JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Характеристика протеома глазной микрососудистой кровати имеет решающее значение для глубокого понимания многих глазной патологии в организме человека. Это исследование показывает, эффективный, быстрый и надежный метод для извлечения белков и подготовки проб из мелких кровеносных сосудов, используя свинину короткие задней цилиарной артерии как модель судов для масс спектрометрии основе протеомики анализов.

Аннотация

Использование изолированной глазной кровеносных сосудов в пробирке расшифровать патофизиологических состояние глаз, используя передовые технологические подходы значительно расширил наше понимание некоторых заболеваний. Масс-спектрометрия (МС)-на основе протеомики стала мощным инструментом, чтобы разгадать изменения в молекулярных механизмов и белка, сигнальные пути в сосудистой кровати в здоровье и болезни. Однако решающее значение для получения воспроизводимых результатов и углубленного разъяснения сложных протеома шаги подготовки образца до MS анализы. Это особенно важно для приготовления глазных микрососудов, где количество образцов, доступных для анализа часто ограничено и таким образом, представляет собой вызов для оптимального белка добычу. Эта статья стремится обеспечить эффективный, быстрый и надежный протокол для пробоподготовки от образцового ретробульбарная глазной сосудистого русла, используя свинину короткие задней цилиарной артерии. Настоящий метод фокусируется на процедур извлечения белков от супернатант и Пелле образца после гомогенизации, образец очистки с центробежным фильтром устройства до очистки электрофореза и пептида одномерный гель шаги для количественного определения свободной этикетки в системе MS ионизации линейной ионной ловушки Орбитрэп жидкость хроматографии электроспрей. Хотя этот метод был разработан специально для протеомики анализов глазной микрососудов, мы также предоставили убедительные доказательства того, что он может также легко применяться для других образцов ткани.

Введение

Улучшения в области протеомики, какие разрешения интегрированы и непревзойденную мощность сбора данных, значительно изменила наше понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе определенных условий болезни, а также как отражающие физиологического состояния определенной ячейке населения или ткани1,2,3,4. Протеомика также оказалась важной платформой в офтальмологических исследований из-за чувствительности и объективного анализа различных глазных образцов, которые способствовали выявлению потенциальных болезней маркеров для окончательного диагноза и прогноза, как подтверждается элегантно многих исследований в последние годы, в том числе некоторые из наших1,5,6,,78,9,10. Однако часто трудно получить человека образцы для протеомных анализов этическим причинам, особенно учитывая необходимость контроля материалов от здоровых лиц для надежной сравнительного анализа. С другой стороны это также сложно получить достаточное количество образцов для оптимального и надежный масс-спектрометрических анализа. Это особенно важно для массы ограниченной биологических материалов, таких как микро кровеносных сосудов глаза. Один из таких крупных ретробульбарная кровеносных сосудов, что играет ключевую роль в регуляции глазной кровотока является короткий задний цилиарной артерии (sPCA). Любое возмущений или аномалии в этом сосудистого русла может привести к тяжелой клинические последствия, которые могут привести к патогенезу несколько прицел опасных заболеваний, таких как глаукома и nonarteritic передней ишемической оптической невропатии (NAION)11 , 12. Однако, есть отсутствие исследований, изучение протеома изменения в этом артериальной постели из-за вышеупомянутых недостатков. Таким образом в последние годы, дом свиньи (Sus scrofa domestica Linnaeus, 1758) стала хорошей модели на животных, в офтальмологических исследований благодаря высокой морфологических и филогенетических сходства между люди и свиньи в13, 14,15. Свинину глазной образцы легко доступны, и самое главное, более точное представление о тканях человека.

Учитывая важную роль этих кровеносных сосудов в глаз, а также нехватка методологии, удовлетворяются за эффективным белка извлечения и анализа от этих микрососудов мы ранее характеризовались протеома свинину sPCA, с использованием собственного Протокол, что привело к идентификации большое количество белков16. На основе этого исследования, мы далее оптимизированный и описал углубленного Наша методология в этой статье, которая позволяет протеома анализ от мизерных количествах образцов, используя свинину sPCA как модель ткани. Хотя основной целью данного исследования было установить MS-совместимых методологии для масс ограниченной глазной кровеносных сосудов, мы обеспечили существенные экспериментальные доказательства того, что описывается рабочий процесс может широко применяется также для различных образцов ткани.

Предполагается, что этот процесс будет способствовать для подготовки образцов MS-совместимых высокого качества от небольших количествах материалов для анализа всеобъемлющих протеома.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры с использованием животных образцы были выполнены в строгом соответствии с Ассоциацией исследований в видении и офтальмологии (Арво) заявление для использования животных в глазной и видение исследований и институциональных руководящих принципов. Это исследование было проведено и одобрены на отделение офтальмологии, Университет медицинского центра Майнца.

