Preparação da amostra para análise de Proteomics baseados em massa-espectrometria de Microvessels Ocular

Resumo

Caracterização do Proteome de leitos microvasculares oculares é crucial para a compreensão aprofundada de muitas patologias oculares em seres humanos. Este estudo demonstra um método eficaz, rápido e robusto para a extração de proteínas e preparação da amostra de pequenos vasos sanguíneos, empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares como vasos de modelo para análise proteômica de espectrometria de massa-base.

Resumo

O uso isolado ocular vasos sanguíneos in vitro para decifrar o estado fisiopatológico do olho usando abordagens tecnológicas avançadas expandiu-se enormemente nossa compreensão de certas doenças. Espectrometria de massa (MS)-baseado proteomics surgiu como uma ferramenta poderosa para desvendar as alterações nos mecanismos moleculares e proteínas de sinalização de percursos nas camas vasculares na saúde e na doença. No entanto, etapas de preparação de amostra antes MS análises são cruciais para obter resultados reprodutíveis e elucidação em profundidade o complexo proteome. Isto é particularmente importante para a preparação de microvessels ocular, onde a quantidade de amostra disponível para análise é muitas vezes limitada e assim, representa um desafio para a extração de proteína ideal. Este artigo visa fornecer um protocolo eficiente, rápido e robusto para a preparação da amostra de um leito vascular ocular retrobulbar exemplar empregando porcinos curtas posteriores artérias ciliares. O presente método concentra-se nos procedimentos de extração da proteína do sobrenadante e sedimento da amostra após a homogeneização, limpeza com dispositivos de filtro centrífugo antes unidimensional gel de eletroforese e peptídeo purificação da amostra passos para a quantificação de rótulo livre num sistema MS Orbitrap-ion trap linear-ionização electrospray-cromatografia líquida. Embora este método foi desenvolvido especificamente para proteomics análises de microvessels ocular, nós também fornecemos evidências convincentes de que pode também ser facilmente empregado para outras amostras de tecido com base em.

Introdução

O avanço no campo da proteômica, quais licenças integrado e insuperável poder de coleta de dados, extremamente tem revolucionado nossa compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a certas condições de doença, bem como refletindo o estado fisiológico de uma célula específica população ou tecido^1,2,3,4. Proteomics também provou para ser uma plataforma importante na pesquisa oftálmica devido a sensibilidade e a análise imparcial das diferentes amostras oculares que facilitou a identificação de potenciais marcadores de doença para eventual diagnóstico e prognóstico, como evidenciado elegantemente por muitos estudos nos últimos anos, incluindo alguns dos nossos^{1,5,6,7,8,9,10}. No entanto, muitas vezes é difícil obter amostras humanas para análises de proteomic devido a razões éticas, especialmente considerando a necessidade de material de controle de indivíduos saudáveis para as análises comparativas confiáveis. Por outro lado, é também um desafio para obter a quantidade suficiente de amostras para análises de espectrometria de massa ideais e confiáveis. Isto é particularmente crucial para massa-limitada materiais biológicos como os microvasos do olho. Um tal vaso sanguíneo retrobulbar grandes que tem um papel fundamental na regulação do fluxo sanguíneo ocular é a artéria ciliar posterior curta (sPCA). Qualquer perturbação ou anomalias nesta cama vascular podem resultar em graves repercussões clínicas, que podem levar à patogênese de várias doenças fatais vista como glaucoma e nonarteritic neuropatia óptica isquêmica anterior (NAION)^{11 , 12}. no entanto, há uma falta de estudos para elucidar as mudanças proteome nesta cama arterial devido as desvantagens acima mencionadas. Portanto, nos últimos anos, os suínos de casa (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) emergiu como um bom modelo de animais na pesquisa oftálmica devido as altas semelhanças morfológicas e filogenéticas entre os seres humanos e suínos^{13, 14,15}. Porcinos amostras oculares estão facilmente disponíveis e mais importante, são uma representação mais precisa de tecidos humanos.

