Quantificazione di tutto il proteoma di etichettatura omogeneità a livello di singola molecola

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo per valutare l'omogeneità d'etichettatura per ogni specie di proteine in un campione di proteina complessa a livello di singola molecola.

Abstract

Proteomi cellulari sono spesso caratterizzati utilizzando dosaggi di elettroforesi, dove tutte le specie delle proteine nelle cellule non specifico sono marcate con un colorante fluorescente e sono individuate da una cellula fotoelettrica dopo la loro separazione. Formazione immagine di fluorescenza di singola molecola può fornire rilevamento ultrasensibile della proteina con la sua capacità per la visualizzazione di singole molecole fluorescenti. Tuttavia, l'applicazione di questo potente metodo di imaging a saggi di elettroforesi è ostacolata dalla mancanza di modi per caratterizzare l'omogeneità dell'etichettatura fluorescente di ogni specie di proteine attraverso il proteoma. Qui, abbiamo sviluppato un metodo per valutare l'omogeneità d'etichettatura attraverso il proteoma basato su un'analisi di formazione immagine di fluorescenza singola molecola. Nella nostra misura utilizzando un campione di cellule HeLa, la proporzione di proteine etichettate con almeno un colorante, che abbiamo chiamato 'etichettatura occupazione' (LO), è stato determinato per gamma dal 50% al 90%, sostenere l'elevato potenziale dell'applicazione di imaging di singola molecola di analisi del proteoma sensibile e precisa.

Introduzione

Analisi del proteoma, che mira a quantificare l'intero set di molecole di proteina espressa nella cella, è un valido approccio negli attuali studi biologici e medicinali. Questa analisi si basa comunemente sulla spettrometria di massa, che individua le specie di proteine basato su spettri generati attraverso proteine ionizzazione^1,2,3. Un metodo alternativo per analisi del proteoma è l'elettroforesi, tra cui l'elettroforesi del gel di poliacrilammide (PAGE), elettroforesi capillare ed elettroforesi bidimensionale (2D). Questo metodo si basa sull'etichettatura fluorescente non specifici di tutte le molecole di proteina in cellule analizzate, seguite da separazione elettroforetica e la individuazione e la quantificazione di ogni specie di proteina. Per ottenere il contrassegno richiesta non specifico proteina, una strategia è quella di utilizzare tinture fluorescenti che possono legarsi a proteine tramite interazioni elettrostatiche e idrofobiche, come blu di Coomassie e Sypro Ruby^4,5,6 . Una strategia alternativa consiste nell'utilizzare etichettatura covalente con coloranti contenenti N-Idrossisuccinimide (NHS) estere o maleimide, che può legare covalentemente alle proteine attraverso comuni residui come primarie ammine e tioli, rispettivamente^{7, 8}.

Nel frattempo, la sensibilità di rilevazione della fluorescenza è ideale per l'analisi di basso-abbondanza proteine e un piccolo numero di cellule. Formazione immagine di fluorescenza di singola molecola è uno dei metodi più sensibili che permette la rilevazione dei singoli coloranti fluorescenti e con etichetta delle proteine in vitro e in vivo^{9,10,11,12, 13,14,15}. Applicazione di questo metodo di imaging per analisi del proteoma basati su elettroforesi è previsto per consentire analisi altamente sensibili e quantitative contando singole proteine fluorescente etichettati. Tuttavia, rimane poco chiaro se etichettatura con coloranti fluorescenti è abbastanza omogenea in tutte le molecole di proteina, e come questa omogeneità è influenzata da specie differenti della proteina (Figura 1). Rilievi relativi alla soluzione semplice massa possono essere utilizzati per ottenere un rapporto molare di coloranti fluorescenti per proteine chiamate 'efficienza di accoppiamento'⁸ o 'etichettatura efficienza', ma questa proprietà non fornisce informazioni sull'omogeneità di etichettatura tra molecole di proteina.

