l’analyse du protéome de quantités infimes d’échantillons à l’aide de la sPCA porcine comme tissu de modèle. Bien que l’objectif principal de cette étude était d’établir une méthodologie compatible MS pour les vaisseaux sanguins oculaires de masse limitée, nous avons fourni des preuves expérimentales substantielles que le flux de travail décrit peut également être largement appliqué à divers échantillons tissulaires.

Il est prévu que ce flux de travail jouera un rôle déterminant pour préparation d’échantillons compatible MS haute qualité de petites quantités de matériaux pour des analyses complètes proteome.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales utilisant des échantillons animaux ont été effectuées dans le strict respect de l’Association pour la recherche en Vision et Ophthalmology (ARVO) déclaration sur l’utilisation des animaux ophtalmique et Vision Research et par directives institutionnelles. Cette étude a été effectuée et approuvée dans le département d’ophtalmologie, Centre médical d’université de Mayence.

Remarque : Les yeux porcins ainsi que le nerf optique et tissus extra-oculaires ont été obtenus fraîches en provenance de l’abattoir local immédiatement post-mortem. Les yeux énucléés ont été transportés au laboratoire dans une solution saline tamponnée au phosphate glacee (PBS) et utilisés immédiatement. L’aperçu schématique du flux de travail employée est représenté dans la Figure 1.

1. les solutions

1. Pour préparer Krebs-Henseleit (K.-H.), buffer, peser les produits chimiques suivants (27,68 g de NaCl, 8,4 g de NaHCO₃, 1,4 g de KCl, 1,18 g MgSO₄et 0,64 g de KH₂PO₄) dans un tube à centrifuger coniques propres et secs 50 mL et , 1,47 g de CaCl₂ et 8,0 g de glucose dans un autre tube.
   Remarque : Le mélange de poudre de ces produits chimiques doit être stocké dans un endroit frais et sec. Le mélange de poudres CaCl₂ et du glucose est mieux préparé frais pour empêcher l’absorption de l’humidité et l’agglutination.
2. Pour préparer 200 µL d’extraction tampon 2 a par exemple de pellet, mix 100 µL d’extraction tampon 2 et 100 µL de réactif A de l’extraction de la protéine transmembranaire kit (voir B6 dans la Table des matières).
   Remarque : Aliquote les composants du kit d’extraction de la protéine transmembranaire comprenant le tampon d’extraction 2, réactif A et inhibiteur de la protéase cocktail dans des portions de travail et les conserver à-20 ° C pour un usage prolongé. Éviter le gel et le dégel répétés. Décongeler les réactifs à température ambiante (RT) avant le début de la procédure d’extraction de pellet.
3. Pour préparer une solution de bicarbonate d’ammonium (ABC, 100 mM), dissoudre 0,39 g d’ABC dans 50 mL d’eau désionisée.
4. Pour la préparation de 10 mM 1, 4-le dithiothréitol (DTT) solution, dissoudre 30 mg de DTT dans 20 mL de 100 mM ABC.
5. Pour la préparation de 55 mM solution Iodoacétamide (IAA), dissoudre 200 mg d’AIA dans 20 mL de 100 mM ABC.
   Remarque : IAA doit être conservé dans l’obscurité. Utilisez une feuille d’aluminium pour envelopper les tubes avec des solutions sensibles à la lumière.
6. Préparer le tampon de la trypsine contenant 10 mM ABC et 10 % (vol / vol) dans l’acétonitrile (ACN). Ajouter 1,5 mL de tampon de la trypsine dans un flacon de 20 mg de trypsine de dissoudre son contenu pour préparer une solution de travail de la trypsine de 13 ng/µL.
   Remarque : Séquençage de grade modifié la trypsine est fourni lyophilisés et doivent être stockés à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
7. Pour préparer le tampon d’extraction de peptide, mélanger 1 / 2 (v/v) de 5 % d’acide formique avec ACN.
   Remarque : Préparer toutes les solutions en étapes 1,3-1,7 frais juste avant utilisation et jeter n’importe quel volume inutilisé.
8. Pour préparer le 0,1 % d’acide trifluoroacétique (TFA), mélanger 10 µL de TFA avec 10 mL d’eau désionisée.

