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要約

ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

要約

細胞のプロテオームは細胞内蛋白質のすべての種が非具体的蛍光染料と分類され、次の彼らの分離器によって斑点を付けられる電気泳動法の試金を使用して頻繁に特徴付けられます。単一分子蛍光イメージングは、個々 の蛍光分子を可視化するための能力を超高感度タンパク質検出を提供できます。ただし、この強力なイメージング法の電気泳動の試金への応用はプロテオームの間でそれぞれの蛋白質種の蛍光標識の均一性を特徴付ける方法の欠乏によって妨げられます。ここでは、単一分子蛍光イメージング法に基づくプロテオームのラベリングの均質性を評価する方法を開発しました。HeLa 細胞サンプル、我々 は '占有ラベル' と呼ばれる少なくとも 1 つの色素の付いたタンパク質の割合を使用して私たちの測定 (LO)、決定された範囲に 50% から 90%、サポートする単一分子イメージングの応用の可能性が高いから高感度・高精度のプロテオーム解析。

概要

セルで表されるタンパク質分子の全体セットを定量化することを目的としたプロテオーム解析は、現在の生物学的および薬効がある研究の貴重なアプローチです。この分析は、よくタンパク質イオン1,2,3を介して生成されたスペクトルに基づく蛋白質種を識別する質量に依存します。プロテオーム解析の方法として、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) を含む電気泳動、キャピラリー電気泳動、二次元 (2 D) ゲルの電気泳動。このメソッドは、非固有電気泳動分離と検出および各蛋白質種の定量化分析の細胞のすべてのタンパク質分子の蛍光標識に依存します。必要な非特異的タンパク質ラベリングを実現、1 つの戦略はブルーと可視ルビー4,5,6 などの静電場と疎水性相互作用によるタンパク質に結合することができます蛍光染料を使用するには.代替戦略 N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルまたはマレイミド、第一級アミン、チオールなど一般的な残基をタンパク質に結合することができます共有、それぞれ7,を含む染料で共有結合性ラベリングを使用することです。8。

一方、蛍光検出の感度は、低豊富なタンパク質と細胞の小さな数字の分析に最適です。単一分子蛍光イメージングは個々 の蛍光染料と in vitro 試験および in vivo9,10、11,12、分類された蛋白質の検出を可能にする最も敏感な方法の一つです。 13,14,15。このイメージング法の電気泳動を用いたプロテオーム解析への応用は、個々 の蛍光標識したタンパク質をカウントすることにより高感度・定量的アッセイを有効にする予定です。ただし、不明のままかどうか蛍光染料と分類は十分なすべての蛋白質分子の間で、種のタンパク質 (図 1) は、この均質性の影響について。単純なバルク溶液測定を使用して、'結合効率'8または 『 効率をラベリング 』 と呼ばれるタンパク質に蛍光染料のモル比を取得できますが、このプロパティ間ラベルの均質性に関する情報は提供しません蛋白質分子。

ここでは、セル (図 2)16のすべての蛋白質種のラベリングの均質性を調査するための試金のためのプロトコルについて述べる。この試金の 2 つの手順では、蛋白質の浄化およびイメージング。最初のステップで、細胞のすべてのタンパク質を蛍光に分類し、ビオチン化、個別に電気泳動を使用して得られる electroelution が続きます。2 番目の手順では、単一分子イメージングに基づく抽出サンプル中の個々 のタンパク質分子の蛍光特性が評価されます。このデータからタンパク質の割合が少なくとも 1 つ付いたようカウント分析の重要なパラメーターを染める、これラベリング占有 (LO)16と呼んで、蛍光染料の平均数は単一のタンパク質分子にバインド (n̄色素)、特徴付けることができます。プロトコルでは、NHS エステル系シアニン 3 (Cy3) 染料と HeLa 細胞のプロテオームの分類のための最適化されたプロシージャは、例として提示し、希望する研究の目標によると他のラベルの手順で変更できます。

