Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Resumen

Proteomas celulares se caracterizan a menudo usando análisis de electroforesis, donde todas las especies de proteínas en las células no específicamente están marcadas con un colorante fluorescente y son vistas por un fotodetector tras su separación. Imágenes de fluorescencia de una molécula pueden proporcionar detección ultrasensible de la proteína con su capacidad para la visualización de las moléculas fluorescentes individuales. Sin embargo, la aplicación de este método de proyección de imagen de gran alcance para ensayos de electroforesis es obstaculizada por la falta de formas de caracterizar la homogeneidad de las etiquetas fluorescentes de cada especie de proteína en el proteoma. Aquí, se desarrolló un método para evaluar la homogeneidad de etiquetado en el proteoma basado en un análisis de imágenes de fluorescencia de sola molécula. En nuestra medición en una muestra de células HeLa, la proporción de proteínas con al menos un tinte, que denomina 'etiquetado ocupación' (LO), se determinó al rango del 50% al 90%, apoyando el potencial de la aplicación de la proyección de imagen de una molécula a Análisis del proteoma sensible y precisa.

Introducción

Análisis del proteoma, que tiene como objetivo cuantificar el conjunto de moléculas de la proteína expresada en la célula, es un enfoque valioso en estudios biológicos y medicamentos actuales. Este análisis se basa comúnmente en espectrometría de masa, que identifica especies de proteínas basadas en espectros generados a través de proteínas ionización^1,2,3. Un método alternativo para el análisis del proteoma es la electroforesis, incluyendo electroforesis de geles de poliacrilamida (PAGE) y electroforesis capilar, electroforesis en dos dimensiones (2D). Este método se basa en etiquetado fluorescente no específicos de todas las moléculas de proteína en las células analizadas, seguidas por separación electroforética y la detección y cuantificación de cada especie de proteína. Para lograr el etiquetado requiere proteína no específica, una estrategia es utilizar tintes fluorescentes que pueden unirse a proteínas a través de interacciones electrostáticas e hidrofóbicas, tales como azul de Coomassie y Sypro Ruby^4,5,6 . Una estrategia alternativa es usar etiquetado covalente con tintes que contengan éster N-hydroxysuccinimide (NHS) o maleimida, que puede unirse covalentemente a proteínas a través de residuos comunes tales como aminas primarias y tioles, respectivamente^{7, 8}.

Mientras tanto, la sensibilidad de detección de fluorescencia es ideal para el análisis de proteínas de baja abundancia y al pequeño número de células. Imágenes de fluorescencia de una molécula es uno de los métodos más sensibles que permite la detección de tintes fluorescentes individuales y etiquetadas proteínas en vitro y en vivo^{9,10,11,12, 13,14,15}. Se espera que la aplicación de este método de imagen para el análisis del proteoma basado en electroforesis permiten análisis altamente sensibles y cuantitativos por contar proteínas individuales marcada con fluorescencia. Sin embargo, no queda claro si etiquetado con tintes fluorescentes es bastante homogéneo en todas las moléculas de proteína, y cómo esta homogeneidad es afectada por especies diferentes de proteínas (figura 1). Simples medidas de solución a granel pueden utilizarse para obtener un cociente molar de tintes fluorescentes para proteínas llamadas 'eficiencia de acoplamiento'⁸ o 'etiquetado eficiencia', pero esta propiedad no proporciona información sobre la homogeneidad de las etiquetas entre moléculas de la proteína.

Aquí, describimos el protocolo de un ensayo investigar la homogeneidad Etiquetadora para todas las especies de proteínas en la célula (figura 2)¹⁶. Los dos pasos claves de este ensayo son la proyección de imagen y purificación de proteínas. En el primer paso, todas las proteínas en las células llevan la etiqueta fluorescente y biotinilado, luego extraída por separado mediante electroforesis en gel seguido por electroelución. En el segundo paso, propiedades de fluorescencia de las moléculas individuales de proteínas en las muestras extraídas son evaluadas en base a proyección de imagen de molécula única. De estos datos, parámetros importantes para el análisis de la cuenta, tales como el porcentaje de proteínas etiquetados con uno menos tinte, que llamamos etiquetado ocupación (LO)¹⁶, y el número promedio de tintes fluorescentes enlazado a una molécula de proteína sola (n̄ _tinte), se puede caracterizar. En el protocolo, un procedimiento optimizado para el etiquetado el proteoma de células HeLa con tinte de Cianina 3 (Cy3) basado en éster NHS se presenta como un ejemplo y puede modificarse con otros procedimientos de etiquetado según objetivos de investigación deseada.