Considerando o importante papel destes vasos sanguíneos nos olhos, bem como a escassez de metodologia servida para extração de proteínas eficiente e análises destes microvessels, nós anteriormente têm caracterizado a proteoma da sPCA suínos usando um in-house protocolo que resultou na identificação de um número elevado de proteínas¹⁶. Com base neste estudo, temos ainda mais otimizado e descrito em profundidade nossa metodologia neste artigo, o que permite a análise do proteoma de quantidades minuciosas de amostras usando o sPCA porcina como tecido de modelo. Embora o objetivo principal deste estudo foi estabelecer uma metodologia compatível com o MS para os vasos sanguíneos oculares de massa limitada, nós fornecemos substanciais evidências experimentais que o fluxo de trabalho descrito também pode ser amplamente aplicado a várias amostras de tecido-baseado.

Prevê-se que este fluxo de trabalho será fundamental para a preparação de amostras de alta qualidade compatível com o MS de pequenas quantidades de materiais para análises de proteome abrangente.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais, utilizando amostras de animais foram realizados em aderência estrita para a associação para pesquisa em visão e oftalmologia (ARVO) declaração sobre a utilização dos animais em oftalmologia e visão pesquisa e pelas diretrizes institucionais. Este estudo foi realizado e aprovado no departamento de Oftalmologia, universidade médica centro de Mainz.

Nota: Porcinos olhos juntamente com o nervo óptico e extra-oculares tecidos foram obtidos frescas do matadouro local imediatamente post-mortem. Olhos sem núcleo foram transportados para o laboratório em soro fisiológico gelado tamponado de fosfato (PBS) e usados imediatamente. A visão esquemática do fluxo de trabalho empregado é como está representada na Figura 1.

1. soluções

1. Para preparar a Krebs-Henseleit (K-H) de tampão, pesar os seguintes produtos químicos (27,68 g de NaCl, 8,4 g de NaHCO₃, 1,4 g de KCl, 1,18 g de MgSO₄e 0,64 g de KH₂PO₄) em um tubo de centrifuga conico de 50ml limpo e seco e , 1,47 g de CaCl₂ e 8,0 g de glicose em outro tubo.
   Nota: A mistura de pó desses produtos químicos deve ser armazenada em local fresco e seco. A mistura de pó de CaCl₂ e glicose é melhor preparada frescos para evitar a absorção de umidade e aglutinação.
2. Para preparar 200 µ l de 2A de tampão de extração por amostra do sedimento, mistura 100 µ l de extração buffer 2 e 100 µ l de Reagente A da extração da proteína do transmembrane kit (veja B6 na Tabela de materiais).
   Nota: Alíquota uso prolongado os componentes do kit de extração de proteínas transmembrana composto por solução tampão 2, reagente A e coquetel de inibidor de protease em porções de trabalho e armazenamento a-20 º C para. Evite repetidos congelamentos e descongelamentos. Descongele os reagentes à temperatura ambiente (RT) antes do início do processo de extração da pelota.
3. Para preparar uma solução de bicarbonato de amónio (ABC, 100 mM), dissolva 0,39 g de ABC em 50 mL de água desionizada.
4. Para preparar 10 mM 1, 4-ditiotreitol (DTT) solução, dissolver 30 mg de TDT em 20 mL de 100mm ABC.
5. Para preparar a solução de Iodoacetamide (IAA) de 55 milímetros, dissolva 200 mg de IAA em 20 mL de 100mm ABC.
   Nota: IAA deve ser mantido no escuro. Use uma folha de alumínio para embrulhar os tubos com soluções sensíveis à luz.
6. Preparar a solução tampão de tripsina com ABC de 10 mM e 10% (vol / vol) acetonitrila (ACN). Adicione 1,5 mL de tampão de tripsina em um frasco de 20 µ g de tripsina para dissolver seu conteúdo para preparar uma solução de trabalho de tripsina 13 ng / µ l.
   Nota: Sequenciamento da classe modificada tripsina é fornecido liofilizada e deve ser armazenado em-20 ° C até o uso.
7. Para preparar a solução tampão de peptídeo, misture 1:2 (v/v) de ácido fórmico a 5% com o Grupo ACN.
   Nota: Preparar todas as soluções em passos 1.3-1.7 fresco imediatamente antes da utilização e descarte qualquer volume não utilizado.
8. Para preparar a 0,1% o ácido trifluoroacético (TFA), misture 10 µ l de TFA com 10 mL de água desionizada.

2. isolamento de artérias ciliares posteriores curtas

Nota: O olho de suínos é dividido basicamente nas secções posteriores (Figura 2B) eanterior (Figura 2).