Qui, descriviamo il protocollo per un'analisi per indagare l'omogeneità d'etichettatura per tutte le specie di proteine nella cellula (Figura 2)¹⁶. I due passaggi chiavi di questo test sono imaging e purificazione della proteina. Nel primo passaggio, tutte le proteine nelle cellule fluorescente sono etichettate e biotinilato, quindi estratta separatamente utilizzando l'elettroforesi del gel seguita da electroelution. Nel secondo passaggio, proprietà di fluorescenza di molecole singole proteine nei campioni estratti vengono valutate in base su formazione immagine singola molecola. Da questi dati, parametri importanti per l'analisi di conteggio, come la percentuale di proteine etichettate con un'almeno una tingono, che noi chiamiamo etichettatura occupazione (LO)¹⁶, e il numero medio di coloranti fluorescenti legati ad una molecola singola proteina (n̄ _colorante), può essere caratterizzato. Nel protocollo, una procedura ottimizzata per l'etichettatura del proteoma delle cellule HeLa con tintura di cianina 3 (Cy3) a base di estere NHS è presentata come esempio e può essere modificata con altre procedure di etichettatura secondo obiettivi di ricerca desiderato.

Protocollo

1. cella preparazione

1. Coltivare le cellule HeLa in un piatto di 10 cm a 37 ° C inferiore al 5% di CO₂ in Dulbecco s modified mezzo di Eagle contenente 10% siero bovino fetale.
2. Raccogliere le cellule in crescita esponenziale una volta che hanno raggiunto il 70% confluency, seguendo le istruzioni di ATCC¹⁷.
   1. Sciacquare le cellule con 5 mL di 1x tamponato fosfato salino (PBS) (pH 7.4). Rimuovere PBS.
   2. Aggiungere 1 mL di acido di 0,1% tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA). Incubare per 5 minuti a 37 ° C.
   3. Monitorare la progressione della dissociazione delle cellule da microscopia.
   4. Una volta che le cellule diventano rotonde e sono staccate dal piatto, aggiungere 4 mL di terreno di coltura e rompere l'agglomerato di cellule pipettando.
   5. Contare il numero di celle utilizzando un contatore di cellule.
   6. Centrifugare a 150 x g per 10 min in una provetta da centrifuga. Rimuovere il mezzo e risospendere il pellet cellulare con 5 mL di 1X PBS (pH 7.4).
   7. Ripetere il punto 1.2.6. Risospendere le cellule in 1X PBS (pH 7.4) ad una concentrazione finale di 10⁶ cellule/mL utilizzando il numero di conteggio nel passaggio 1.2.5.
      Nota: La sospensione delle cellule può essere aliquotati e conservati a-80 ° C per diversi mesi. Ripetizione di un ciclo di congelamento/scongelamento dovrebbe essere evitato.

2. cellula Lisi e Contrassegno fluorescente

1. Fare 10 mL di tampone di lisi (borato 0,1 M, 1% sodio dodecil solfato (SDS) e 1% Tween 20). Regolare il pH 12 utilizzando 2 M NaOH.
   Attenzione: NaOH concentrato è corrosivo. Indossare occhiali e guanti adeguati durante la preparazione di questa soluzione.
   Nota: Il buffer di Lisi possono essere memorizzati fino a una settimana a temperatura ambiente.
2. Mix 100 μL di lisante buffer con 1 μL di 1m ditiotreitolo (DTT) e 4 μL di 50% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS).
3. Mescolare 1 μL di coltura delle cellule (circa 1.000 cellule) con il buffer di lisante mista dal punto 2.2. Omogeneizzare la soluzione pipettando lentamente per evitare bolle. Incubare al buio a temperatura ambiente per 5 minuti con agitazione delicata. Ri-omogeneizzare la soluzione pipettando lentamente.
4. Aggiungere 1 μL di 2 μg/mL tintura Cy3 NHS-estere. Omogeneizzare la soluzione pipettando lentamente per evitare bolle. Incubare per 5 minuti al buio a temperatura ambiente con agitazione delicata.
   Nota: Il pH elevato di questo buffer provoca la neutralizzazione dei residui di lisina in proteine, portando a una maggiore reattività.
5. Ripetere l'aggiunta di 1 μL di 2 μg/mL tintura Cy3 NHS-estere. Omogeneizzare la soluzione pipettando lentamente per evitare bolle. Incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente con agitazione delicata.
   Nota: Questo ripetuto aggiunta di tintura di NHS-estere può aumentare l'efficienza d'etichettatura perché alcuni dei coloranti Cy3 NHS-estere è idrolizzato e disattivato dal alto pH del tampone di reazione.
6. Regolare il pH 7.2 aggiungendo 100 μL di 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES)-NaOH a pH 7,2 per placare la reazione. Omogeneizzare la soluzione pipettando lentamente per evitare bolle.
7. Aggiungere 20 μL di 19 mg/mL (polietilenglicole (PEG)) biotina-₂-ammina e 5 μL di 20 mg/mL 1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimide (EDC). Omogeneizzare la soluzione pipettando lentamente per evitare bolle. Incubare per 1 h al buio a temperatura ambiente con agitazione delicata.
   Nota: Questo passaggio biotinylation è necessario fissare le molecole di proteina su un vetrino coprioggetti microscopio ad una densità fissa e con nessun pregiudizio per specie proteiche.
8. Rimuovere i reagenti d'etichettatura non reagiti e concentrare il campione utilizzando una colonna di ultrafiltrazione con 10 cut-off di kDa, seguendo le istruzioni del produttore.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Il campione può essere conservato a-80 ° C per diverse settimane.