Protocolo

1. preparación de la célula

1. Cultivar células HeLa en un plato de 10 cm a 37 ° C debajo del 5% de CO₂ en Dulbecco de modificado medio de Eagle con 10% suero bovino fetal.
2. Recoger las células de crecimiento exponencial una vez que han llegado a la confluencia de 70%, siguiendo las instrucciones de ATCC¹⁷.
   1. Lavar las células con 5 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) (pH 7.4). Retirar el PBS.
   2. Añadir 1 mL de 0.1% tripsina-dihidratada del ácido (EDTA). Incubar 5 min a 37 ° C.
   3. Controlar la progresión de la disociación de células por microscopía.
   4. Una vez que las células se convierten en la redondeos y son independientes de la fuente, añadir 4 mL de medio de cultivo y romper la aglomeración de células mediante pipeteo.
   5. Contar el número de células usando un contador de células.
   6. Centrifugue a 150 x g durante 10 min en un tubo de centrífuga. Quitarlo del medio y resuspender el sedimento celular con 5 mL de 1 x PBS (pH 7.4).
   7. Repita el paso 1.2.6. Resuspender las células en PBS 1 x (pH 7,4) a una concentración final de 10⁶ células/mL utilizando el número de cuenta en el paso 1.2.5.
      Nota: La suspensión de células puede ser alícuotas y almacenados a-80 ° C durante varios meses. Debe evitarse repetir un ciclo de congelamiento/descongelamiento.

2. la célula lysis y etiquetado fluorescente

1. Tomar 10 mL de buffer de lisis (borato de 0,1 M, 1% sodio dodecil sulfato (SDS) y 1% Tween 20). Ajustar a pH 12 con 2 M NaOH.
   PRECAUCIÓN: NaOH concentrado es corrosivo. Usar gafas y guantes adecuados al preparar esta solución.
   Nota: Tampón de lisis puede almacenarse hasta por una semana a temperatura ambiente.
2. Mezclar 100 μL de lisis buffer con 1 μL de Ditiotreitol (DTT) de 1 M y 4 μL de 50% 3 [(3-cholamidopropyl) dimetilamonio] -1-propanesulfonate (caps).
3. Mezclar 1 μL de cultivo celular (células aproximadamente 1.000) con el tampón de lisis mezclado en el paso 2.2. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 minutos con agitación suave. Volver a homogeneizar la solución transfiriendo poco a poco.
4. Añadir 1 μL de 2 μg/mL tinte Cy3 NHS-éster. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar por 5 min en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave.
   Nota: El pH alto de este buffer hace neutralización de los residuos de lisina en las proteínas, llevando a una mayor reactividad.
5. Repetir la adición de 1 μL de 2 μg/mL tinte Cy3 NHS-éster. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar por 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave.
   Nota: Esto repetida adición de colorante de NHS-éster puede aumentar la eficacia de etiquetado porque el tinte Cy3 NHS-ester es hidrolizado y desactivado por el alto pH del buffer de reacción.
6. Ajustar a pH 7,2 añadiendo 100 μL de 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES)-NaOH pH 7.2 para calmar la reacción. Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas.
7. Añadir 20 μL de 19 mg/mL (glicol de polietileno (clavija)) de biotina-₂-amina y 5 μL de 20 mg/mL 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Homogeneizar la solución transfiriendo lentamente para evitar burbujas. Incubar durante 1 h en la oscuridad a temperatura ambiente con agitación suave.
   Nota: Este paso de Biotinilación es necesario fijar las moléculas de proteína en un cubreobjetos microscopio con una densidad fija y sin sesgo para especies de proteína.
8. Eliminar reactivos Etiquetadoras no reaccionados y concentrar la muestra mediante una columna de ultrafiltración con atajo del kDa 10, siguiendo las instrucciones del fabricante.
   Nota: El protocolo se puede detener aquí. La muestra puede conservarse a-80 ° C durante varias semanas.

3. proteoma separación y recuperación

1. Añadir 4 x tampón de muestra de SDS (200 mM Tris-HCl pH 6.8, 4% SDS, glicerol 4% y 0.4% azul de bromofenol).
   Nota: Para evitar el daño del tinte, la muestra de proteína no se debe calentar como hecho en estándar SDS-PAGE y debe conservarse a temperatura ambiente.
2. Presentación estándar SDS-PAGE para la muestra de proteína y una escala molecular, utilizando 20% gel de acrilamida. Migrar la muestra del gel a una tensión constante (160 V) hasta la migración delantera solo sale el gel.
3. Imagen del gel para identificar la ubicación de las bandas de proteínas (figura 3).
4. Cortar las porciones de gel incluyendo fracciones de la proteína de interés usando una cuchilla afilada, basada en la ubicación de la banda. Fraccionamiento en picos de 16, 23, 55 y 120 kDa y en kDa 19-25, 25-32, 32-42, 42 – 54, 54-69, 69-97, 97-136 y 136 – 226 regiones se muestran en la figura 3.
5. Extraer las proteínas utilizando un dializador por electroelución con un tamaño de poro de 6 a 8 kDa, siguiendo las instrucciones del fabricante.
   Nota: La muestra extraída puede almacenarse a-80 ° C durante varias semanas.