1. Coloque o globo de olho em uma câmara de dissecação com solução tampão de K-H gelada. Cuidadosamente cortada muscular circundante e os tecidos com uma afiada tesoura de Mayo.
2. Fazer uma incisão com um bisturi e corte o globo ao longo do plano equatorial com uma afiada tesoura de Mayo até o olho é separado nas metades anteriores e posteriores. Remova como corpo vítreo tanto quanto possível a partir da metade posterior do olho usando um par de pinças padrão.
   Nota: Separação do globo de olho em duas metades facilita o isolamento de sPCA com facilidade sem ter um olho se movendo no prato de dissecação. No entanto, esta etapa não é obrigatória. Os vasos também podem ser isolados sem abrir o globo do olho.
3. Use pinos de dissecação para cuidadosamente o pino para baixo a metade posterior do olho com o lado da retina para baixo e o nervo óptico para cima, para o experimentador.
4. Com cuidado corte os tecidos conectivos ao redor do nervo óptico para expor a vasculatura retrobulbar subjacente com um par de estudante Vannas para primavera.
5. A sPCA pode ser visto como curtos Ramos dos vasos (entre 5-8 filiais) que penetram a esclera e circunferencialmente circundam a cabeça do nervo óptico (Figura 2C). Isole o paraoptic e distal sPCA juntamente com os tecidos conjuntivo circundantes com um par de pinças de precisão 5 tipo e Vannas para Capsulotomia (Figura 2D).
   Nota: Garantir que o buffer de K-H permanece gelado durante todo o processo de isolamento. É altamente recomendável para alterar o buffer cada 20-30 minutos, dependendo da temperatura ambiente.

3. preparação da amostra

1. Suavemente retire os segmentos arteriais usando pinças de precisão ponta extra fina tipo 5 e Vannas para Capsulotomia sob um estereomicroscópio tecidos conjuntivos e enxágue as artérias isoladas em PBS gelado para remover contaminantes e resíduos de sangue.
   Nota: Se as amostras não são submetidas para as próximas etapas imediatamente, snap-congelamento-los em nitrogênio líquido e loja em-80 ° C até utilização posterior.
2. Piscina artérias dos dois olhos para obter um replicar biológica, transferi-los para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e pesar as amostras, usando uma balança analítica.
3. A cada tubo, adicionar uma mistura de grânulos de óxido de zircônio 0,5 e 1,0 mm, seguido pelo reagente de extração de proteína de tecido (T-por; ver B7 na Tabela de materiais).
   Nota: O volume de T-PER é depende do peso das amostras em cada tubo, com uma proporção de 1 mL de reagente de 50 mg de amostra. Regra geral do polegar para seguir ao carregar tubos para homogeneização é uma relação de volume de 1:1:2 = amostra: grânulos: T-PER(Figura 3). Não use muito grande um volume de buffer de extração e muito pouco uma quantidade de grânulos para evitar homogeneização ineficiente.
4. Carregar os tubos de amostra em um homogeneizador de liquidificador (ver D6 na Tabela de materiais). Ajuste o temporizador para nível 2 min e velocidade 6 e começar a homogeneização. Após a execução, seleção de amostras para completa homogeneização e repetir o ciclo até as amostras são completamente homogeneizado (Figura 3B).
   Nota: Um total de 24 tubos de amostra pode ser homogeneizado em uma corrida. É importante manter as amostras frio durante o processo de homogeneização para minimizar a desnaturação da proteína. O homogenizador de liquidificador bala usado neste estudo tem uma característica inerente de refrigeração que mantém as amostras frio. Em casos onde nenhum recurso de refrigeração interno está disponível no homogeneizador, as amostras podem ser mantidas no gelo entre cada execução.
5. Pipete cuidadosamente homogeneizado para tubos de microcentrifuga fresco. Centrifugar as amostras a 10.000 x g por 20 min a 4 ° C para proteínas insolúveis e sobrenadante separado contendo proteínas solúveis de Pelotas. Cuidadosamente Pipete fora o sobrenadante para tubos microcentrifuga fresco sem tocar a camada de sedimento (Figura 3C).
   Nota: Tanto o sobrenadante e sedimento podem ser armazenados em-80 ° C até utilização posterior.