3. Proteome separazione e recupero

1. Aggiungere 4 x tampone campione SDS (200 mM Tris-HCl pH 6.8, SDS 4%, 4% glicerolo e 0,4% bromofenolo).
   Nota: Per evitare danni di tintura, il campione della proteina non deve essere riscaldato come fatto in standard SDS-PAGE e dovrebbe essere conservato a temperatura ambiente.
2. Eseguire standard SDS-PAGE per il campione della proteina e una scala molecolare, utilizzando 20% gel dell'acrilamide. Migrare il campione nel gel a una tensione costante (160 V) fino a quando la migrazione anteriore appena esce il gel.
3. Immagine del gel per identificare la posizione delle bande proteiche (Figura 3).
4. Tagliare porzioni gel comprende le frazioni di proteine di interesse con una lama affilata, in base alle posizioni di banda. Frazionamento a 16, 23, 55 e 120 kDa picchi, che a 19 – 25, 25 – 32, 32 – 42, 42 – 54, 54 – 69, 69-97, 97 – 136 e 136 – 226 kDa regioni sono mostrate in Figura 3.
5. Estrarre le proteine usando un dialyzer di electroelution con un diametro dei pori di 6 – 8 kDa, seguendo le istruzioni del produttore.
   Nota: Il campione estratto può essere conservato a-80 ° C per diverse settimane.