4. preparación de cubreobjetos microscopio

1. Preparar 200 μL de tampón de avidina (5 mM HEPES-NaOH pH 7.2, 10 avidina ng/mL y 2 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA)) para cada muestra.
2. Preparar el cubreobjetos de 22 x 22 mm y 0.15 mm de espesor. Exponga el cubreobjetos para aire plasma usando un plasma cleaner durante 1 min para limpiar y activar sus superficies.
3. Cubrir el cubreobjetos con avidina por spin-coating 200 μL de tampón de avidina mediante un recubridor de centrifugado durante 5 segundos a 500 rpm, seguido por 30 segundos a 1.000 rpm. Incubar el cubre-objetos durante 15 min a temperatura ambiente para que deje que se seque.
4. Preparar el cubreobjetos de la muestra de proteína.
   1. Diluir la muestra de proteína (de 3,5) 100 veces en 5 mM HEPES-NaOH de pH 7.2.
   2. Coloque 100 μL de la muestra diluida en la superficie en el centro del cubreobjetos recubierto de avidina (desde el paso 4.3).
   3. Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente.
5. Preparar el control positivo.
   1. Coloque 100 μL de 10 ng/mL purificada fluorescente biotina en 5 mM HEPES-NaOH pH 7.2 en el centro de la avidina revestido cubreobjetos (desde el paso 4.3).
   2. Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente.
      Nota: Este control positivo cubreobjetos proporciona la densidad de avidina puntos de enlace, que se utiliza para calcular la LO.
6. Preparar el control negativo.
   1. Spin-capa el plasma había limpiado cubreobjetos con 200 μL de 5 mM HEPES-NaOH y 2 mg/mL BSA (sin avidina).
   2. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente para que seque.
   3. Añada 100 μL de 10 ng/mL purificada fluorescente biotina en 5 mM HEPES-NaOH de pH 7.2.
   4. Incubar en la oscuridad durante 15 min a temperatura ambiente.
      Nota: Este control negativo cubreobjetos proporciona la cantidad de fijación no específica de cubreobjetos sin avidina biotina fluorescente.
7. Enjuague cada cubreobjetos con 200 μL de agua destilada por pipeteo en los bordes del cubreobjetos para que no se toque el centro del cubreobjetos con la punta. Repita este lavado tres veces.
   Nota: Después de aspirar el agua sobre el cubreobjetos, agua debe inmediatamente colocarse en el cubreobjetos para evitar que se seque completamente.
8. Exponga el aire plasma el mismo número de cubreobjetos como en el paso 4.2.
9. Coloque el cubreobjetos limpio sobre el cubreobjetos muestra limite de paso 4,7 para evitar que se sequen.

5. observación con microscopía de fluorescencia de una molécula

1. Puesta en marcha de un microscopio de fluorescencia de campo de campo amplio o evanescente.
   PRECAUCIÓN: Directa o radiación dispersa de láser puede causar ojo o daño de la piel. Utilice gafas protectoras adecuadas y el escudo de la trayectoria de la luz láser.
   Nota: Para la configuración del microscopio, por favor consulte nuestra anterior publicación¹⁶. Brevemente, un microscopio de fluorescencia de campo amplio o evanescente campo equipado con una alta potencia 488 nm láser la excitación, un alta abertura numérica del objetivo y una cámara de alta sensibilidad se puede utilizar para esta medida. Además, para una medición automatizada, una etapa controlada por ordenador XY muestra traslacional, persianas mecánicas para excitaciones láser y un sistema de enfoque automático se recomiendan para ser instalado.
2. El cubreobjetos en el microscopio y encontrar el foco.
3. Realizar un análisis del azulejo para obtener imágenes por lo menos 100.
   Nota: La iluminación de láser debe controlarse con obturadores mecánicos expuestos a la muestra sólo cuando la grabación de imágenes con la cámara, para minimizar el fotoblanqueo. Si hay muchas muestras, se recomienda medición automatizada mediante un programa informático para el control de los dispositivos de microscopio. Cada imagen incluye típicamente 100-500 puntos de molécula única cuando se utiliza una lente de objetivo de 60 x.