2. isolement des artères ciliaires postérieures courtes

Remarque : Le œil de porc est essentiellement divisé en l’antérieure (Figure 2A) et les sections postérieures (Figure 2B).

1. Placez le globe de l’oeil dans une chambre de dissection contenant un tampon de K-H glacée. Soigneusement couper les muscles environnants et tissus avec une paire de ciseaux pointus de Mayo.
2. Faire une incision au scalpel et coupé du monde le long du plan équatorial avec une paire de ciseaux pointus de Mayo, jusqu'à ce que le œil est séparé dans les parties antérieures et postérieures. Supprimer le corps bien vitré que possible à partir de la moitié postérieure de le œil à l’aide d’une paire de pinces de modèle standard.
   Remarque : Séparation du globe oculaire en deux moitiés facilite l’isolement de la sPCA en toute simplicité sans avoir un oeil émouvant dans le plat de la dissection. Toutefois, cette étape n’est pas obligatoire. Les vaisseaux peuvent également être isolés sans ouverture du globe oculaire.
3. Utilisez les broches de dissection jusqu'à soigneusement la tige vers le bas de la moitié postérieure de le œil avec le côté de la rétine vers le bas et le nerf optique vers le haut vers l’expérimentateur.
4. Coupez délicatement conjonctif entourant le nerf optique pour exposer la vascularisation rétrooculaire sous-jacent avec une paire de ciseaux de Vannas étudiant printemps.
5. La sPCA peut être considérée comme de courts rameaux de navires (entre 5-8 branches) qui pénètrent la sclère et sur sa circonférence entourent la tête du nerf optique (Figure 2C). Isoler la paraoptic et la sPCA distale avec conjonctif environnant avec une paire de type précision 5 pinces et ciseaux de Vannas capsulotomie (Figure 2D).
   Remarque : Assurez-vous que le tampon de K-H reste glacé tout au long de la procédure d’isolement. Il est fortement recommandé de changer le tampon toutes les 20-30 min, selon la température ambiante.

3. préparation des échantillons

1. Doucement, retirer les segments artériels à l’aide de brucelles de précision type pointe extra fine 5 et ciseaux de Vannas capsulotomie sous un stéréomicroscope de tissus conjonctifs et rincer les artères isolées dans du PBS glacée pour éliminer les contaminants et les résidus de sang.
   Remarque : Si les échantillons ne sont pas immédiatement soumis aux étapes suivantes, clin d’oeil-gel eux dans l’azote liquide et magasin à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
2. Mettre en commun les artères des deux yeux pour obtenir un réplicat biologique, transférez-les dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL et peser les échantillons à l’aide d’une balance analytique.
3. Dans chaque tube, ajouter un mélange de 0,5 mm et 1,0 mm oxyde de zirconium perles, suivi par le réactif de d’extraction de protéines tissulaires (T-par ; voir B7 dans la Table des matières).
   Remarque : Le volume des T-par dépend de la masse des échantillons dans chaque tube, avec un ratio de 1 mL de réactif à 50 mg d’échantillon. Une règle générale du pouce à suivre lors du chargement de tubes pour homogénéisation est un rapport de volume de 1:1:2 = échantillon : perles : T-par (Figure 3A). Ne pas utiliser trop grand un volume de la mémoire tampon d’extraction et trop peu une quantité de perles pour empêcher l’homogénéisation inefficace.
4. Charger les tubes à échantillon dans un homogénéisateur mélangeur (voir D6 dans la Table des matières). Réglez le minuteur sur 2 min et vitesse niveau 6 et commencer à l’homogénéisation. Après l’exécution, vérifier les échantillons pour homogénéisation complète et cycle de répétition jusqu'à ce que les échantillons sont complètement homogénéisée (Figure 3B).
   Remarque : Un total de 24 tubes échantillon peut être homogénéisé en un seul passage. Il est important de garder les échantillons froid pendant la procédure d’homogénéisation pour minimiser la dénaturation des protéines. L’homogénéisateur mélangeur de balle utilisée dans cette étude est une caractéristique inhérente de refroidissement qui maintient les échantillons froid. Dans les cas où aucun dispositif de refroidissement interne n’est disponible dans l’homogénéisateur, les échantillons peuvent être conservés sur glace entre chaque série.
5. Pipetter soigneusement homogénat dans des tubes de microcentrifuge fraîches. Centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 20 min à 4 ° C pour granuler de protéines insolubles et surnageant distinct contenant des protéines solubles. Pipetter soigneusement sur le surnageant dans des tubes de microcentrifuge frais sans toucher à la couche de granulés (Figure 3C).
   Remarque : Surnageant et granulés peuvent être stockés dans-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.