4. preparazione del vetrino coprioggetto di microscopio

1. Preparare 200 μL di tampone avidina (5 mM HEPES-NaOH pH 7.2, 10 avidina ng/mL e 2 mg/mL albumina di siero bovino (BSA)) per ogni campione.
2. Preparare vetrini coprioggetto di 22 x 22 mm e 0,15 mm di spessore. Esporre i coprioggetti per aria plasma usando un plasma cleaner per 1 min per pulire e attivare le loro superfici.
3. Rivestire i coprioggetti con avidina di rivestimento per rotazione 200 μL di tampone di avidina usando una macchina a rotazione per 5 secondi a 500 giri/min, seguito da 30 secondi a 1.000 giri/min. Incubare i vetrini coprioggetto per 15 min a temperatura ambiente per farli asciugare.
4. Preparare vetrini coprioggetti per il campione della proteina.
   1. Diluire il campione di proteina (da 3,5) 100 volte in 5 mM HEPES-NaOH a pH 7,2.
   2. Posto 100 μL del campione diluito sulla superficie al centro del coprivetrino rivestite con avidina (dal punto 4.3).
   3. Incubare al buio per 15 min a temperatura ambiente.
5. Preparare il controllo positivo.
   1. Posto 100 μL di 10 ng/mL purificato fluorescente biotina in 5 mM HEPES-NaOH pH 7.2 al centro dell'avidina rivestito vetrino coprioggetti (dal punto 4.3).
   2. Incubare al buio per 15 min a temperatura ambiente.
      Nota: Questo controllo positivo vetrino coprioggetti fornisce la densità di avidina macchie di associazione, che viene utilizzato per calcolare il LO.
6. Preparare il controllo negativo.
   1. Spin-cappotto plasma pulito coprivetrino con 200 μL di 5 mM HEPES-NaOH e 2 mg/mL BSA (senza avidina).
   2. Incubare per 15 min a temperatura ambiente per asciugare.
   3. Aggiungere 100 μL di 10 ng/mL purificato fluorescente biotina in 5 mM HEPES-NaOH a pH 7,2.
   4. Incubare al buio per 15 min a temperatura ambiente.
      Nota: Questo controllo negativo vetrino coprioggetti fornisce la quantità di legame non specifico di biotina fluorescente per il coprioggetto senza avidina.
7. Sciacquare ogni vetrino coprioggetti con 200 μL di acqua distillata pipettando ai bordi del coprivetrino per non toccare la metà del coprivetrino con la punta. Ripetere questo lavaggio tre volte.
   Nota: Dopo avere aspirato acqua sul vetrino coprioggetto, acqua dovrebbe essere immediatamente reimmessi sul coprioggetto per evitare che secchino completamente.
8. Esporre il plasma ad aria per lo stesso numero di vetrini coprioggetti come descritto al punto 4.2.
9. Posizionare il vetrino coprioggetti puliti il coprivetrino associato a campione da passo 4.7 per evitare la disidratazione.

5. osservazione con microscopia di fluorescenza di singola molecola

1. Avviare un microscopio a fluorescenza Campo grandangolari o evanescente.
   Attenzione: Diretta o radiazione laser sparse può causare occhio o danneggiare la pelle. Occhiali di protezione adatti e scudo il percorso della luce laser.
   Nota: Per l'installazione di microscopio, fare riferimento alla nostra precedente pubblicazione¹⁶. Brevemente, un microscopio a fluorescenza grandangolari o evanescente campo dotato di un'eccitazione di laser ad alta potenza 488 nm, un obiettivo di apertura numerica elevata e una telecamera ad alta sensibilità può essere utilizzato per questa misura. Inoltre, per una misurazione automatica, un palco di campione traslazionale XY controllati dal computer, meccanico persiane per eccitazioni laser e un sistema di messa a fuoco automatica sono raccomandati per essere installato.
2. Impostare il coprioggetto sul microscopio e trovare la messa a fuoco.
3. Eseguire una scansione di mattonelle per ottenere almeno 100 immagini.
   Nota: L'illuminazione laser dovrebbe essere controllata con gli otturatori meccanici per essere esposti al campione solo quando si registrano immagini con la fotocamera, per ridurre al minimo photobleaching. Se ci sono molti campioni, usando un programma per computer per controllare i dispositivi di microscopio di misura automatici è raccomandato. Ogni immagine in genere include 100 – 500 punti di singola molecola quando si utilizza un obiettivo 60x.