Примечание: Свинину глаза вместе с зрительного нерва и экстраокулярных тканей были получены свежие из местных скотобойни сразу после смерти. Энуклеированные глаза были доставлены в лабораторию в ледяной фосфатный буфер (PBS) и использованы немедленно. Схематический обзор рабочего процесса, работу, как показано на рисунке 1.

1. решения

  1. Подготовить Кребса-Henseleit (K-H) буфера, весят следующие химические вещества (27.68 г NaCl, 8.4 g NaHCO3, 1,4 г KCl, 1,18 г MgSO4и 0,64 г х2PO4) в один сухой и чистой 50 мл конические пластиковых пробирок и , 1.47 g CaCl2 и 8,0 г глюкозы в другую трубу.
    Примечание: Смесь порошка этих химических веществ должны храниться в прохладном и сухом месте. Смесь порошка CaCl2 и глюкозы лучше всего свеже предотвратить поглощение влаги и слипания.
  2. Подготовить 200 мкл извлечения буфер 2A на пеллетах сэмпл, смесь 100 мкл извлечения буфер 2 и 100 мкл Реагента A от добычи белка трансмембранного комплекта (см. В6 в Таблице материалы).
    Примечание: Аликвота компоненты комплекта экстракции белка трансмембранного составе извлечения буфер 2, реагент A и ингибитор протеазы коктейль в рабочей части и хранить при-20 ° C для длительного использования. Избегайте повторного замораживания и оттаивания. Оттепель реагенты до комнатной температуры (RT) до начала процедуры извлечения Пелле.
  3. Для приготовления раствора бикарбоната аммония (ABC, 100 мм), растворяют 0,39 г ABC в 50 мл деионизованной воды.
  4. Подготовить 10 мм 1, 4-Дитиотреитол (DTT) решение, растворяют 30 мг DTT в 20 мл 100 мм ABC.
  5. Подготовить 55 мм раствор Iodoacetamide (IAA), растворяют 200 мг в 20 мл 100 мм ABC МАА.
    Примечание: IAA должны храниться в темноте. Используйте алюминиевой фольги для упаковки труб с светочувствительные решения.
  6. Подготовить трипсина буфер, содержащий ABC 10 мм и 10% (vol / vol) Ацетонитрил (АКС). Добавьте 1,5 мл буфера трипсина в один флакон 20 мкг трипсина распустить его содержание подготовить рабочий раствор трипсина 13 нг/мкл.
    Примечание: Последовательность класса изменения трипсина поставляется лиофилизированные и должны храниться в-20 ° C до использования.
  7. Подготовить пептид извлечения буфер, смешайте 1:2 (v/v) 5% муравьиной кислоты с АКС.
    Примечание: Подготовить все решения в шагах 1,3-1,7 свежие непосредственно перед использованием и отменить любые неиспользованные объемы.
  8. Подготовить 0,1% trifluoroacetic кислоты (ТФК), Смешайте 10 мкл TFA с 10 мл деионизованной воды.

2. изоляция короткий задний цилиарных артерий

Примечание: Свинину глаз в основном делится на передней (рисA) и задней секции (рис. 2B).

  1. Место глаз глобус в камере рассечение, содержащие ледяной K-H буфера. Тщательно Отрежьте окружающих мышц и тканей с острыми ножницами Mayo.
  2. Сделать надрез с помощью скальпеля и вырезать глобус в экваториальной плоскости с острыми ножницами Mayo, до тех пор, пока глаза разделяется на передней и задней половинок. Удалите, как много стекловидного тела как можно дальше от задней половине глаза с помощью пары стандартный шаблон щипцов.
    Примечание: Не имея движущихся глаз в блюдо рассечение разделение земного шара глаз на две половинки облегчает изоляции sPCA с легкостью. Однако этот шаг не является обязательным. Судов могут быть изолированы также без открытия глаз глобус.
  3. Использование вскрытия ПИН тщательно pin вниз в задней части глаза с сетчатки стороной вниз и вверх к экспериментатору зрительного нерва.
  4. Аккуратно отрежьте соединительной тканей, окружающих зрительного нерва для предоставления базовой сосудистую ретробульбарная с беззаботными Студенческая весна ножницами.
  5. SPCA можно рассматривать как короткие ветви судов (между ветвями 5-8), которые проникают склеры и окружности вокруг головы зрительного нерва (рис. 2C). Изолируйте paraoptic и дистальной sPCA вместе с окружающей соединительной ткани с парой тип 5 точности пинцета и беззаботными Капсулотомия ножницы (Рисунок 2D).
    Примечание: Убедитесь, что K-H буфера остается ледяной на протяжении всей процедуры изоляции. Настоятельно рекомендуется изменить буфера каждые 20-30 мин, в зависимости от температуры окружающей среды.