プロトコル

1. セル準備

  1. 37 ° C で 10 cm 皿に HeLa 細胞を養う 5% 未満ダルベッコの CO2のイーグル培地 10% 牛胎児血清を含む、変更されました。
  2. 70% の confluency、次の ATCC 手順17に達したら、指数関数的に成長のセルを収集します。
    1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (pH 7.4) x 1 の 5 mL の細胞をすすいでください。PBS を削除します。
    2. 0.1% トリプシン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 1 つの mL を追加します。37 ° C で 5 分間加温します。
    3. 顕微鏡による細胞解離の進行を監視します。
    4. 細胞は円形になるし、皿から切断されて、成長培地 4 mL を追加し、ピペッティングにより細胞の集積を破る。
    5. 細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。
    6. 150 x gで 10 分間遠心管中で遠心分離機します。メディアを削除し、5 ml の 1x PBS (pH 7.4) の細胞ペレットを再懸濁します。
    7. 1.2.6 のステップを繰り返します。1 × PBS (pH 7.4) 106セル/mL ステップ 1.2.5 でカウント数を使用しての最終濃度に細胞を再懸濁します。
      注: 細胞懸濁液は、数ヶ月間、避けようと-80 ° C で保存されますを使用できます。フリーズ/フリーズ解除の繰り返しは避けてください。

2. 細胞の換散および蛍光標識

  1. 10 mL の溶解バッファーを作る (1%、1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 0.1 M ホウ酸トゥイーン 20)。12 2 M NaOH を使用して pH を調整します。
    注意: 濃水酸化ナトリウムは腐食性です。このソリューションを準備するときは、適切な手袋、メガネを着用します。
    注: 最大 1 週間室温で溶解バッファーを格納できます。
  2. 溶解バッファーを 1 M ジチオトレイトール (DTT) の 1 μ l と 4 のミックス 100 μ L の 50 %3 [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio μ L]-1-propanesulfonate (チャップス)。
  3. ステップ 2.2 から混合 lysing バッファーを持つ細胞培養 (約 1,000 セル) のミックス 1 μ L。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。穏やかな攪拌を 5 分間室温で暗闇の中で孵化させなさい。ゆっくりとピペッティングによるソリューションを再均質化します。
  4. 2 μ g/mL 色素 Cy3 NHS エステルの 1 μ L を追加します。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。穏やかな攪拌と室温で暗闇の中で 5 分間インキュベートします。
    注意: このバッファーの高い pH は高い反応性につながるタンパク質のリジン残基の中和を引き起こします。
  5. 2 μ g/mL 色素 Cy3 NHS エステルの 1 μ L 添加を繰り返します。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。穏やかな攪拌と室温で暗闇の中で 10 分間インキュベートします。
    注: これは、Cy3 NHS エステル色素の一部は加水分解、反応バッファーの高 pH が非アクティブに NHS エステル色素添加がラベル付けの効率を増やすことができます繰り返し。
  6. 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 0.8 M の 100 μ L の追加によって ph 7.2 調整-NaOH pH 7.2 反応を抑制します。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。
  7. 19 mg/mL ビオチン-(ポリエチレング リコール (PEG))2の 20 μ L を追加-アミン及び 20 mg/mL 1 の 5 μ L-エチル - 3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC)。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。穏やかな攪拌と室温で暗闇の中で 1 時間インキュベートします。
    メモ: このビオチン化ステップ固定密度と蛋白質種の顕微鏡観察でタンパク質分子を修正する必要が。
  8. 未反応ラベリング試薬を削除し、限外濾過カラムを用いた 10 kDa カットオフ、製造元の指示に従ってサンプルを集中します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは数週の間-80 ° C で保存できます。

3. プロテオームの分離・回収

  1. SDS のサンプルバッファー (200 mM トリス塩酸 pH 6.8, 4 %sds、4% のグリセロールと 0.4% ブロモフェノール ブルー) x 4 を追加します。
    注: 染料の損傷を避けるためには、蛋白質のサンプルは標準の SDS-PAGE で加熱しないと室温で保管する必要があります。
  2. 蛋白質のサンプルの 20% アクリルアミド ゲルを使用して分子ラダー標準 SDS ページを実行します。サンプルの移行移行までの定電圧 (160 V) でゲルでフロントだけゲルで終了します。
  3. タンパク質バンド (図 3) の場所を識別するためにゲルをイメージします。
  4. バンドの場所に基づいて、鋭い刃を使用して興味の蛋白を含むゲル部分をカットします。16、23、55、および 120 kDa のピーク、19-25、25-32、32-42、42-54、54-69、69-97、97-136、136-226 kDa の領域は、図 3に示すため。
  5. 製造元の指示に従って、6-8 kDa の孔径の electroelution でダイアライザーを使用して蛋白質を抽出します。
    注: 抽出されたサンプルは-80 ° C で数週間保存できます。