6. analisi e l'estrazione di informazioni di immagine

1. Se l'immagine ha irregolarità dovuta al modello di illuminazione laser, effettuare elaborazioni per correggerlo¹⁸.
   1. Acquisire un'immagine di riferimento misurando con un vetrino coprioggetti campione composto da coloranti uniformemente diffuso usando una fotocamera impostando lo stesso come descritto al punto 5.3.
   2. Acquisire un'immagine offset misurando con nessuna eccitazione laser utilizzando la stessa impostazione della fotocamera.
   3. Sottrarre ogni valore di pixel in ogni immagine di esempio e l'immagine di riferimento con il valore dell'offset immagine.
   4. Dividere ogni valore di pixel nelle immagini di esempio sottratto dal valore nell'immagine di riferimento sottratto.
2. Raccogliere immagini acquisite correttamente e rimuovere lo sfondo dell'immagine.
   1. Rimuovere immagini contenenti grandi aggregati fluorescenti manualmente.
   2. Rimuovere lo sfondo dell'immagine applicando l' algoritmo di sfera¹⁹ con un raggio della sfera di 50 pixel usando ImageJ²⁰.
   3. Affilare le immagini sottraendo immagini sfocate utilizzando ImageJ (nitidezza immagine funzione).
3. Trovare e analizzare i punti di singola molecola in immagini.
   1. Individuare i punti di singola molecola con l' algoritmo soglia di Yen²¹ usando ImageJ.
   2. Filtrare i punti con meno di due pixel per escludere rumori oscuri della telecamera e macchie più di 20 pixel per escludere le aggregazioni delle proteine usando ImageJ (gestore di ROI).
   3. Contare il numero di punti in ogni immagine. Utilizzando l'illuminazione analizzare immagini corrette (punto 6.1.4), totale intensità all'interno di pixel per ogni punto usando ImageJ.
4. Calcolare l'occupazione d'etichettatura (LO) utilizzando la seguente formula:
   LO = (numero di conteggi nel campione / numero di conteggi nel controllo positivo) x 100
5. Calcolare il numero medio di coloranti fluorescenti legati ad una molecola singola proteina (n̄_tintura).
   1. Analizzare un istogramma dell'intensità di ogni spot.
      Nota: L'istogramma ha solitamente parecchi picchi, e ogni picco rappresenta un diverso numero di molecole di colorante legata a una proteina. Il primo, secondo e terzo picco nell'istogramma corrisponde alle molecole di 1, 2 e 3, rispettivamente.
   2. Calcolare l'intensità media dall'istogramma. Inoltre è possibile calcolare l'intensità di picco del primo picco applicando un raccordo gaussiano.
   3. N̄_colorante viene calcolato dividendo l'intensità media con l'intensità di picco.

Risultati

Figura 4 rappresenta i dati di immagine raw per frazioni di diverso peso molecolare delle proteine da lysate delle cellule HeLa, come pure il controllo positivo e negativo. Mentre il campione della proteina e il positivo controllo esposizione 100 – 500 punti per ogni immagine, viene visualizzato il controllo negativo nessuno o pochi punti, mostrando che il protocollo sufficientemente inibisce il legame non specifico di coloranti alla superficie del vetrino ...

Discussione

Questo articolo descrive un protocollo per quantificare l'omogeneità d'etichettatura di ogni specie di proteina marcata nelle cellule dopo la separazione con SDS-PAGE (passaggio 3). Il metodo di separazione possa essere sostituito con altri metodi come la cromatografia liquida o elettroforesi capillare, che permettono la separazione e frazionamento delle proteine cellulari con alta risoluzione, mentre che richiedono attrezzature speciali²³. Il metodo d'etichettatura utilizzando NHS-estere nel pro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
22x22x0.15 mm coverslip	VWR	470019-004
488 nm Argon laser	Coherent	Innova 70C
488 nm dichroic mirror	Semrock	FF495-Di03
488 nm emission filter	Semrock	FF02-520/28
560 nm dichroic filter	Semrock	Di02-R561
560 nm emission filter	Semrock	FF02-617/73
560 nm fiber laser	MBP Communications	F-04306-2
60x oil immersion lens	Olympus	PLAPON 60x
Avidin	Nacalai-tesque	03553-64
Biotin-PEG-amine	Thermo Scientific	21346
Biotinylated Alexa Fluor 488	Nanocs
Borate	Nacalai-tesque
BSA	Sigma-Aldrich	A9547
CHAPS	Dojindo	C008-10
Cy3 NHS-ester dye	GE Healthcare	PA13101
Dialyzer  - D-tube, 6-8 kDa	Merck Millipore	71507-M
DMEM	Sigma-Aldrich
DTT	Nacalai-tesque	14112-94
EDC	Nacalai-tesque
EMCCD camera	Andor	IiXon 897
Epi fluorescence microscope	Olympus	IX81
Gel viewer	GE Healthcare	ImageQuant LAS 4000
Penicillin, streptomycine and Amphoterecin mix	Gibco
Plasma cleaner	Diener Electronic
SDS	Wako	NC0792960
Size purification column 10K	Merck Millipore	UFC5010
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416