3. Пробоподготовка

  1. Осторожно удалить соединительной ткани из артериальной сегментов, используя дополнительные острым концом типа 5 пинцеты прецизионные и беззаботными Капсулотомия ножницы под стереомикроскопом и промыть изолированных артерий в ледяной PBS для удаления загрязнений и остатков крови.
    Примечание: Если образцы не подвергаются следующие шаги сразу, snap заморозить их в жидком азоте и хранить в-80 ° C до дальнейшего использования.
  2. Бассейн артерии от два глаза, чтобы получить один из биологических реплицировать, перенести их в 1,5 мл microcentrifuge трубы и взвесить образцы с помощью аналитического баланса.
  3. Для каждой трубы, добавьте смесь 0,5 мм и 1,0 мм Бусины оксида циркония, следуют ткани белка добычу реагента (T-за; см. B7 Таблица материалов).
    Примечание: Объем T-за зависит от веса образцов в каждой тюбике с соотношением 1 mL реагента до 50 мг образца. Общее правило большого пальца следовать при загрузке трубы для гомогенизации тома в соотношении 1:1:2 = Образец: бисер: T-за (рисA). Не используйте слишком большой объем добычи буфера и слишком мало количество бисера для предотвращения неэффективного гомогенизации.
  4. Загрузить образец трубки в блендере гомогенизатора (см. D6 в Таблице материалы). Установите таймер на 2 мин и скорость уровня 6 и начать гомогенизации. После запуска, проверьте образцы для полной гомогенизации и повторите цикл до образцы полностью гомогенизированные (рис. 3B).
    Примечание: В общей сложности 24 пробоотборные трубки можно гомогенизированные за один проход. Важно сохранить образцы холодного во время гомогенизации процедуры для сведения к минимуму денатурации белков. Гомогенизатор блендер пули, используемые в данном исследовании имеет присущие охлаждения функция, которая сохраняет образцы холодного. В тех случаях, когда нет внутреннего охлаждения особенность в гомогенизатор образцы могут храниться на льду между каждого запуска.
  5. Тщательно Пипетка огневки в свежие microcentrifuge трубы. Центрифугуйте образцы на 10000 x g 20 мин при 4 ° C для пеллет нерастворимые белки и отдельные супернатанта, содержащего растворимые белки. Тщательно Пипетка, супернатант в свежие microcentrifuge трубы без касатьться Пелле слой (рис. 3C).
    Примечание: Супернатант и гранулы могут храниться в-80 ° C до дальнейшего использования.

4. Пелле пищеварение

  1. Добавьте 200 мкл извлечения буфер 2A и 5 мкл ингибитора протеазы коктейль для каждого образца Пелле. Приостановите Пелле несколько раз с пипеткой.
    Примечание: Смешайте реактивы извлечения хорошо перед добавлением гранул. Держите извлечения буфер 2A на льду и ингибитор протеазы на RT на протяжении всей процедуры извлечения.
  2. Используйте ультразвуковой гомогенизатор для полностью гомогенизировать гранулы.
    1. Значение амплитуды цикла 1 и 60. Используйте зонд из титана (Ø 0,5 мм, длиной 80 мм), который подходит для гомогенизации образцов с небольшими объемами (10-500 мкл).
    2. Погружать зонд в буфер смесь гранул и извлечения и нажмите кнопку Пуск, чтобы разоблачить образца для ультразвуковых волн.
    3. Sonicate образец до тех пор, пока сгустки гранулах полностью гомогенизации. Сделать паузу на несколько секунд между каждым sonication.
    4. Визуально проверьте для полной гомогенизации. Смешайте огневки несколько раз с пипеткой обеспечить, что есть нет сгустки.
      Примечание: Процедура извлечения Пелле должен осуществляться на льду во избежание денатурации белков из-за тепла во время гомогенизации (рис. 4).

5. Пример очистки и буфера обмена

  1. Используйте центробежного фильтра устройства с 3 кДа отсечки (см. D3 в Таблице материалы) для выполнения этой процедуры в соответствии с инструкциями производителя с изменениями там, где это применимо. Во-первых Вставьте фильтр microcentrifuge трубки (предоставляется в пакет фильтров).
  2. Пипетка 200 мкл пример огневки до одного фильтра устройства и 200 мкл обессоленной воды в тот же фильтр. Крышка надежно (рис. 5A).
  3. Установите фильтр в центрифуге и спина для 14.000 x g 15 мин при 4 ° C.
  4. Удалите устройство из центрифуги и отдельные фильтр, содержащий образец концентрата из microcentrifuge трубка, содержащая фильтрата. Выбросите фильтрата (рис. 5B).
  5. Воссоздать концентрат, добавив 400 мкл обессоленной воды в фильтр. Повторите шаги 5.3 и 5.4 три раза. Тщательно Пипетка концентрат «уборка» образца в чистой микропробирок.
    Примечание: Как правило, 200 мкл пример сырой даст ~ 50-70 мкл концентрированного препарата после фильтрации.
  6. Повторите шаги 5.1 5.5 для оставшихся гомогенатах образца.