4. pelota digestão

1. Adicione 200 µ l de 2A de tampão de extração e 5 µ l de coquetel de inibidor de protease para cada amostra de sedimento. Suspenda o sedimento várias vezes com uma pipeta.
   Nota: Misture os reagentes de extracção, bem antes de adicionar a pelota. Mantenha 2A de tampão de extração no gelo e o inibidor de protease RT durante todo o processo de extração.
2. Use um homogeneizador ultra-sônico para homogeneizar completamente a pelota.
   1. Defina a amplitude de ciclo para 1 e 60. Use uma sonda de titânio (Ø 0,5 mm, 80 mm de comprimento), que é apropriado para homogeneização de amostras com volumes pequenos (10-500 µ l).
   2. Mergulhe a sonda a pelota e extração mistura do buffer e pressione a tecla start para expor a amostra de ondas ultra-sônicas.
   3. Proceda à sonicação a amostra até as touceiras de sedimento são completamente homogeneizadas. Uma pausa de alguns segundos entre cada sonication.
   4. Verifique visualmente completa homogeneização. Misture o homogenate várias vezes com uma pipeta para garantir que não há nenhum aglomerados.
      Nota: O procedimento de extração de pelota deve efectuar-se no gelo para evitar a desnaturação da proteína devido ao calor gerado durante a homogeneização (Figura 4).

5. limpeza da amostra e troca de Buffer

1. Use dispositivos de filtro centrífugo com corte 3 kDa (ver D3 na Tabela de materiais) para que este procedimento de acordo com as instruções do fabricante com modificações quando aplicável. Primeiro, insira a unidade de filtro em um tubo de microcentrifugadora (fornecido no pacote de filtro).
2. Pipetar 200 µ l de amostra homogeneizado para dispositivo de um filtro e adicionar 200 µ l de água deionizada para o mesmo filtro. Cap-lo de forma segura (Figura 5A).
3. Coloque a unidade de filtro em uma centrífuga e rotação para 14.000 x g por 15 min a 4 ° C.
4. Retire o dispositivo do centrifugador e separar a unidade de filtro contendo a amostra concentrado do tubo microcentrifuga contendo o filtrado. Descarte o filtrado (Figura 5B).
5. Reconstitua o concentrado pela adição de 400 µ l de água deionizada para a unidade de filtro. Repita os passos de 5.3 e 5.4 três vezes. Pipete cuidadosamente o concentrado de amostra 'limpo' para um microtubo limpo.
   Nota: Normalmente, uma amostra de 200 µ l bruto renderá ~ 50-70 µ l de concentrado após filtração.
6. Repita as etapas 5.1-5.5 para as restantes homogenates de amostra.

6. a proteína medição

1. Use o ensaio da proteína bicinchoninic ácido (BCA) kit (veja B5 na Tabela de materiais) para determinar as concentrações de proteína das frações sobrenadante e sedimento das amostras sPCA em um leitor de placa.
2. Prepare as diluições (BSA) padrão de albumina (final BSA concentrações variam entre 25 a 2.000 µ g/mL) a partir de uma ampola de 1 mL, compreendendo 2 mg/mL BSA, de acordo com as instruções do fabricante.
3. Pipete 10 µ l de cada diluição padrão BSA e amostra Replica (sobrenadante e sedimento) em cada poço de uma microplaca de 96 poços de fundo plano.
4. Preparar o BCA trabalhando reagente adicionando 50 partes do BCA Reagente A para 1 parte de BCA reagente B.
   Nota: Calcular o volume total de reagente de trabalho necessário para cada medição antes da preparação e fresco, prepare-se volume suficiente com base no número de amostras e diluições padrão para ser analisada.
5. Cuidadosamente, pipete 200 µ l de BCA trabalhando reagente para cada poço. Cobrir a microplaca e incubar a 37 ° C por 30 min. Após refrigerar a placa de RT, medir a absorvância a 562 nm em um leitor de placas (ver D13 na Tabela de materiais).
6. Com base na curva padrão gerada para cada concentração de padrão BSA (µ g/mL), determine as concentrações de proteína das amostras.