4. pellet Digestion

1. Ajouter 200 µL d’extraction tampon 2 a et 5 µL d’inhibiteur de la protéase cocktail à chaque échantillon de pellet. Suspendre le culot plusieurs fois avec une pipette.
   Remarque : Mélanger les réactifs d’extraction bien avant d’ajouter au culot. Gardez 2 a le tampon d’extraction sur la glace et l’inhibiteur de protéase à ta tout au long de la procédure d’extraction.
2. Utilisez un homogénéisateur ultrasonique pour homogénéiser complètement le culot.
   1. Définir l’amplitude au cycle 1 et 60. Utiliser une sonde en titane (Ø 0,5 mm, 80 mm de long), qui est appropriée pour l’homogénéisation des échantillons avec de petits volumes (10-500 µL).
   2. Plonger la sonde dans le mélange de granulés et extraction tampon et appuyez sur le bouton start pour exposer l’échantillon à ultrasons.
   3. Laisser agir l’échantillon jusqu'à ce que les touffes de pellets sont complètement homogénéisées. Attendez quelques secondes entre chaque sonication.
   4. Vérifier visuellement l’homogénéisation complète. Mélanger l’homogénat plusieurs fois avec une pipette pour s’assurer qu’il n’y a pas des touffes.
      Remarque : La procédure d’extraction de pellet devrait être effectuée sur la glace pour éviter la dénaturation des protéines en raison de la chaleur générée lors de l’homogénéisation (Figure 4).

5. l’échantillon nettoyage et change de tampon

1. Utiliser des dispositifs de filtre centrifuge avec coupure 3 kDa (voir D3 dans la Table des matières) pour cette procédure selon les instructions du fabricant avec modifications le cas échéant. Tout d’abord, insérez l’unité de filtre dans un tube de microcentrifuge (fourni dans le pack de filtres).
2. Pipeter 200 µL de l’échantillon homogénéisé à l’appareil d’un filtre et ajouter 200 µL d’eau déionisée dans le même filtre. Couronner solidement (Figure 5A).
3. Placez le filtre dans une centrifugeuse et un essorage pour 14 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
4. Retirez l’appareil de la centrifugeuse et séparer l’unité de filtration contenant du concentré de l’échantillon dans le tube de microtubes contenant le filtrat. Jeter le filtrat (Figure 5B).
5. Reconstituer le concentré en ajoutant 400 µL d’eau déionisée dans l’unité de filtration. Répétez les étapes 5.3 et 5.4 trois fois. Pipetter soigneusement, le concentré d’échantillon « nettoyé » dans un microtube propre.
   Remarque : En règle générale, un échantillon brut 200 µL produira environ 50-70 µL du concentré après filtration.
6. Répétez les étapes 5,1 à 5,5 pour les homogénats d’échantillon restant.