6. белка измерения

  1. Используйте bicinchoninic кислоты assay протеина (BCA) комплект (см. B5 в Таблице материалы) для определения концентрации белка супернатант и Пелле фракций sPCA образцов на тарелку читателя.
  2. Подготовьте Стандартный (BSA) разведений альбумина (окончательный БСА концентрации диапазоне от 25 до 2000 мкг/мл) от одной ампулы 1 мл, состоящий из 2 мг/мл BSA, согласно инструкциям производителя.
  3. Пипетка 10 мкл каждого стандарта разведения BSA и пример реплицирует (супернатант и Пелле) в каждой скважине плоскодонные 96-луночных микропланшетов.
  4. Подготовить BCA работает реагента, добавляя 50 частей BCA реагента A 1 часть BCA реагент б.
    Примечание: Вычислить суммарный объем рабочего реагента, необходимых для каждого измерения до подготовки и свежезаваренным подготовить основанный на количество образцов и стандартных растворов, чтобы быть assayed достаточного объема.
  5. Тщательно Пипетка 200 мкл BCA Рабочая реагента в каждой скважине. Обложка микроплиты и инкубировать при 37 ° C за 30 мин. После охлаждения пластины для RT, измерения поглощения в 562 Нм на тарелку читателя (см. D13 в Таблице материалы).
  6. На основе стандартной кривой генерируется для каждой стандартной концентрации BSA (мкг/мл), определите концентрацию белка образцов.

7. одномерный гель-электрофорез (1DE)

  1. Подготовьте образцы для 1DE, как показано в таблице 1 (для одного образца). Смешайте смесь образца с пипеткой. Тепло образцов при 70 ° C 15 мин и здорово RT.
  2. Подготовка 1 x работает буфер, добавляя 50 мл буфера под управлением МЧС SDS 950 мл деионизированной водой. Хорошо перемешайте.
  3. Подготовьте сборного 4-12% бис-трис белка гели (см. B4 в таблице материалов).
    1. Разрежьте пластиковый мешочек для удаления геля кассеты и промойте кассету с дейонизированной водой.
    2. Снимите гребень из геля кассету в одно движение жидкости, стараясь не повредить скважин.
    3. Осторожно промывайте лунки загрузки 2 - 3 раза с 1 x работает буфер с помощью пипетки. Инвертировать и осторожно встряхивайте кассетный гель для удаления буфера, обеспечивая там нет пузырьков воздуха в скважинах.
    4. Снимите белые ленты в нижней части кассеты геля.
  4. Вставьте гели (максимум две кассеты) в гель работает танк и полностью собранном, замок гель напряженности клина.
  5. Заполнения буфера верхних (катод) камеры с 200 мл работает буфера до тех пор, пока полностью покрыты скважин. Проверить на наличие течи.
  6. Добавьте 500 мкл антиоксидант (см. A14 в Таблице материалы) работает буфер.
    Примечание: Антиоксидант является приличия реагент, который должен использоваться с образцами, сократилось с восстанавливающего агента (см. таблицу 1) для поддержания сокращение условий во время электрофореза и предотвращения ре окисление чувствительных аминокислот например триптофана и метионин.
  7. Тщательно нагрузки 50 мкг образца в пер. с помощью пипетки. Затем загрузить предварительно окрашенные белка стандарт как маркер молекулярной массы (см. A18 в Таблице материалы).
  8. Заполните в нижней палате буфера (анод) с 600 мл работает буфера.
  9. Запустите гели для ~ 60 мин при постоянном напряжении 175 V. В конце выполнения тщательно удалите гель от кассеты пластины с помощью геля нож.
  10. Тщательно перенесите гели в гель, окрашивание коробки.
    1. Подготовьте крепежные решения, свежие основанного на общее количество гели, которые должны быть окрашены в соответствии с инструкциями производителя как описано в таблице 2.
    2. Встряхните gel(s) в решении крепления для 10 мин на RT на качающейся платформе.
  11. Отменить решение фиксации и пятно гели с голубой коллоидное окрашивание комплект.
    1. Подготовить окрашивание свежие решения, основанные на общее количество гели, которые должны быть окрашены, согласно инструкциям производителя, как описано в таблице 3.
    2. Во-первых измерить соответствующий объем и непосредственно смешивать компоненты, помеченные звездочкой (*) в геле окраски окно. Встряхните gel(s) в решении окрашивание без Stainer B 10 мин на RT на качающейся платформе.
    3. Добавьте Stainer B непосредственно в окрашивание коробки, содержащий * окрашивание раствора. Убедитесь, что встряхнуть Stainer B хорошо перед использованием.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Осуществлять действия по подготовке 7.10.1 и 7.11.1 под вытяжного шкафа.
  12. Встряхните gel(s) в решении окрашивание ночь для наиболее общих результатов.
    Примечание: Окрашенных полос станут видимыми в течение 10 мин, после добавления Stainer B. Окрашивание требует минимум 3 часа и интенсивность не меняются, если оставить больше часов в растворе окрашивание.
  13. Тщательно сцеживаться окрашивание раствора и замените 200 мл деионизованной воды. Встряхните gel(s) для по крайней мере 7-8 ч в воде, чтобы очистить фон.
    Примечание: Деионизированной воды необходимо изменить несколько раз во время destaining процедура лучше удалить чрезмерного пятно. Gel(s) можно также оставить в воде до 3 дней без ущерба для белок интенсивность группы. Если gel(s) не подвергается последующие шаги сразу, она может храниться в 20% растворе сульфата аммония на 4 ° C для длительного хранения.