7. eletroforese em Gel de unidimensional (1DE)

1. Prepare as amostras para 1DE conforme mostrado na tabela 1 (para um exemplo). Misture a mistura da amostra com uma pipeta. Aquecer as amostras a 70 ° C durante 15 min e frio para RT
2. Prepare o tampão de corrida 1x, adicionando 50 mL de tampão de executando de SDS de MES de 950 mL de água desionizada. Misture bem.
3. Prepare pré-moldado 4-12% géis de proteína de Bis-Tris (ver B4 na tabela de materiais).
   1. Abri a bolsa plástica para remover a fita de gel e enxaguar a gaveta com água desionizada.
   2. Remova o pente fora a fita de gel em um movimento fluido, tomando cuidado para não danificar os poços.
   3. Lave suavemente os poços de carregamento 2 - 3 vezes com tampão de corrida usando uma pipeta 1x. Inverter e agite suavemente a fita de gel para remover o tampão, garantindo que lá não há bolhas de ar nos poços.
   4. Remova a fita branca na parte inferior das fitas de gel.
4. Inserir geles (máximos duas gavetas) no gel executando o tanque e depois de totalmente montada, tranque a gel de cunha de tensão.
5. Preencher o buffer superior (cátodo) de câmara com 200 mL de tampão de correr até os poços são completamente cobertos. Verifique se há qualquer vazamento.
6. Adicionar 500 µ l de antioxidante (ver A14 na Tabela de materiais) para o Buffer de execução.
   Nota: O antioxidante é um reagente de decoro que deve ser usada com amostras reduzidas com agente redutor (veja tabela 1) para manter as condições de redução durante a electroforese e para evitar a re-oxidação de aminoácidos sensíveis tais como o triptofano e metionina.
7. Cuidadosamente carrega 50 µ g de amostra por raia usando uma pipeta. Em seguida, carregar o padrão de proteína pre-manchado como um marcador de massa molecular (ver A18 na Tabela de materiais).
8. Encha a câmara inferior do amortecedor (ânodo) com 600 mL de tampão de execução.
9. Execute o gel para ~ 60 min com uma tensão constante de 175 V. No final da corrida, remova cuidadosamente o gel da placa de gaveta, usando uma faca de gel.
10. Transferi com cuidado os geles para um gel caixa de coloração.
    1. Prepare a solução de fixação fresco com base no número total de géis que precisam ser marcadas, de acordo com as instruções do fabricante conforme descrito na tabela 2.
    2. Agite os geles na solução de fixação durante 10 minutos a RT em uma plataforma de balanço.
11. Descartar a solução de fixação e manchar o gel coloidal Blue kit de coloração.
    1. Preparar a coloração fresca de soluções com base no número total de géis que precisam ser manchado, de acordo com as instruções do fabricante conforme descrito na tabela 3.
    2. Em primeiro lugar, medir o volume adequado e misturar diretamente os componentes marcados com um asterisco (*) no gel caixa de coloração. Agite os geles na solução de coloração sem Stainer B durante 10 minutos a RT em uma plataforma de balanço.
    3. Adicionar corante B diretamente para a coloração caixa contendo o * solução de coloração. Certifique-se de agitar Stainer B bem antes de usar.
       Atenção: Realize as etapas de preparação 7.10.1 e 7.11.1 sob uma coifa.
12. Agite os geles na solução de coloração durante a noite para melhores resultados globais.
    Nota: As bandas impregnadas tornará visíveis dentro de 10 min após a adição de corante B. coloração requer um mínimo de 3 h e a intensidade não varia se deixado por mais horas na solução de coloração.
13. Cuidadosamente, decantar a solução de coloração e substituir com 200 mL de água desionizada. Agite os geles pelo menos 7-8 h em água para limpar o fundo.
    Nota: Água desionizada deve ser alterada várias vezes durante o procedimento de descoloração é melhor remover mancha excessiva. Os geles também podem ser deixada em água durante 3 dias sem comprometer a intensidade de banda de proteína. Se os geles não submetido imediatamente para as próximas etapas, pode ser armazenado em solução de sulfato de amônio 20% em 4 ° C para armazenamento a longo prazo.

8. em-gel digestão Tryptic

Nota: Este protocolo é de acordo com o método por Shevchenko et al.¹⁷, com pequenas modificações. Esse procedimento deve ser realizado em um fluxo laminar capota e usar conjunto dedicado de pipetas, dicas, tubos e vidraria especificamente para esta finalidade. Use luvas e vestuário adequado laboratório em todos os momentos para evitar a queratina e outras sujidades. Prepare todas as soluções e os reagentes utilizados neste procedimento pouco antes da utilização.