6. mesure de la protéine

1. Utiliser l’analyse de protéine (BCA) acide bicinchoninic kit (voir B5 dans la Table des matières) pour déterminer les concentrations de protéine des fractions surnageant et le culot des échantillons sPCA sur un lecteur de plaque.
2. Préparer des dilutions albumine (BSA) standards (final BSA les concentrations varient entre 25 à 2 000 µg/mL) d’une ampoule de 1 mL, composée de 2 mg/mL de BSA, selon les instructions du fabricant.
3. Pipeter 10 µL de chaque dilution standard de BSA et échantillon réplique (surnageant et pellet) dans chaque puits d’une microplaque 96 puits à fond plat.
4. Préparer le BCA réactif de travail en ajoutant 50 parties de réactif BCA A pour 1 part de BCA réactif B.
   Remarque : Calcule le volume total de travail réactif requis pour chaque mesure avant la préparation et fraîchement préparer un volume suffisant selon le nombre d’échantillons et des dilutions standards à doser.
5. Soigneusement pipeter 200 µL de la BCA réactif de travail dans chaque puits. Couvrir la microplaque et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Après refroidissement de la plaque a RT, mesurer l’absorbance à 562 nm sur un lecteur de plaque (voir D13 dans la Table des matières).
6. D’après la courbe d’étalonnage générée pour chaque concentration standard de BSA (µg/mL), déterminer les concentrations de protéines des échantillons.

7. unidimensionnel d’électrophorèse (1DE)

1. Préparer les échantillons pour 1DE comme indiqué dans le tableau 1 (pour un échantillon). Mélanger le mélange de l’échantillon avec une pipette. Chauffer les échantillons à 70 ° C pendant 15 minutes et laisser refroidir RT.
2. Préparer 1 x tampon en cours d’exécution en ajoutant 50 mL de tampon de courir MES SDS à 950 mL d’eau désionisée. Bien mélanger.
3. Préparer préfabriqué de 4 à 12 % les gels de protéines Bis-Tris (voir B4 dans la Table des matières).
   1. Couper la poche en plastique pour retirer la cassette de gel et de rincer la cassette avec de l’eau désionisée.
   2. Retirer le peigne de la cassette de gel en un seul mouvement fluid, en prenant soin de ne pas endommager les puits.
   3. Rincer doucement les puits de chargement 2 - 3 fois avec 1 x tampon en cours d’exécution à l’aide d’une pipette. Retournez et secouez légèrement la cassette de gel pour retirer le tampon, n’assurant qu’aucune bulle d’air dans les puits.
   4. Enlever la bande blanche en bas des cassettes.
4. Insérer des gels (maximum deux cassettes) dans le gel réservoir en cours d’exécution et une fois entièrement assemblé, verrouiller la cale de tension de gel.
5. Remplir le tampon supérieur (cathode) chambre avec 200 mL de tampon en cours d’exécution jusqu'à ce que les puits sont complètement couverts. Vérifier la présence de fuites.
6. Ajouter 500 µL d’antioxydant (voir A14 dans la Table des matières) dans le tampon en cours d’exécution.
   Remarque : L’antioxydant est un réactif de bienséance qui doit être utilisé avec des échantillons réduits avec agent réducteur (voir tableau 1) pour maintenir les conditions réductrices pendant l’électrophorèse et empêcher la réoxydation des aminoacides sensibles comme le tryptophane et méthionine.
7. Soigneusement charger 50 µg d’échantillon par voie de circulation à l’aide d’une pipette. Puis, chargez la norme pré teinté de protéine comme un marqueur de masse moléculaire (voir A18 dans la Table des matières).
8. Remplir la chambre basse du tampon (anode) avec 600 mL de tampon en cours d’exécution.
9. Exécuter les gels pendant 60 min à une tension constante de 175 V. À la fin de la course, retirez soigneusement le gel de la plaque de la cassette à l’aide d’un couteau de gel.
10. Transvaser avec soin les gels dans un gel boîte de coloration.
    1. Préparer la solution de fixation frais basée sur le nombre total des gels qui doivent être colorés, selon les instructions du fabricant comme décrites dans le tableau 2.
    2. Secouez les gels dans la solution de fixation pendant 10 min à ta sur une plate-forme bascule.
11. Jeter la solution de fixation et tacher les gels avec colloïdal bleu kit de coloration.
    1. Préparer la coloration fraîche de solutions basée sur le nombre total des gels qui doivent être colorés, conformément aux instructions du fabricant comme décrites dans le tableau 3.
    2. Tout d’abord, mesurer le volume approprié et le mélanger directement les composants marqués d’un astérisque (*) dans le gel boîte de coloration. Secouez les gels dans la solution colorante sans Stainer B pendant 10 min à RT sur une plate-forme bascule.
    3. Ajouter Stainer B directement dans la coloration boîte contenant la * solution de coloration. Veillez à secouer Stainer B bien avant l’utilisation.
       Mise en garde : Effectuer les étapes de préparation 7.10.1 et 7.11.1 sous une hotte aspirante.
12. Secouez les gels dans la solution colorante pendant la nuit pour de meilleurs résultats globaux.
    Remarque : Les bandes colorées deviendra visibles dans les 10 min après l’addition de Stainer B. coloration nécessite un minimum de 3 h et l’intensité ne varie pas si laissée plus longtemps, dans la solution colorante.
13. Soigneusement décanter la solution colorante et le remplacer avec 200 mL d’eau désionisée. Secouez les gels pendant au moins 7-8 h dans l’eau pour effacer l’arrière-plan.
    Remarque : Eau désionisée doit être changé plusieurs fois pendant la procédure de décoloration pour mieux enlever tache excessive. Les gels peut également être laissé dans l’eau jusqu'à 3 jours sans compromettre l’intensité de bande de protéine. Si les gels n’est pas immédiatement soumis aux étapes suivantes, il peut être stocké dans une solution de sulfate d’ammonium de 20 % à 4 ° C pour le stockage à long terme.