4. 顕微鏡 coverslip の準備

  1. 各サンプルのアビジン バッファー (5 mM HEPES NaOH pH 7.2, 10 ng/mL アビジンと 2 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA)) の 200 μ L を準備します。
  2. 22 × 22 mm と 0.15 mm 厚の coverslips を準備します。空気をきれいにし、表面をアクティブにする 1 分クリーナー プラズマを用いたプラズマ coverslips を公開します。
  3. アビジン バッファー 1,000 rpm で 30 秒続く、500 rpm で 5 秒間スピン塗布装置を使用してスピン コーティング 200 μ l アビジンと coverslips のコート。Coverslips 乾燥させる、室温で 15 分間を、インキュベートします。
  4. 蛋白質のサンプルの coverslips を準備します。
    1. 5 mM HEPES NaOH ph 7.2 (3.5) から蛋白質のサンプル 100 倍に希釈します。
    2. (ステップ 4.3) からアビジン coverslip の中心に表面の希釈サンプルの場所 100 μ L。
    3. 暗闇のなか 15 分間室温でインキュベートします。
  5. 肯定的な制御を準備します。
    1. 場所 100 μ L 10 ng/mL の精製 (ステップ 4.3) から 5 mM HEPES NaOH pH 7.2 アビディンのセンターでコーティングされた coverslip で蛍光ビオチンです。
    2. 暗闇のなか 15 分間室温でインキュベートします。
      注意: この肯定的な制御 coverslip 提供アビジンの密度バインディング スポット、LO を計算するものです。
  6. ネガティブ コントロールを準備します。
    1. スピンコート、プラズマ洗浄を 5 mM HEPES NaOH と 2 mg/mL BSA (アビジン) なしの 200 μ l coverslip。
    2. 乾燥するために室温で 15 分間インキュベートします。
    3. 5 mM HEPES NaOH ph 7.2 10 ng/mL 精製蛍光ビオチン 100 μ L を追加します。
    4. 暗闇のなか 15 分間室温でインキュベートします。
      注: このネガティブ コントロール coverslip 蛍光ビオチンにアビジンなし coverslip の非特異的結合の量を提供します。
  7. ピペットの先端とカバーガラスの真ん中をタッチしないようにカバーガラスの端で 200 μ L の純水で各 coverslip をすすいでください。この洗浄を 3 回繰り返します。
    注: 上、水を吸引後水必要がありますすぐに戻され完全に乾くことを防ぐために coverslip。
  8. 空気プラズマ coverslips ステップ 4.2 のように同じ数を公開します。
  9. 乾燥を防ぐためのステップ 4.7 からサンプル バインド coverslip のきれいにされた coverslip を配置します。

5. 単一分子蛍光顕微鏡による観察

  1. 広視野またはエバネッ セント フィールド蛍光顕微鏡を起動します。
    注意: 直接または散乱レーザー放射は目が発生したり、皮膚障害。適切な保護メガネを着用し、レーザー光路を保護します。
    注: 顕微鏡のセットアップ私たちの以前の文書16を参照してください。簡単に言えば、ハイパワー 488 nm レーザー励起、高開口数の対物レンズと高感度カメラ搭載ワイド フィールドまたはエバネッ セント フィールド蛍光顕微鏡は、この測定に使用できます。さらに、自動測定、コンピューター制御 XY 並進サンプル ステージ、レーザー励起の機械的なシャッター、オート フォーカスのシステムをインストールする推奨。
  2. 顕微鏡、coverslip を設定し、フォーカスを見つけます。
  3. 少なくとも 100 のイメージを取得するタイル スキャンを実行します。
    注: レーザー照射は、退色を最小限に抑えるため、カメラで画像を記録するときだけサンプルにさらされる機械式シャッターの制御する必要があります。多くのサンプルがある場合自動測定顕微鏡デバイスを制御するコンピュータ プログラムを使用をお勧めします。60 倍対物レンズを使用する場合、各画像は通常 100-500 単一分子スポットを含まれます。