1. Impostos especiais de consumo das bandas de proteínas do gel com lâminas do micrótomo limpo, novo. Corte a banda em pedaços pequenos (aproximadamente 1 x 1 mm a 2 mm x 2 mm). Transferi com cuidado os pedaços de gel para tubos de 1,5 mL microcentrifuge.
   Nota: Peças que são demasiado pequenas podem entupir pontas de pipetas e pedaços maiores reduzirá a recuperação do peptide. Tenha cuidado ao utilizar lâminas de micrótomo, que são extremamente afiadas.
2. Descoloração
   1. Adicionar 500 μL de solução de descoloração 100mm ABC solução/ACN (1:1, v/v) e incubar as amostras na RT por 30 min com agitação ocasional ou num Vortex.
   2. Cuidadosamente a pipeta a descoloração da solução. Verifique visualmente qualquer tubos com mancha residual. Repita a etapa 8.2.1 se gel de peças ainda estão manchadas de azuis.
3. Redução e alquilação
   1. Adicionar ~ 400 µ l de solução recentemente preparada de TDT e incubar a 56 ° C por 30 min. Certifique-se de que a solução cobre completamente os pedaços de gel. Cuidadosamente, pipetar a solução redutora e descarte.
   2. Adicionar ~ 400 µ l de solução recentemente preparada de IAA e incubar no escuro em RT por 30 min. Retire os alquilantes buffer com uma pipeta e descarte.
4. Digestão
   1. Adicione 500 µ l de ACN puro no RT para 10-15 min até os pedaços de gel de encolhem e tornar-se opaca. Pipetar para fora do Grupo ACN e secar peças de gel por 5-10 min sob o capô.
   2. Pipete 50 µ l de solução de tripsina em cada tubo para cobrir completamente os pedaços de gel. Incube os tubos em 4 ° C por 30 min.
   3. Depois de 30 min, verificar cada tubo se toda solução de tripsina foi absorvida pelos pedaços de gel. Adicione um volume suficiente de buffer de tripsina (50-100 µ l, dependendo do volume do tubo) para cobrir completamente os pedaços de gel, se necessário. Incubar as amostras durante a noite a 37 ° C.
5. Extração de peptídeo
   1. Pipete cuidadosamente a solução de peptídeo extraído da transferência para limpar microtubos e tubos. Seque o sobrenadante em um evaporador a vácuo centrífugo.
      Nota: Não jogue fora as peças restantes do gel.
   2. Adicionar 100 µ l de tampão de extração (consulte a etapa 1.7) a cada tubo e incubar durante 30 min a 37 ° C, com agitação.
   3. Pipetar o sobrenadante para os mesmos microtubos contendo os peptídeos extraídos de acordo com as respectivas bandas e secar para baixo em uma centrífuga a vácuo.
      Nota: Se não usado imediatamente, extratos secos de peptídeo podem ser armazenados em-20 ° C até diversos meses até utilização posterior.

9. peptídeo purificação

Nota: Este procedimento de dessalinização e purificação de amostra do peptídeo é realizado com o uso de pontas de pipetas C₁₈ (ver C15 na Tabela de materiais). Use uma ponta nova para cada amostra.

1. Prepare o seguinte fresh soluções em tubos de centrifuga conico e alíquota para tubos de microcentrifuga de 2 mL para o processo de purificação do peptide, conforme mostrado na tabela 4. Um resumo dos tubos para a purificação de peptídeo é a seguinte: uma (solução amostra), de tubo tubo B (solução de umectação), tubo C (solução de equilíbrio), tubo D (solução de lavagem), E tubo (solução de eluição), tubo F (um vazio 2 mL ou 5 mL microcentrifuga tubo, dependendo da o número de amostras a ser limpo, para eliminação de resíduos) e o tubo G (um microtubo limpo, vazio, capacidade 0,2 mL).
2. Reconstituir extratos secos do peptide da etapa 8.6.3 com 10 µ l de 0,1% TFA. Este tubo é designado tubo A.
3. Proceda à sonicação tubos A em um banho ultra-sônico com gelo por 5 min.
4. Spin para baixo a solução da amostra em uma centrífuga de bancada a 1.000 x g por 1 min.
5. Ajuste uma micropipeta P10 para o volume máximo de 10 µ l e anexar uma ponta da pipeta C₁₈ firmemente.
6. Mergulhe a ponta da pipeta na solução de umectação (tubo B) e Aspire cuidadosamente para o material de embalagem. Lentamente dispense os resíduos em tubo F. Repita este passo pelo menos 7 - 8 vezes.
   Nota: Pressione o êmbolo de pipeta capim pela raiz e libere lentamente ou dispensar o êmbolo durante todo o procedimento. Tome precauções para não introduzir bolhas de ar nas dicas durante a pipetagem para garantir a ligação peptídica máxima à coluna C18.
7. Equilibrar a ponta para ligação peptídica por aspiração 10 µ l solução de equilíbrio no tubo C. descarte a solução e repita este procedimento 3 a 4 vezes.
8. Em seguida, aspirar e dispensar a solução de amostra no tubo A várias vezes (dependendo da espessura de banda de gel correspondente) para vincular os peptídeos de ponta coluna.
   Atenção: A aspiração e dispensação passos durante o processo de vinculação (etapa 9,8) são realizados dentro do tubo A. Não dispense a solução de amostra para o lixo.
9. Lave a ponta da pipeta C₁₈ por aspirar a solução de lavagem no tubo D e descartá-lo para resíduos (tubo F) 4 a 5 vezes.
10. Finalmente, eluir os peptídeos ligados por pipetagem a solução de eluição (E tubo) e dispensa o eluente para tubo de G.
11. Repita as etapas de toda 2 a 3 ciclos por exemplo para aumentar a recuperação de amostra.
12. Descartar a ponta após a purificação de uma amostra e usar uma nova dica para a próxima amostra.
13. Seque os eluídos peptídeo purificado em um concentrador a vácuo.
    Nota: As amostras purificadas agora estão prontas para análises de LC-MS/MS no sistema LC-ESI-LTQ-Orbitrap MS. Armazene as amostras secas em-20 ° C até utilização posterior.