8. en gel Digestion Trypsique

Remarque : Ce protocole est conforme à la méthode par Shevchenko et coll.¹⁷, avec de légères modifications. Cette procédure doit être effectuée dans une hotte à flux laminaire hotte et utiliser ensemble dédié de verrerie, tubes, pipettes et conseils spécialement à cet effet. Porter des gants et des vêtements de laboratoire approprié en tout temps pour prévenir la kératine et autres contaminations. Préparer ensemble des solutions et des réactifs utilisés dans cette procédure peu avant son utilisation.

1. Exciser les bandes de protéines du gel avec des lames propres, nouveau microtome. Couper la bande en petits morceaux (environ 1 x 1 mm à 2 mm x 2 mm). Transvaser avec soin les morceaux de gel dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
   Remarque : Les pièces qui sont trop petites peuvent boucher les pointes de pipette et gros morceaux réduira récupération de peptide. Faire preuve de prudence lorsque vous utilisez des lames microtome, qui sont extrêmement tranchantes.
2. De décoloration
   1. Ajouter 500 μl de solution de décoloration contenant 100 mM ABC solution/ACN (1:1, v/v) et incuber les échantillons à RT pendant 30 min avec agitation occasionnels ou de vortex.
   2. Pipetter soigneusement la décoloration de la solution. Vérifier visuellement tous les tubes avec tache résiduelle. Répétez l’étape 8.2.1 si morceaux de gel est toujours colorées en bleu.
3. Réduction et alkylation
   1. Ajouter ~ 400 µL de la solution fraîchement préparée de DTT et incuber à 56 ° C pendant 30 min. s’assurer que la solution couvre complètement les morceaux de gel. Doucement, pipette la solution réductrice et jetez-le.
   2. Ajouter ~ 400 µL de solution fraîchement préparée de IAA et incuber dans l’obscurité à RT pour 30 min. retirer les alkylants tampon avec une pipette et jeter.
4. Digestion
   1. Ajouter 500 µL d’ACN soignée à la droite pendant 10-15 min jusqu'à ce que les morceaux de gel se rétrécissent et devient opaques. Pipeter sur ACN et sécher les morceaux de gel pendant 5-10 min sous le capot.
   2. Pipetter 50 µL de solution de trypsine dans chaque tube pour couvrir complètement les morceaux de gel. Incuber les tubes à 4 ° C pendant 30 min.
   3. Après 30 min, vérifiez chaque tube si toutes les solution de trypsine a été absorbée par les morceaux de gel. Ajouter un volume suffisant de tampon de la trypsine (50-100 µL, selon le volume du tube) pour couvrir complètement les morceaux de gel, le cas échéant. Incuber les échantillons pendant une nuit à 37 ° C.
5. Extraction de peptide
   1. Pipetter soigneusement, la solution de peptide extrait des tubes et transfert pour nettoyer les microtubes. Le surnageant dans un évaporateur sous vide centrifuge à sec.
      Remarque : Ne pas jeter les pièces restantes de gel.
   2. Ajouter 100 µL de tampon d’extraction (reportez-vous à l’étape 1.7) à chaque tube et incuber 30 min à 37 ° C sous agitation.
   3. Pipeter le surnageant dans le même microtubes contenant les peptides extraits selon les bandes respectives et sécher vers le bas dans une centrifugeuse sous vide.
      Remarque : Si ne pas utilisée immédiatement, extraits secs de peptide peuvent être stockées à-20 ° C jusqu'à plusieurs mois avant une utilisation ultérieure.