6. 画像解析と情報抽出

  1. イメージにレーザー照射パターンのムラがある場合は、イメージの18はそれを修正する処理を実行します。
    1. 設定ステップ 5.3 と同じカメラを使用して均一に広がり色素で構成される coverslip のサンプルを測定することにより、参照イメージを取得します。
    2. オフセット イメージを取得するには、同じカメラ設定を使用していないレーザー励起による測定します。
    3. オフセット イメージの値を持つすべてのサンプル画像とその参照画像の各ピクセル値を減算します。
    4. 控除参照イメージの値で減算サンプル画像の画素の値を分割します。
  2. 正しく取得した画像を収集し、画像の背景を削除します。
    1. 手動で大きな蛍光凝集体を含む画像を削除します。
    2. 画像の背景を削除するには、ローリング ボール法19 ImageJ20を使用して 50 ピクセルの球の半径を適用します。
    3. ImageJ を用いた画像のぼやけを減算することによって画像をシャープ (シャープ イメージ関数)。
  3. 検索して画像の単一分子スポットを分析します。
    1. 円しきい値アルゴリズム21 ImageJ を用いた単一分子のスポットを識別します。
    2. スポット ImageJ (ROI マネージャー) を使用して蛋白質の集計を除外するよりも 20 ピクセル カメラやスポットの暗騒音を除外するよりも小さい 2 つのピクセルをフィルター処理します。
    3. 各画像のスポットの数をカウントします。修正された画像 (6.1.4 ステップ)、分析照明を使用して合計すべてのスポットのピクセル内強度 ImageJ を用いたします。
  4. 次の数式を使用してラベリング占有 (LO) を計算します。
    LO = (サンプル内のカウント数/肯定的な制御のカウント数) x 100
  5. 単一のタンパク質分子 (n̄色素) にバインドされている蛍光色素の数の平均値を計算します。
    1. すべてのスポットの強度のヒストグラムを分析します。
      メモ: ヒストグラムは通常いくつかのピークを持って、すべてのピークはタンパク質と結合する色素分子の個数が異なるを表します。まず、ヒストグラムの 2 番目と 3 番目のピークがそれぞれ 1、2、3 の分子に対応します。
    2. ヒストグラムから平均強度を計算します。またガウスのフィットを適用することによって最初のピークのピーク強度を計算します。
    3. N̄色素を計算する、ピーク強度と平均強度を割る。

結果

図 4は、正と負のコントロールと同様に、HeLa 細胞の lysate からの蛋白質の分子量の異なる分数の raw 画像データを表します。蛋白質のサンプルとポジティブの両方は、画像ごとの 100-500 の展示スポットを制御、ネガティブ コントロールはどれもまたは coverslip の表面に十分に染料の非特異的結合が阻害するようにプロトコルを示すいくつかのス?...

ディスカッション

本稿では、SDS-PAGE (ステップ 3) を分離した後の分類された蛋白質種のセルのラベルの均質性を定量化するためのプロトコルについて説明します。分離法は、分離と23特別な装置を必要としながら高解像度の細胞蛋白質の分別を許可する液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動などの他の方法で置き換えることが。現在のプロトコルの NHS エステルを使用してラベリン?...

開示事項

著者宣言次競合金融利益のため: 理研が SL の共同発明者として名前を保とこれらの結果を特許出願を提出します。

謝辞

著者らは、実験の支援やアドバイスを大野雅恵と西村和哉をありがとうございます。この作品は、さきがけ (JPMJPR15F7)、日本科学技術振興機構、若い科学者 (A) (24687022)、挑戦的萌芽研究 (26650055)、革新的な領域 (23115005) 会科学研究費補助金に支えられ医療・創薬研究の推進学と武田科学財団持田記念財団からの補助金によって。S. l. は、理化学研究所国際プログラムに関連付ける (IPA) プログラムからのサポートを認めています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
22x22x0.15 mm coverslipVWR470019-004
488 nm Argon laserCoherentInnova 70C
488 nm dichroic mirrorSemrockFF495-Di03
488 nm emission filterSemrockFF02-520/28
560 nm dichroic filterSemrockDi02-R561
560 nm emission filterSemrockFF02-617/73
560 nm fiber laserMBP CommunicationsF-04306-2
60x oil immersion lensOlympusPLAPON 60x
AvidinNacalai-tesque03553-64
Biotin-PEG-amineThermo Scientific21346
Biotinylated Alexa Fluor 488Nanocs
BorateNacalai-tesque
BSASigma-AldrichA9547
CHAPSDojindoC008-10
Cy3 NHS-ester dyeGE HealthcarePA13101
Dialyzer  - D-tube, 6-8 kDaMerck Millipore71507-M
DMEMSigma-Aldrich
DTTNacalai-tesque14112-94
EDCNacalai-tesque
EMCCD cameraAndorIiXon 897
Epi fluorescence microscopeOlympusIX81
Gel viewerGE HealthcareImageQuant LAS 4000
Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mixGibco
Plasma cleanerDiener Electronic
SDSWakoNC0792960
Size purification column 10KMerck MilliporeUFC5010
Tween 20Sigma-AldrichP9416

参考文献

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