10. líquida cromatografia-electrospray análises de ionização-MS/MS

Nota: Análise proteômica quantitativa rótulo livre é realizado em um sistema de MS de ionização-linear ion trap-Orbitrap (LC-ESI-LTQ Orbitrap) cromatografia líquida-electrospray. A LC é composto de bomba quaternária Rheos Allegro, equipada com um desgaseificador on-line (acoplado a um mostruário de HTS PAL e o sistema é composto por uma 30 x 0,5 mm C₁₈ pré-coluna ligada a uma coluna de₁₈ 150 x 0,5 mm C. Uso inverter a fase aquosa A solvente consistindo de água de grau de LC-MS com 0,1% (v/v) de ácido fórmico e B solvente orgânico, consistindo de acetonitrila grau de LC-MS com 0,1% (v/v) de ácido fórmico. Use o gradiente com um tempo de execução de 60 min por gel de banda, conforme descrito em detalhes no nosso anterior estudos^6,16.

1. Dissolver as amostras purificadas peptídeo em 10 µ l de 0.1% TFA. Proceda à sonicação as amostras no gelo por 5 min.
2. Pipetar 10 amostras µ l para uma placa de 96 V-fundo e selar com um filme de capa clara, autoadesivo.
3. Transfira a placa para o mostruário.
4. Use o seguinte gradiente para cada tempo de execução de 60 min: 0-35 min (15-40% solvente B), 35-40 min (40-60% solvente B), 40-45 min (60-90% solvente B), 45-50 min (90% solvente B), 50-53 min (90-10% solvente B) e 53-60 min (10% de solvente B).
5. Use as seguintes condições de espectrometria de massa do instrumento: modo de ionização do íon positivo electrospray, tensão do pulverizador (2.15 kV), temperatura capilar (220 ° C), modo de aquisição de dados dependentes, aquisição automática de comutação entre Orbitrap-MS e LTQ MS/MS, resolução orbitrap (30.000), faixa de m/z (300 a 1.600), alvo automático ganho de controle (AGC, 1,0 x 10⁶ íons), recalibração interna (polydimethlycyclosiloxane [PCM] no 445.120025 íons de m/z em tempo real), bloquear massa opção habilitada no modo de MS, dados em tandem obtidos selecionando o top 5 mais intensa precursor íons, fragmentação por dissociação induzida por colisão (CID), normalizada ainda mais energia de colisão (NCE, 35% com tempo de ativação de 30 ms com contagem de repetição de 3) e duração de exclusão dinâmica (600 s).
   Nota: Os íons resultantes fragmentados são registrados do LTQ.
6. Execução biológica pelo menos três repetições para cada amostra.

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Resultados

Amostra limitada disponibilidade é uma das principais desvantagens na pesquisa oftálmica. Correspondentemente, métodos de extração para proteína ideal rendem de pequenas quantidades de amostras, tais como vasos oculares são muitas vezes discutíveis. Até o momento, há uma escassez de métodos servidos particularmente para a extração da proteína dos vasos sanguíneos retrobulbar. Portanto, como um primeiro passo na otimização de método e como um prova de princípio para comp...