9. Purification de peptides

Remarque : Ce procédé de dessalement et de purification d’échantillon peptide est réalisé avec l’utilisation de pointes de pipette C₁₈ (voir C15 dans la Table des matières). Utiliser un nouvel embout pour chaque échantillon.

1. Préparer suivant des solutions fraîches dans des tubes à centrifuger coniques et partie aliquote dans des tubes de microcentrifuge de 2 mL pour la méthode de purification de peptides, tel qu’illustré au tableau 4. Un résumé des tubes pour la purification de peptides est la suivante : Tube (une solution d’échantillon), Tube B (solution mouillante), Tube C (solution d’équilibration), Tube D (solution de lavage), Tube E (solution d’élution), Tube F (un vide 2 mL ou 5 mL tube microcentrifuge, selon le nombre d’échantillons à nettoyer, d’élimination des déchets) et le Tube G (un microtube propre et vide, capacité 0,2 mL).
2. Reconstituer le peptide séchées extraits étape 8.6.3 avec 10 µL de 0,1 % TFA. Ce tube est désigné Tube A.
3. Soniquer tubes A dans un bain à ultrasons avec de la glace pendant 5 min.
4. Tournez en bas la solution d’échantillon dans une centrifugeuse de paillasse à 1 000 x g pendant 1 min.
5. Régler une micropipette P10 au réglage de volume maximum de 10 µL et fixer un embout de pipette C₁₈ solidement.
6. Plongez l’embout de la pipette dans la solution de mouillage (Tube B) et aspirer soigneusement le matériel d’emballage. Lentement dispense les déchets en Tube F. répéter cette étape au moins 7 - 8 fois.
   Remarque : Enfoncer le piston de la pipette à un arrêt de mort et de relâcher lentement ou administrer piston tout au long de la procédure. Prenez la précaution de ne pas y introduire des bulles d’air dans les conseils pendant le pipetage afin d’assurer la liaison peptide maximale à la colonne C18.
7. Equilibrez la pointe pour la liaison peptide par aspiration 10 µL de solution de l’équilibration dans Tube C. jeter la solution et répétez l’opération 3 à 4 fois.
8. Ensuite, aspirer et distribuer des solution d’échantillon dans le Tube A plusieurs fois (selon l’épaisseur du gel band) pour lier les peptides pour faire basculer la colonne.
   Mise en garde : L’aspiration et la distribution des étapes au cours de la procédure de liaison (étape 9,8) sont exercent au sein de Tube A. Dispensent pas de la solution échantillon de gaspiller.
9. Laver la pipette de C₁₈ par aspirer la solution de lavage dans le Tube D et de jeter des déchets (Tube F) 4 à 5 fois.
10. Enfin, éluer les peptides liés par pipetage la solution d’élution (Tube E) et la distribution de l’éluant dans tube G.
11. Répétez les étapes ensemble 2 à 3 cycles par exemple d’augmenter la récupération de l’échantillon.
12. Jeter la pointe après purification un échantillon et une nouvelle astuce pour l’échantillon suivant.
13. Sécher les éluats de peptide purifié dans une pompe à vide.
    Remarque : Les échantillons purifiés sont maintenant prêts pour analyses LC-MS/MS dans le système LC-ESI-LTQ-orbitrap valant SM. Conserver les échantillons séchés à-20 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.