8. в гель Tryptic пищеварение

Примечание: Этот протокол согласно методу Шевченко et al.17, с небольшими изменениями. Эта процедура должна осуществляться в ламинарного потока капот и использовать выделенный набор пипетки, советы, труб и посуда специально для этой цели. Надевайте перчатки и соответствующие лаборатории одежда во все времена для предотвращения кератин и другие загрязнения. Подготовьте все решения и реактивы, используемые в данной процедуре незадолго перед использованием.

  1. Акцизный белка полосы от геля с чистой, новой микротомных лезвий. Группа мелко нарежьте (примерно 1 мм x 1 мм до 2 мм х 2 мм). Тщательно перенесите куски гель в 1,5 мл пробирок microcentrifuge.
    Примечание: Куски, которые слишком малы может засорить наконечники и большие куски уменьшит пептид восстановления. Соблюдать осторожность при использовании микротомных лезвий, которые являются крайне острыми.
  2. Минигелей
    1. Добавьте 500 мкл раствора минигелей, содержащий 100 мм ABC решения/АКС (1:1, v/v) и Проинкубируйте образцы на RT 30 мин с случайные встряхивания или vortexing.
    2. Тщательно пипетки, destaining решение. Визуально проверьте для любых труб с остаточной пятно. Повторите шаг 8.2.1, если гель штук по-прежнему являются окрашенные синий.
  3. Сокращение и алкилирования
    1. ~ 400 мкл свежеприготовленного раствора DTT и Инкубируйте на 56 ° C за 30 мин убедитесь, что решение полностью покрывает гель штук. Тщательно Пипетка, сокращение решение и отменить.
    2. ~ 400 мкл свежеприготовленного раствора МАА и инкубировать в темноте на RT на 30 мин удалить алкилирующие буфер с пипетки и отбросить.
  4. Пищеварение
    1. Мкл 500 аккуратные АКС в РТ за 10-15 мин до тех пор, пока гель штук сокращаться и становятся непрозрачными. Пипетка, АКС и просушите гель штук 5-10 мин под капотом.
    2. Пипетка 50 мкл раствора трипсина в каждую пробирку, чтобы полностью покрыть куски геля. Инкубируйте труб в 4 ° C на 30 мин.
    3. После 30 минут Проверьте каждую пробирку, если весь раствор трипсина вобрала гель штук. При необходимости добавьте чтобы полностью покрыть куски гель, достаточный объем буфера трипсина (50-100 мкл, в зависимости от объема в трубе). Проинкубируйте образцы на ночь на 37 ° C.
  5. Пептид добыча
    1. Тщательно Пипетка извлеченные пептид решение от труб и передача для очистки пробирок. Сухие супернатант в центробежных вакуум-испарителе.
      Примечание: Не снимайте оставшиеся части гель.
    2. Добавить 100 мкл буфера извлечения (обратитесь к шагу 1.7) каждой трубки и Инкубируйте 30 минут при 37 ° C при встряхивании.
    3. Пипетка супернатант в же пробирки, содержащие извлеченные пептиды согласно соответствующих групп и сухой вниз в вакуумной центрифуги.
      Примечание: Если не используется сразу, сушеные пептидных экстрактов могут храниться в-20 ° C до несколько месяцев до дальнейшего использования.

9. пептидные очистки

Примечание: Этот пептид образца опреснения и очистки процедура проводится с использованием C18 наконечники (см. C15 в Таблице материалы). Используйте новый наконечник для каждого образца.