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Discussão

Proteome abrangente de perfil de uma variada gama de amostras oculares é um primeiro passo importante e indispensável para elucidar os mecanismos moleculares e vias de sinalização implicadas na saúde e na doença. Para obter dados de alta qualidade e garantir a reprodutibilidade dos resultados obtidos a partir dessas análises, as etapas de preparação de amostra anterior são cruciais, como destacado em uma revisão por Matos et al. que discutiu em profundidade os procedimentos de processamento de amostra para dif...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	1.11474
Calcium chloride dihydrate (CaCl2)	Carl Roth	5239.1	2.5 mM
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190169
Formic acid (CH2O2)	AppliChem	A0748
HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N)	AppliChem	A1605
HPLC-grade methanol (CH3OH)	Fisher Scientific	M/4056/17
HPLC-grade water	AppliChem	A1589
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I6125
Kalium chloride (KCl)	Carl Roth	6781.1	4.7 mM
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth	3904.2	1.2 mM
LC-MS-grade acetic acid	Carl Roth	AE69.1
Magnesium sulphate (MgSO4)	Carl Roth	261.2	1.2 mM
NuPAGE Antioxidant	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0005
NuPAGE LDS Sample buffer	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0007	4x
NuPAGE MES SDS Running Buffer	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0002	20x
NuPAGE Sample reducing agent	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0004	10x
SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	LC5925
Sequencing grade modified trypsin	Promega	V5111
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	9265.2	118.3 mM
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Carl Roth	965.3	25 mM
Trifluoroacetic acid (TFA,  C2HF3O2)	Merck Millipore	108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate	Carl Roth	6780.1	11 mM
B. Reagents and Kits
0.5 mm zirconium oxide beads	Next Advance	ZROB05
1.0 mm zirconium oxide beads	Next Advance	ZROB10
Colloidal Blue Staining  Kit	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	LC6025	To stain 25 mini gels per kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gels	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	NP0321BOX	1.0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEK	Merck Millipore	71772-3	20 reactions per kit
Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER)	Thermo Scientific	78510
C. Tools
96-well V-bottom plates	Greiner Bio-One	651180
Corning 96-well flat-bottom plates	Sigma-Aldrich	CLS3595-50EA
Disposable microtome blades	pfm Medical	207500014
Disposable scalpels #21	pfm Medical	200130021
Dissection pins	Carl Roth	PK47.1
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Falcon conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
Mayo scissors, Tough cut	Fine Science Tools	14130-17
Precision tweezers	Fine Science Tools	11251-10	Type 5
Precision tweezers, straight with extra fine tips	Carl Roth	LH53.1	Type 5
Self-adhesive sealing films for microplates	Ratiolab (vWR)	RATI6018412
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12
Student Vannas spring scissors	Fine Science Tools	91501-09
Vannas capsulotomy scissors	Geuder	19760	Straight, 77 mm
ZipTipC18 pipette tips	Merck Millipore	ZTC18S096
D. Equipment and devices
150 × 0.5 mm BioBasic C18 column	Thermo Scientific, Rockford, USA	72105-150565
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column	Thermo Scientific, Rockford, USA	72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices	Merck Millipore	UFC500396	Pack of 96.
Analytical balance	Sartorius	H51
Autosampler	CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland	HTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm	Next Advance	NA-BB-25
Eppendorf concentrator, model 5301	Sigma-Aldrich	Z368172
Eppendorf microcentrifuge, model 5424	Fisher Scientific	05-403-93	Non-refrigerated
Heraeus Primo R Centrifuge	Thermo Scientific	75005440	Refrigerated
Labsonic M Ultrasonic homogenizer	Sartorius	BBI-8535027
LC-MS pump, model Rheos Allegro	Thermo Scientific, Rockford, USA	22080
LTQ Orbitrap XL mass spectrometer	Thermo Scientific, Bremen, Germany
Multiskan Ascent plate reader	Thermo Labsystems	v2.6
Rotator with vortex	neoLab	7-0045
Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long)	Sartorius	BBI-8535612
Ultrasonic bath, type RK 31	Bandelin	329
Xcell Surelock Mini Cell	Life Technologies	El0001