10. liquid chromatography-electrospray ionisation-MS/MS des Analyses

Remarque : Analyse protéomique quantitative exempte d’étiquette est exécutée sur un système de MS liquid chromatography-electrospray ionisation linéaire piège ionique-orbitrap valant (LC-ESI-LTQ-orbitrap valant). La LC est composé de pompe quaternaire Rheos Allegro équipé d’un dégazeur en ligne (couplé à un échantillonneur automatique HTS PAL et le système se compose d’une colonne 30 x 0,5 mm C₁₈ pré connectée à une colonne de 150 mm x 0,5 mm C₁₈ . Utilisation reverse phase aqueuse solvant A consistant en eau de qualité LC-MS avec 0.1 % (v/v) d’acide formique et organique solvant B consistant en LC-MS de l’acétonitrile grade avec 0.1 % (v/v) d’acide formique. Utiliser le gradient d’une durée de 60 min par bande de gel, comme décrit en détail dans nos études précédentes^6,16.

1. Dissoudre les exemples de peptide purifié de 10 µL de 0,1 % TFA. Laisser agir les échantillons sur la glace pendant 5 min.
2. Pipeter 10 échantillons µL dans une plaque de fond en V 96 puits et sceller avec un film de couverture claire, auto-adhésif.
3. Transférer la plaque à l’échantillonneur automatique.
4. Utiliser le gradient suivant pour chaque durée de 60 min : 0-35 min (15-40 % de solvant B), 35-40 min (40-60 % de solvant B), 40-45 min (60-90 % de solvant B), 45-50 min (90 % de solvant B), 50-53 min (90-10 % de solvant B) et 53 à 60 min (10 % de solvant B).
5. Utiliser les conditions suivantes par spectrométrie de masse de l’instrument : mode d’ionisation par électronébulisation ion positif, tension de pulvérisation (2.15 kV), capillaire température (220 ° C), le mode d’acquisition de données dépendantes, acquisition automatique de commutation entre orbitrap valant-MS et LTQ MS/MS, orbitrap valant résolution (30 000), gamme de m/z (300 à 1 600), cible automatique maîtriser (AGC, 1,0 x 10⁶ ions), ré-étalonnage interne (polydimethlycyclosiloxane [PCM] à 445.120025 ions de m/z en temps réel), verrouiller la masse option activée en mode MS, données de tandem obtenues en sélectionnant le top cinq plus intenses précurseur ions, fragmentation par dissociation induite par collision (CID), normalisée davantage d’énergie de collision (ECN, 35 % temps d’activation de 30 ms avec le nombre de répétitions de 3) et durée de l’exclusion dynamique (600 s).
   Remarque : Les ions fragmentées qui en résultent sont enregistrées dans le LTQ.
6. Exécuter au moins trois réplicats biologiques pour chaque échantillon.

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Résultats

Disponibilité limitée de l’échantillon est l’un des inconvénients majeurs en recherche ophtalmique. Parallèlement, les méthodes d’extraction des protéines optimales produisent de petites quantités d’échantillons tels que les vaisseaux sanguins oculaires sont souvent discutables. A ce jour, il y a peu de méthodes traiteur particulièrement pour l’extraction de la protéine de vaisseaux sanguins rétrooculaire. Donc, dans un premier temps dans l’optimisation de la mét...