  1. Подготовьте следующие свежие решения в конической пробирок и Алиготе в 2 мл microcentrifuge трубы для процедуры очищения пептида, как показано в таблице 4. Резюме трубки для очищения пептида является следующим: трубки (пример решения), трубки B (смачивающий раствор), трубки C (уравновешивания раствор), труба D (моющий раствор), трубки E (Элюирующий раствор), трубка F (пустой 2 мл и 5 мл microcentrifuge трубки, в зависимости от количество образцов, чтобы быть очищены, для удаления отходов) и G трубки (чистый, пустой Микропробирка, емкость 0,2 мл).
  2. Воссоздания сушеные пептидных экстрактов из шага 8.6.3 с 10 мкл 0,1% TFA. Эта трубка обозначается метро а.
  3. Sonicate трубы A в ультразвуковой ванне со льдом на 5 мин.
  4. Спин вниз пример решения в настольная центрифуга на 1000 x g за 1 мин.
  5. Установите P10 микропипеткой максимальный объем 10 мкл и надежно присоедините наконечник пипетки18 C.
  6. Погрузите кончик пипеткой в смачивающий раствор (метро B) и тщательно аспирационная в упаковочный материал. Постепенно отказаться от отходов в трубу F. Повторите этот шаг по крайней мере 7 - 8 раз.
    Примечание: Отпустите поршень пипеткой остановиться мертвых и медленно релиз или обойтись поршень на протяжении всей процедуры. Принять меры предосторожности, чтобы не ввести пузырьков воздуха в советы во время дозирование для обеспечения максимальной пептид привязки к столбцу C18.
  7. Сбалансировать подсказка для привязки пептид аспирационных 10 мкл раствора уравновешивания в трубе C. отменить решение и повторите эту процедуру 3-4 раза.
  8. Далее аспирационная и распределять решение примера в трубке A несколько раз (в зависимости от соответствующей толщины полосы гель) для связывания пептиды давать чаевые столбец.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Стремление и дозирования шаги в процедуре привязки (шаг 9.8) осуществляется в трубу а. Не обойтись примера решения для отходов.
  9. Вымойте наконечник пипетки18 C, аспирационных моющего раствора в труба D и отменяя его тратить (трубки F) 4-5 раз.
  10. Наконец элюировать привязанного пептиды, закупорить Элюирующий раствор (трубки E) и дозирования элюанта в трубу G.
  11. Повторите шаги, всего 2-3 циклов на сэмпл увеличить пример восстановления.
  12. Отменить отзыв после очистки одного образца и использовать новый наконечник для следующего примера.
  13. Сухой очищенный пептид элюаты в вакуумной концентратор.
    Примечание: Очищенный образцы теперь готовы для анализа LC-MS/MS в системе LC-уни-LTQ-Орбитрэп МС. Храните сушеные образцы в-20 ° C до дальнейшего использования.

10. Жидкие хроматографии электроспрей ионизации-MS/MS анализы

Примечание: Этикетка бесплатно количественных протеомики анализ выполняется на систему MS жидкого хроматографии электроспрей ионизации линейной ионной ловушки Орбитрэп (LC-уни-LTQ-Орбитрэп). LC состоит из Rheos Аллегро четвертичных насос оснащен онлайн дегазатор (в сочетании с HTS PAL Автоматический пробоотборник и система включает 30 мм x 0,5 мм C18 предварительно столбец подключен к 150 мм x 0,5 мм C18 столбец. Использовать обратный фаза водного растворителя A состоящий из воды класса LC-MS с муравьиной кислоты 0,1% (v/v) и органических растворителей B, состоящий из LC-MS класс ацетонитриле с муравьиной кислоты 0,1% (v/v). Используйте градиент с продолжительность 60 мин за гель-группы, как описано подробно в наших предыдущих исследований6,16.