6. Análisis y extracción de información de la imagen

1. Si la imagen tiene desnivel debido al patrón de iluminación láser, realizar procesamiento de imágenes para corregirla¹⁸.
   1. Adquirir una imagen de referencia midiendo con una muestra de cubreobjetos de tintes de propagación uniformemente usando una cámara de configuración de la misma como en el paso 5.3.
   2. Adquirir una imagen compensada midiendo con ninguna excitación láser, usando la misma configuración de cámara.
   3. Restar a cada valor de píxel en cada imagen de muestra y la imagen de referencia con el valor de la imagen compensada.
   4. Dividir cada valor de píxel en las imágenes de la muestra resta el valor de la imagen de referencia resta.
2. Recoger imágenes debidamente adquiridos y quitar el fondo de la imagen.
   1. Eliminar imágenes que contienen grandes fluorescentes agregados manualmente.
   2. Quitar el fondo de la imagen mediante la aplicación de la balanceo-bola algoritmo¹⁹ con un radio de bola de 50 píxeles con ImageJ²⁰.
   3. Enfocar imágenes por sustracción de imágenes borrosas con ImageJ (enfocar la función de la imagen).
3. Encontrar y analizar puntos de molécula única en imágenes.
   1. Identificar puntos de molécula única con el Yen umbral algoritmo²¹ con ImageJ.
   2. Filtro de puntos con menos de dos píxeles para excluir oscuro ruido de la cámara y puntos de más de 20 píxeles para excluir los agregados de proteínas mediante ImageJ (Gerente de ROI).
   3. Contar el número de puntos en cada imagen. Usando la imágenes corregidas (paso 6.1.4), analizar la iluminación total de intensidades dentro de píxeles para cada punto con ImageJ.
4. Calcular la capacidad de etiquetado (LO) usando la siguiente fórmula:
   LO = (número de cuentas de la muestra / número de cuentas en el control positivo) x 100
5. Calcular el número promedio de tintes fluorescentes enlazado a una molécula de proteína sola (n̄_tinte).
   1. Análisis de un histograma de las intensidades de cada lugar.
      Nota: El histograma generalmente tiene varios picos, y cada pico representa un número diferente de moléculas de colorante, unida a una proteína. El primero, segundo y tercer pico en el histograma corresponde a las moléculas 1, 2 y 3, respectivamente.
   2. Calcular la intensidad media de histograma. Calcular también la intensidad de pico del primer pico aplicando un ajuste gaussiano.
   3. Calcular n̄_tinte dividiendo la intensidad media con la intensidad de pico.

Resultados

Figura 4 representa los datos de imagen raw para las fracciones de diferente peso molecular de proteínas de célula HeLa lisada, así como el control positivo y negativo. Mientras que la muestra de proteína y positivo controlan de exhibición de 100 – 500 puntos por imagen, el control negativo muestra ninguno o pocos puntos, demostrando que el protocolo lo suficientemente inhibe la fijación no específica de los tintes a la superficie del cubreobjetos. I...

Discusión

Este papel describe un protocolo para cuantificar la homogeneidad Etiquetadora de cada especie de etiquetado de proteínas en las células después de la separación con SDS-PAGE (paso 3). El método de separación puede ser sustituido con otros métodos como la cromatografía líquida o electroforesis capilar, que permiten la separación y fraccionamiento de proteínas celulares con alta resolución, mientras que requieren equipo especial²³. El método de etiquetado con NHS-ester en el protocolo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
22x22x0.15 mm coverslip	VWR	470019-004
488 nm Argon laser	Coherent	Innova 70C
488 nm dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03
488 nm emission filter	Semrock	FF02-520/28
560 nm dichroic filter	Semrock	Di02-R561
560 nm emission filter	Semrock	FF02-617/73
560 nm fiber laser	MBP Communications	F-04306-2
60x oil immersion lens	Olympus	PLAPON 60x
Avidin	Nacalai-tesque	03553-64
Biotin-PEG-amine	Thermo Scientific	21346
Biotinylated Alexa Fluor 488	Nanocs
Borate	Nacalai-tesque
BSA	Sigma-Aldrich	A9547
CHAPS	Dojindo	C008-10
Cy3 NHS-ester dye	GE Healthcare	PA13101
Dialyzer  - D-tube, 6-8 kDa	Merck Millipore	71507-M
DMEM	Sigma-Aldrich
DTT	Nacalai-tesque	14112-94
EDC	Nacalai-tesque
EMCCD camera	Andor	IiXon 897
Epi fluorescence microscope	Olympus	IX81
Gel viewer	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix	Gibco
Plasma cleaner	Diener Electronic
SDS	Wako	NC0792960
Size purification column 10K	Merck Millipore	UFC5010
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416