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Discussion

Protéome complet de profilage d’une gamme variée d’échantillons oculaires est une première étape importante et indispensable d’élucider les mécanismes moléculaires et les voies de signalisation impliquées dans la santé et la maladie. Afin d’obtenir des données de haute qualité et d’assurer la reproductibilité des résultats obtenus à partir de ces analyses, les étapes de préparation d’échantillon précédent sont cruciales, comme le souligne un examen par Massinissa et Al qui a examiné en pr...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
Calcium chloride dihydrate (CaCl2)	Carl Roth	5239.1	2.5 mM
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190169
Formic acid (CH2O2)	AppliChem	A0748
HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N)	AppliChem	A1605
HPLC-grade methanol (CH3OH)	Fisher Scientific	M/4056/17
HPLC-grade water	AppliChem	A1589
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I6125
Kalium chloride (KCl)	Carl Roth	6781.1	4.7 mM
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth	3904.2	1.2 mM
LC-MS-grade acetic acid	Carl Roth	AE69.1
Magnesium sulphate (MgSO4)	Carl Roth	261.2	1.2 mM
NuPAGE Antioxidant	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0005
NuPAGE LDS Sample buffer	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0007	4x
NuPAGE MES SDS Running Buffer	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0002	20x
NuPAGE Sample reducing agent	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0004	10x
SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	LC5925
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	9265.2	118.3 mM
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Carl Roth	965.3	25 mM
Trifluoroacetic acid (TFA,  C2HF3O2)	Merck Millipore	108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate	Carl Roth	6780.1	11 mM
B. Reagents and Kits
0.5 mm zirconium oxide beads	Next Advance	ZROB05
1.0 mm zirconium oxide beads	Next Advance	ZROB10
Colloidal Blue Staining  Kit	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	LC6025	To stain 25 mini gels per kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0321BOX	1.0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK	Merck Millipore	71772-3	20 reactions per kit
Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER)	Thermo Scientific	78510
C. Tools
96-well V-bottom plates	Greiner Bio-One	651180
Corning 96-well flat-bottom plates	Sigma-Aldrich	CLS3595-50EA
Disposable microtome blades	pfm Medical	207500014
Disposable scalpels #21	pfm Medical	200130021
Dissection pins	Carl Roth	PK47.1
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Falcon conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
Mayo scissors, Tough cut	Fine Science Tools	14130-17
Precision tweezers	Fine Science Tools	11251-10	Type 5
Precision tweezers, straight with extra fine tips	Carl Roth	LH53.1	Type 5
Self-adhesive sealing films for microplates	Ratiolab (vWR)	RATI6018412
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12
Student Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91501-09
Vannas capsulotomy scissors	Geuder	19760	Straight, 77 mm
ZipTipC18 pipette tips	Merck Millipore	ZTC18S096
D. Equipment and devices
150 × 0.5 mm BioBasic C18 column	Thermo Scientific, Rockford, USA	72105-150565
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column	Thermo Scientific, Rockford, USA	72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices	Merck Millipore	UFC500396	Pack of 96.
Analytical balance	Sartorius	H51
Autosampler	CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland	HTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm	Next Advance	NA-BB-25
Eppendorf concentrator, model 5301	Sigma-Aldrich	Z368172
Eppendorf microcentrifuge, model 5424	Fisher Scientific	05-403-93	Non-refrigerated
Heraeus Primo R Centrifuge	Thermo Scientific	75005440	Refrigerated
Labsonic M Ultrasonic homogenizer	Sartorius	BBI-8535027
LC-MS pump, model Rheos Allegro	Thermo Scientific, Rockford, USA	22080
LTQ Orbitrap XL mass spectrometer	Thermo Scientific, Bremen, Germany
Multiskan Ascent plate reader	Thermo Labsystems	v2.6
Rotator with vortex	neoLab	7-0045
Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long)	Sartorius	BBI-8535612
Ultrasonic bath, type RK 31	Bandelin	329
Xcell Surelock Mini Cell	Life Technologies	El0001