  1. Распустить образцов очищенной пептида в 10 мкл 0,1% TFA. Sonicate образцы на льду на 5 мин.
  2. Пипетка 10 мкл образцов в V-дно 96-луночных плиту и печать с ясным, Самоклеящиеся обложки фильма.
  3. Передать пластину Автоматический пробоотборник.
  4. Используйте следующий градиент для каждого время выполнения 60 мин: 0-35 мин (15-40% растворителя B), 35-40 мин (40-60% растворителя B), 40-45 минут (60-90% растворителя B), 45-50 мин (90% растворителя B), 50-53 мин (90-10% растворителем B) и 53-60 мин (10% растворителем B).
  5. Используйте следующие условия масс-спектрометрических инструмента: положительных ионов электроспрей режима ионизации, спрей напряжения (2.15 кв), капиллярные температуры (220 ° C), приобретение данных зависит от режима, автоматическое приобретение, переключение между Орбитрэп-MS и LTQ МС/МС, Орбитрэп резолюции (30000), m/z диапазон (от 300 до 1600), автоматическая целевой контроль (AGC, 1,0 x 106 ионов), Внутренняя калибровка (polydimethlycyclosiloxane [PCM] на m/z 445.120025 ионов в режиме реального времени), блокировка массового опция включена в режиме MS, Тандем данные, полученные путем выбора пятерку самых интенсивных прекурсоров ионов, дальнейшей фрагментации путем столкновения индуцированной диссоциации (CID), нормированный энергию столкновения (NCE, 35% с время активации 30 мс с повторений 3) и динамического исключения продолжительность (600 s).
    Примечание: Результате фрагментации ионов записываются в LTQ.
  6. Запустите по крайней мере три биологических репликация для каждого образца.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Ограниченной выборке доступность является одним из основных недостатков в офтальмологических исследований. Соответственно методы добычи для оптимального белка доходности с небольшое количество образцов таких как глазные кровеносных сосудов часто спорны. На сегод?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Всеобъемлющие протеома профилирование различных глазных образцов является важным и необходимым первым шагом для выяснения молекулярных механизмов и сигнальных путей, замешанных в здоровье и болезни. Для того, чтобы получить высокое качество данных и обеспечить воспроизводимость ре?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Д-р Manicam поддерживается внутренним университета финансирование исследований (Stufe 1) из медицинского центра Университета Йоханнеса Гутенберга Университета Майнца и Грант от Deutsche Forschungsgemeinschaft (MA 8006/1-1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
A. Chemicals
1, 4-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich1.11474
Calcium chloride dihydrate (CaCl2)  Carl Roth 5239.12.5 mM 
Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific14190169
Formic acid (CH2O2)AppliChemA0748
HPLC-grade acetonitrile (ACN, C2H3N)AppliChemA1605
HPLC-grade methanol (CH3OH)Fisher ScientificM/4056/17
HPLC-grade water AppliChemA1589
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI6125
Kalium chloride (KCl)  Carl Roth 6781.14.7 mM 
Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) Carl Roth 3904.21.2 mM 
LC-MS-grade acetic acid Carl Roth AE69.1
Magnesium sulphate (MgSO4)   Carl Roth 261.21.2 mM 
NuPAGE AntioxidantThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0005
NuPAGE LDS Sample buffer Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP00074x
NuPAGE MES SDS Running Buffer Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000220x
NuPAGE Sample reducing agent Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP000410x
SeeBlue Plus2 pre-stained protein standard Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC5925
Sequencing grade modified trypsinPromegaV5111
Sodium chloride (NaCl) Carl Roth 9265.2118.3 mM 
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) Carl Roth 965.325 mM 
Trifluoroacetic acid (TFA,  C2HF3O2)Merck Millipore108178
α-(D)-(+)- Glucose monohydrate Carl Roth 6780.111 mM 
B. Reagents and Kits
0.5 mm zirconium oxide beads Next AdvanceZROB05
1.0 mm zirconium oxide beads Next AdvanceZROB10
Colloidal Blue Staining  KitThermo Fisher Scientific (Invitrogen)LC6025To stain 25 mini gels per kit
NuPAGE 4-12 % Bis-Tri gelsThermo Fisher Scientific (Invitrogen)NP0321BOX1.0 mm, 10-well
Pierce Bicinchoninic Acid (BCA) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific23227
ProteoExtract Transmembrane Protein Extraction Kit, TM-PEKMerck Millipore71772-320 reactions per kit
Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER)Thermo Scientific78510
C. Tools
96-well V-bottom platesGreiner Bio-One651180
Corning 96-well flat-bottom platesSigma-AldrichCLS3595-50EA
Disposable microtome bladespfm Medical207500014
Disposable scalpels #21pfm Medical200130021
Dissection pins Carl RothPK47.1
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools14084-08
Falcon conical centrifuge tubes (50 mL)Fisher Scientific14-432-22
Mayo scissors, Tough cut Fine Science Tools14130-17
Precision tweezers Fine Science Tools11251-10Type 5
Precision tweezers, straight with extra fine tipsCarl RothLH53.1Type 5
Self-adhesive sealing films for microplatesRatiolab (vWR)RATI6018412
Standard pattern forceps Fine Science Tools11000-12
Student Vannas spring scissors Fine Science Tools91501-09
Vannas capsulotomy scissors  Geuder19760 Straight, 77 mm
ZipTipC18 pipette tipsMerck MilliporeZTC18S096
D. Equipment and devices
150 × 0.5 mm BioBasic C18 columnThermo Scientific, Rockford, USA72105-150565
30 × 0.5 mm BioBasic C18 pre-column Thermo Scientific, Rockford, USA72105-030515
Amicon Ultra-0.5 3K Centrifugal Filter Devices Merck MilliporeUFC500396Pack of 96.
Analytical balanceSartoriusH51
Autosampler CTC Analytics AG, Zwingen, SwitzerlandHTS Pal
BBY24M Bullet Blender Storm Next AdvanceNA-BB-25
Eppendorf concentrator, model 5301Sigma-AldrichZ368172
Eppendorf microcentrifuge, model 5424Fisher Scientific05-403-93Non-refrigerated
Heraeus Primo R CentrifugeThermo Scientific75005440Refrigerated
Labsonic M Ultrasonic homogenizer SartoriusBBI-8535027
LC-MS pump, model Rheos AllegroThermo Scientific, Rockford, USA22080
LTQ Orbitrap XL mass spectrometer Thermo Scientific, Bremen, Germany
Multiskan Ascent plate reader Thermo Labsystemsv2.6
Rotator with vortex neoLab7-0045
Titanium probe (Ø 0.5 mm, 80 mm long)SartoriusBBI-8535612
Ultrasonic bath, type RK 31Bandelin329
Xcell Surelock Mini CellLife TechnologiesEl0001

Ссылки

  1. Mandal, N., Heegaard, S., Prause, J. U., Honoré, B., Vorum, H. Ocular proteomics with emphasis on two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry. Biological Procedures Online. 12, 56-88 (2010).
  2. Gregorich, Z. R., Ge, Y. Top-down proteomics in health and disease: Challenges and opportunities. Proteomics. 14, 1195-1210 (2014).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422, 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537, 347-355 (2016).
  5. Cehofski, L. J., Mandal, N., Honoré, B., Vorum, H. Analytical platforms in vitreoretinal proteomics. Bioanalysis. 6, 3051-3066 (2014).
  6. Manicam, C., et al. Proteomics Unravels the Regulatory Mechanisms in Human Tears Following Acute Renouncement of Contact Lens Use: A Comparison between Hard and Soft Lenses. Scientific Reports. 8, 11526(2018).
  7. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR 4) in human tear proteome. Proteomics. 14, 1698-1709 (2014).
  8. Perumal, N., Funke, S., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proteomics analysis of human tears from aqueous-deficient and evaporative dry eye patients. Scientific Reports. 6, 29629(2016).
  9. Perumal, N., Funke, S., Wolters, D., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Characterization of human reflex tear proteome reveals high expression of lacrimal proline-rich protein 4 (PRR4). Proteomics. 15, 3370-3381 (2015).
  10. Perumal, N., et al. Characterization of the human aqueous humour proteome: A comparison of the genders. PloS ONE. 12, 0172481(2017).
  11. Hayreh, S. S. Posterior ciliary artery circulation in health and disease the Weisenfeld lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 749-757 (2004).
  12. Zeitz, O., et al. Glaucoma progression is associated with decreased blood flow velocities in the short posterior ciliary artery. British Journal of Ophthalmology. 90, 1245-1248 (2006).
  13. Verma, N., Rettenmeier, A. W., Schmitz-Spanke, S. Recent advances in the use of Sus scrofa (pig) as a model system for proteomic studies. Proteomics. 11, 776-793 (2011).
  14. Foulds, W. S., Kek, W. K., Luu, C. D., Song, I. C., Kaur, C. A porcine model of selective retinal capillary closure induced by embolization with fluorescent microspheres. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 6700-6709 (2010).
  15. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249, 475-482 (2011).
  16. Manicam, C., Perumal, N., Pfeiffer, N., Grus, F. H., Gericke, A. First insight into the proteome landscape of the porcine short posterior ciliary arteries: Key signalling pathways maintaining physiologic functions. Scientific Reports. 6, 38298(2016).
  17. Shevchenko, A., Tomas, H., Havli, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1, 2856-2860 (2006).
  18. Feist, P., Hummon, A. B. Proteomic challenges: sample preparation techniques for microgram-quantity protein analysis from biological samples. International Journal of Molecular Sciences. 16, 3537-3563 (2015).
  19. Cox, B., Emili, A. Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics. Nature Protocols. 1, 1872-1878 (2006).
  20. Zhang, L., et al. Proteomic analysis of mouse liver plasma membrane: use of differential extraction to enrich hydrophobic membrane proteins. Proteomics. 5, 4510-4524 (2005).
  21. Zhou, H., et al. Improved recovery and identification of membrane proteins from rat hepatic cells using a centrifugal proteomic reactor. Molecular & Cellular Proteomics. 10, 111(2011).
  22. de la Cuesta, F., Mourino-Alvarez, L., Baldan-Martin, M., Moreno-Luna, R., Barderas, M. G. Contribution of proteomics to the management of vascular disorders. Translational Proteomics. 7, 3-14 (2015).
  23. Cottingham, K. 1DE proves its worth... again. Journal of Proteome Research. 9, 1636(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены